JPS61104786A - プルラナ−ゼの生産法 - Google Patents
プルラナ−ゼの生産法Info
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- JPS61104786A JPS61104786A JP22544284A JP22544284A JPS61104786A JP S61104786 A JPS61104786 A JP S61104786A JP 22544284 A JP22544284 A JP 22544284A JP 22544284 A JP22544284 A JP 22544284A JP S61104786 A JPS61104786 A JP S61104786A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、広い最適作用ｐＨ域をもつ新規なプルラナー
ゼの生産改良方法に関するものである。
ゼの生産改良方法に関するものである。
プルラナーゼは、Ｒｅｎｄｅｒらにより、プルラリャ・
プルランの生産する多糖類プルランを加水分解する酵素
として、エーロバクター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に、はじめて見出され
た（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、
３６．３０９（１９５９）、特公昭４６−７５５９な
ど〕。その後、この酵素は、アミロペクチンのα−１，
６−グルコシド結合を加水分解し、β−アミラーゼとの
併用により、デンプンからマルトースを収量よく生産で
きることから注目され、現在までに同種の酵素が種々の
微生物より生産されることが知られている。この種の酵
素はプルラナーゼ、イソアミラーゼなど種々の名称で呼
ばれているが、総称してα−１，６−グルコシダーゼと
言われている。たとえば、エラセリシア・インターメデ
ィアのイソアミラーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉａ、 Ａｐｐｌｉｅｄ、 Ｎ１ｃｒｏｂｉ
ｏ１．、１５．４９２（１９６７））、ストレプトコッ
カス・ミティスのプルラナーゼ（Ｓｔ、ｒｅｐｔ、ｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｍ１ｔｉｓ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、
１０８．３３゜（１９６８）） 、ストレプトマイセス
・ｓｐ、 Ｎ（１２８のイソアミラーゼ（Ｊ、 Ｆｅｒ
ｏ＋ｅｎｔ、 Ｔｅｃｈ、、 ４９．５５２（１９７１
））、バシルス属のプルラナーゼ（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｃｈｅｗ、。
プルランの生産する多糖類プルランを加水分解する酵素
として、エーロバクター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に、はじめて見出され
た（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、
３６．３０９（１９５９）、特公昭４６−７５５９な
ど〕。その後、この酵素は、アミロペクチンのα−１，
６−グルコシド結合を加水分解し、β−アミラーゼとの
併用により、デンプンからマルトースを収量よく生産で
きることから注目され、現在までに同種の酵素が種々の
微生物より生産されることが知られている。この種の酵
素はプルラナーゼ、イソアミラーゼなど種々の名称で呼
ばれているが、総称してα−１，６−グルコシダーゼと
言われている。たとえば、エラセリシア・インターメデ
ィアのイソアミラーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉａ、 Ａｐｐｌｉｅｄ、 Ｎ１ｃｒｏｂｉ
ｏ１．、１５．４９２（１９６７））、ストレプトコッ
カス・ミティスのプルラナーゼ（Ｓｔ、ｒｅｐｔ、ｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｍ１ｔｉｓ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、
１０８．３３゜（１９６８）） 、ストレプトマイセス
・ｓｐ、 Ｎ（１２８のイソアミラーゼ（Ｊ、 Ｆｅｒ
ｏ＋ｅｎｔ、 Ｔｅｃｈ、、 ４９．５５２（１９７１
））、バシルス属のプルラナーゼ（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｃｈｅｗ、。
４０、１５１５（１９７６）、５ｅａｒｃｈ、 ３４．
３４０（１９８２）など〕などがある。
３４０（１９８２）など〕などがある。
最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−１，６
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースの製造や
、デンプンからマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
スなどのマルトオリゴ糖の生産においても、これら糖の
増収に有効であることが認められている。
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコースの製造や
、デンプンからマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
スなどのマルトオリゴ糖の生産においても、これら糖の
増収に有効であることが認められている。
しかるに、従来、知られているプルラナーゼやイソアミ
ラーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼは、一般には
熱安定性に劣り（多くは最適温度４５〜５０℃）、また
、作用ｐＨ範囲が狭いため、グルコアミラーゼのように
酸性側で作用し、熱安定性に優れた酵素（最適作用ｐＨ
４，５付近、最適作用温度６０℃）や、中性〜弱アルカ
リ性に最適作用ｐＨをもつ微生物起源のマルトオリゴ糖
生成酵素の、全てのアミラーゼに対して使用するには技
術的および経済的に問題があった。
ラーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼは、一般には
熱安定性に劣り（多くは最適温度４５〜５０℃）、また
、作用ｐＨ範囲が狭いため、グルコアミラーゼのように
酸性側で作用し、熱安定性に優れた酵素（最適作用ｐＨ
４，５付近、最適作用温度６０℃）や、中性〜弱アルカ
リ性に最適作用ｐＨをもつ微生物起源のマルトオリゴ糖
生成酵素の、全てのアミラーゼに対して使用するには技
術的および経済的に問題があった。
そこで、本発明者らは、グルコアミラーゼ、β−アミラ
ーゼやマルトトリオース以上のマルトオリゴ糖を生成す
るアミラーゼの、いずれのアミラーゼとも併用できる。
ーゼやマルトトリオース以上のマルトオリゴ糖を生成す
るアミラーゼの、いずれのアミラーゼとも併用できる。
最適作用ｐＨ範囲が広く、且つ熱安定性に優れたα−１
，６−グルコシダーゼを求めて、広く自然界から微生物
の検索を行ってきた。
，６−グルコシダーゼを求めて、広く自然界から微生物
の検索を行ってきた。
結果、土壌中より分離し、クレブシラの生産するプルラ
ナーゼが新規な耐熱性プルラナーゼであることを認めた
。そして、本酵素を工業的に生産すべく、生産力価の向
上方法について鋭意研究を行ってきた結果、本酵素の生
産菌を窒素源とデンプンまたはアミロペクチンを含む培
地で培養してプルラナーゼを生産するに際し、乳糖を添
加すると、プルラナーゼの生産量が顕著に増大できるこ
とを認めた０本発明はこの知見にもとずいてなされたも
のである。
ナーゼが新規な耐熱性プルラナーゼであることを認めた
。そして、本酵素を工業的に生産すべく、生産力価の向
上方法について鋭意研究を行ってきた結果、本酵素の生
産菌を窒素源とデンプンまたはアミロペクチンを含む培
地で培養してプルラナーゼを生産するに際し、乳糖を添
加すると、プルラナーゼの生産量が顕著に増大できるこ
とを認めた０本発明はこの知見にもとずいてなされたも
のである。
Ｃ目 的〕
本発明の目的は、プルラナーゼの改良生産法を提供する
ことを目的とする。
ことを目的とする。
本発明は、クレブシラ・ニューモニアに屈するプルラナ
ーゼ生産菌を、窒素源とデンプンまたはアミロペクチン
を含む培地で培養してプルラナーゼを生産するに際し、
乳糖を存在させることを特徴とするプルラナーゼの生産
方法を提供するものである。
ーゼ生産菌を、窒素源とデンプンまたはアミロペクチン
を含む培地で培養してプルラナーゼを生産するに際し、
乳糖を存在させることを特徴とするプルラナーゼの生産
方法を提供するものである。
以下に１本発明の内容を更に具体的に説明する。
本発明において例示菌として使用される、クレブシラ・
ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｒｍｏ
ｎｉａｅ）は、Ｂｅｇｅｙの細菌同定書（ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 Ｔｈｅ Ｖｉｌｌｉａ
ｍｓ ＆ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ、）において、以前はエ
ーロバクター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）と区別され本発明以前に公知であ
る。たとえば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８゜３３４、７９（
１９６１）、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ■、５５５（１９６６）、特公昭４６−７５５９、
Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｔａ、。
ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｒｍｏ
ｎｉａｅ）は、Ｂｅｇｅｙの細菌同定書（ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 Ｔｈｅ Ｖｉｌｌｉａ
ｍｓ ＆ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ、）において、以前はエ
ーロバクター・エーロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）と区別され本発明以前に公知であ
る。たとえば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８゜３３４、７９（
１９６１）、 Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ■、５５５（１９６６）、特公昭４６−７５５９、
Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｔａ、。
扛、 ２８２１（１９７３）などには、エーロバクター
・二一ロゲネスの生産するプルラナーゼの記載があり、
また、特公昭５１−５０７２、特公昭５８−２２１９７
などに７ は、クレブシラ・ニューモニアなどクレブ
シラ属の生産するα−１，６−グルコシダーゼについて
の記載がある。しかし、これら文献や特許公報に記載さ
れている酵素は、いずれも熱安定性に劣っている。すな
わち、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８．３３４．７９（１９６
１）とＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ■、
５５５（１９６６）にはエーロバクター・エーロゲネ
スのプルラナーゼの最適作 ゛用温度は４７．
５℃とあり、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｎ、、
３７゜２８２１（１９７３）には、同じくエーロバク
ター・ニー〇ゲネスのプルラナーゼの最適作用温度は５
０℃であると記載されている。そして、特公昭５１−５
０７２には、クレブシラ・ニューモニアの最適作用温度
は４５〜５０℃にあり、基質の不在下では、５０℃で１
時ルコシダーゼの最適用温度は４５〜５０℃程度である
と考えられるのに対し、本発明のプルラナーゼの最適作
用温度は６０〜６３℃の高温側にあり、基質の不在下で
５０℃で１時間加熱しても殆んど活性の低下は認められ
ない（第１＠）など、熱安定性に優れた酵素である。本
酵素は基質の存在下では当然熱安定性化され、またカル
シウムなどの金属塩の存注下でも熱安定化されるので、
実用的な反応条件においても、６０℃の温度で反応を行
うことができる。
・二一ロゲネスの生産するプルラナーゼの記載があり、
また、特公昭５１−５０７２、特公昭５８−２２１９７
などに７ は、クレブシラ・ニューモニアなどクレブ
シラ属の生産するα−１，６−グルコシダーゼについて
の記載がある。しかし、これら文献や特許公報に記載さ
れている酵素は、いずれも熱安定性に劣っている。すな
わち、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８．３３４．７９（１９６
１）とＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ■、
５５５（１９６６）にはエーロバクター・エーロゲネ
スのプルラナーゼの最適作 ゛用温度は４７．
５℃とあり、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｎ、、
３７゜２８２１（１９７３）には、同じくエーロバク
ター・ニー〇ゲネスのプルラナーゼの最適作用温度は５
０℃であると記載されている。そして、特公昭５１−５
０７２には、クレブシラ・ニューモニアの最適作用温度
は４５〜５０℃にあり、基質の不在下では、５０℃で１
時ルコシダーゼの最適用温度は４５〜５０℃程度である
と考えられるのに対し、本発明のプルラナーゼの最適作
用温度は６０〜６３℃の高温側にあり、基質の不在下で
５０℃で１時間加熱しても殆んど活性の低下は認められ
ない（第１＠）など、熱安定性に優れた酵素である。本
酵素は基質の存在下では当然熱安定性化され、またカル
シウムなどの金属塩の存注下でも熱安定化されるので、
実用的な反応条件においても、６０℃の温度で反応を行
うことができる。
一方、最適作用ｐｉ（についてみてみると、エーロバク
ター・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラナーゼやα
−１，６−グルコシダーゼの最適作用ｐ）ｌは５．０付
近（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１ｏｇｙ■、
５５５（１９６６）。
ター・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラナーゼやα
−１，６−グルコシダーゼの最適作用ｐ）ｌは５．０付
近（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１ｏｇｙ■、
５５５（１９６６）。
特公昭５１−５０７２など）、または、ｐＨ６付近（Ａ
ｇｒｉｃＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ３７．２８２１（
１９７３））にあり、いずれの場合も、特に、ｐｌ（６
以上においては著しく活性が低下することが知られてい
る。
ｇｒｉｃＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ３７．２８２１（
１９７３））にあり、いずれの場合も、特に、ｐｌ（６
以上においては著しく活性が低下することが知られてい
る。
本発明以前に、比較的熱安定性に優れたα−１，６−グ
ルコシダーゼを生産する微生物として、たとえば、バシ
ルス属のプルラナーゼ（特開昭５７−１７４０８９．５
ａｒｃｈ、 ３４．３４０（１９８２）） 、およびス
トレプトマイセス属のイソアミラーゼ（Ｊ、 Ｆｅｒｍ
ｅｎｔ。
ルコシダーゼを生産する微生物として、たとえば、バシ
ルス属のプルラナーゼ（特開昭５７−１７４０８９．５
ａｒｃｈ、 ３４．３４０（１９８２）） 、およびス
トレプトマイセス属のイソアミラーゼ（Ｊ、 Ｆｅｒｍ
ｅｎｔ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、、 ４９．５５２（１９７１））が知
られている。これらの微生物の生産するプルラナーゼや
イソアミラーゼの最適作用温度は約６０℃にあるが、い
ずれも最適作用ｐＨは５．０にあり、 ｐＨ５以上では
著しく活性が低下する。
られている。これらの微生物の生産するプルラナーゼや
イソアミラーゼの最適作用温度は約６０℃にあるが、い
ずれも最適作用ｐＨは５．０にあり、 ｐＨ５以上では
著しく活性が低下する。
このように、本発明以前に知られていたエーロバクター
属やクレブシラ属の酵素は熱安定性に劣。
属やクレブシラ属の酵素は熱安定性に劣。
す、最適作用温度は５０℃前後にあり、また、最適１冬
作用ＰＩ専５．０または６．０の狭い範囲にある。これ
に対し、本発明により生産されるクレブシラ・ニューモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼは、最適作用ｐＨが約
４．５〜約７．５の極めて広い範囲にあり、最適作用温
度は６０〜６３℃と極めて熱安定性に優れた酵素であり
、従来、知られていたニーロバフタ属やクレブシラ属の
酵素とは違った新規な酵素と認められるものである。
に対し、本発明により生産されるクレブシラ・ニューモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼは、最適作用ｐＨが約
４．５〜約７．５の極めて広い範囲にあり、最適作用温
度は６０〜６３℃と極めて熱安定性に優れた酵素であり
、従来、知られていたニーロバフタ属やクレブシラ属の
酵素とは違った新規な酵素と認められるものである。
以下に、本発明の新規な耐熱性プルラナーゼの酵素的性
質についてより詳細に記載する。
質についてより詳細に記載する。
（１）作用ニブルランのα−１，６−グルコシド結合を
分解してマルトトリオースを生成する。また、澱粉、ア
ミロペリチン、グリコーゲンまたはこれらの派生物のα
−１，６−グルコシド結合を分解する。
分解してマルトトリオースを生成する。また、澱粉、ア
ミロペリチン、グリコーゲンまたはこれらの派生物のα
−１，６−グルコシド結合を分解する。
（２）作用ｐＦｌ範囲及び最適作用ｐＨ： ｐＨ約２．
５〜約１０の極めて広いｐＨ範囲で作用し、最適作用温
度はＰＩ（約４．５〜約７．５の広い範囲に認められた
（２％プルラン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液、トリス緩衝液
およびトリシン緩衝液のもとて５０℃で３０分間反応）
。
５〜約１０の極めて広いｐＨ範囲で作用し、最適作用温
度はＰＩ（約４．５〜約７．５の広い範囲に認められた
（２％プルラン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液、トリス緩衝液
およびトリシン緩衝液のもとて５０℃で３０分間反応）
。
（３）作用温度範囲及び最適作用温度：約７５℃まで作
用し、最適作用温度は約６３℃に認められた（２％プル
ラン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）又は０．０
５Ｎトリス緩衝液（ｐｉ（７，０）のもとて３０分間反
応）。
用し、最適作用温度は約６３℃に認められた（２％プル
ラン、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）又は０．０
５Ｎトリス緩衝液（ｐｉ（７，０）のもとて３０分間反
応）。
（４）熱安定性；酵素水溶液を５０℃、５５℃と６０℃
で加熱処理してのち、残存活性を測定した。その結果、
５０℃では１時間の加熱後も失活は殆んど認められなか
った。、５５℃の加熱では２０分の加熱で約２０％失活
し、１時間の加熱で約６０％失活した。
で加熱処理してのち、残存活性を測定した。その結果、
５０℃では１時間の加熱後も失活は殆んど認められなか
った。、５５℃の加熱では２０分の加熱で約２０％失活
し、１時間の加熱で約６０％失活した。
そして、６０℃の加熱では３０分闇の加熱で約８０％失
活した。
活した。
（５） ｐＨ安定性；ＰＨ約４〜約ｌＯの範囲で安定で
あった（０．１Ｍ酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはトリ
ス緩衝液のもと、室温（２５℃）で３時間放置後、残存
活性を測定した） （６）阻害剤：本酵素はＩＸＩＧ−３ＭのＣｕＳ０４
。
あった（０．１Ｍ酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはトリ
ス緩衝液のもと、室温（２５℃）で３時間放置後、残存
活性を測定した） （６）阻害剤：本酵素はＩＸＩＧ−３ＭのＣｕＳ０４
。
ＨｇＣＱ ２ 、Ｚｎ５Ｏ４，Ｆｅ５０４により、それ
ぞれ約９３％、約８９％、約２９％阻害された。同濃度
のＡｇＮＯ３によっては殆んど阻害されなかった。
ぞれ約９３％、約８９％、約２９％阻害された。同濃度
のＡｇＮＯ３によっては殆んど阻害されなかった。
（７）精製方法；本酵素は培養上澄液から硫安分画（４
０〜７０％飽和）、 ＤＥＡＥ−セファロースカラムク
ロマトグラフィー（ＫＣＱ Ｏ〜０．５Ｍでリニヤ−グ
ラジェント溶出）とセファデックスＧ−２００カラムク
ロマトグラフイーにより、クロマト的、電気泳動的に均
一まで精製することができる。
０〜７０％飽和）、 ＤＥＡＥ−セファロースカラムク
ロマトグラフィー（ＫＣＱ Ｏ〜０．５Ｍでリニヤ−グ
ラジェント溶出）とセファデックスＧ−２００カラムク
ロマトグラフイーにより、クロマト的、電気泳動的に均
一まで精製することができる。
（＆）分子量フセファデツクスＧ−２００ゲル濾過法に
え、水で全量１ｍβとし４０℃で反応させる。この条件
で１時間に１μ電のグルコースに相当する還元力を生成
する酵素量を１単位とした。
え、水で全量１ｍβとし４０℃で反応させる。この条件
で１時間に１μ電のグルコースに相当する還元力を生成
する酵素量を１単位とした。
また１本発明において使用される新規な耐熱性プルラナ
ーゼ生産菌の菌学的性質は下記に示す通りである。
ーゼ生産菌の菌学的性質は下記に示す通りである。
（１）形態的性質；約０．８×約１．３μの桿菌、通常
、単桿菌あるいは２連状に連なり生育する。運動性はな
く、また胞子形成は認められない。
、単桿菌あるいは２連状に連なり生育する。運動性はな
く、また胞子形成は認められない。
（２）培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のある円
形状の集落を形成する。集落の周縁は金縁で、表面隆起
は原状を示す、角状液体培養では、培地全体に混濁を生
成する。
形状の集落を形成する。集落の周縁は金縁で、表面隆起
は原状を示す、角状液体培養では、培地全体に混濁を生
成する。
生育温度； 約５０℃の温度まで生育するが、最適生育
温度は約４３℃。
温度は約４３℃。
生育ｐＨ；ｐＨ約５〜約９の範囲で生育する。最適生育
ｐＨは７近付。
ｐＨは７近付。
ダラム染色； 陰性。
酸素に対する態度； 通性嫌気性。
カタラーゼ： 陽性。
オキシダーゼ； 陰性。
β−ガラクトシダーゼ； 陽性。
硝酸塩の還居； 陽性。
炭水化物の利用７ グルコース、アドニトール。
ムーアラビノース、エクスリン、
イノシトール、マンニトール、
Ｌ−ラムノースなどを利用し酸
を生成する。
クエン酸の利用ジ 陽性。
マロン酸の利用； 陽性。
メチルレッド反応７＃ｉ性。
ｖｐ反応； 陽性。
リジンの脱炭酸； 陽性。
オルニチンの脱炭酸； 陽性。
ウレアーゼ反応； 陽性。
フェニールアラニンから
のフェニルピルビン酸の生成； 陰性。
以上の菌学的性質について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎ
ｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｉ＋１ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙの第８版（Ｔｈｅｗｉｌｌｉａｍｓ
＆ ｖｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ、 １９７４年）を参照し１
本菌をクレブシラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の−菌株と同定当するのが
適当と考えた０本菌は工業技術院微生物工業技術研究所
においてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＦＥＲＮ Ｐ−７３８７として寄託されている。
ｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｉ＋１ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙの第８版（Ｔｈｅｗｉｌｌｉａｍｓ
＆ ｖｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ、 １９７４年）を参照し１
本菌をクレブシラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の−菌株と同定当するのが
適当と考えた０本菌は工業技術院微生物工業技術研究所
においてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＦＥＲＮ Ｐ−７３８７として寄託されている。
本菌により新規な耐熱性プルラナーゼを生産するために
は、窒素源としては、ペプトン、肉エキの無機窒素源の
いずれでも使用することができるが、なかでも尿素は良
好な窒素源である。
は、窒素源としては、ペプトン、肉エキの無機窒素源の
いずれでも使用することができるが、なかでも尿素は良
好な窒素源である。
炭素源としては１通常、トウモロコシ、ポテトサツマイ
モ、モチトウモロコシ、モチ米デンプンまたはこれらの
処理物が利用されるが、なかでもモチトウモロコシ、モ
チ米デンプン、アミロペクチンのような分岐結合の多い
多糖類が望ましい。
モ、モチトウモロコシ、モチ米デンプンまたはこれらの
処理物が利用されるが、なかでもモチトウモロコシ、モ
チ米デンプン、アミロペクチンのような分岐結合の多い
多糖類が望ましい。
・ そして、これらデンプン系多糖類を含む培地に対し
、乳糖が添加され、乳糖は培地に対して０．１％程度の
添加で十分効果を示すが、通常、０．５〜１％程度添加
すると、無添加の場合に比べ、プルラナーゼの生産量は
２〜３倍に増加する。
、乳糖が添加され、乳糖は培地に対して０．１％程度の
添加で十分効果を示すが、通常、０．５〜１％程度添加
すると、無添加の場合に比べ、プルラナーゼの生産量は
２〜３倍に増加する。
前記の窒素源と炭素源に加え、これに補足する培地原料
として、リン酸塩、マグネシウム塩と少量のカルシウム
、マンガンなどの金属塩が添加される。培養は２０〜４
５℃で１〜３日間好気的に培養される。
として、リン酸塩、マグネシウム塩と少量のカルシウム
、マンガンなどの金属塩が添加される。培養は２０〜４
５℃で１〜３日間好気的に培養される。
プルラナーゼは殆んど菌体外に生産されるので。
培養後は、濾過または遠心分離により除菌し、上澄液を
濃縮するか、または硫酸ナトリウム、硫酸として収得す
る。
濃縮するか、または硫酸ナトリウム、硫酸として収得す
る。
以下に、実施例により、本発明の詳細な説明する。
実施例１
尿素０．３５％、に２ＨＰＯ４０，０５％、阿ｇｓ０４
・７１（２００，０５％、可溶性デンプン２％、ＭｎＣ
Ｑ ２５ Ｘ １０″″ｓＭ、ＣａＣＱ ２２ＸｌＯ−
’ Ｍ、ＣｕＳ０４５ Ｘ １０− ’阿からなる培養
５０ｖａ ｎに、乳糖を０．１〜１％量添加し、２００
＋＋＋Ｉ２容三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、
クレブシラーニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＦＥＲＭＰ −７３８７を接種し
、３０℃で２日間振温培養した。
・７１（２００，０５％、可溶性デンプン２％、ＭｎＣ
Ｑ ２５ Ｘ １０″″ｓＭ、ＣａＣＱ ２２ＸｌＯ−
’ Ｍ、ＣｕＳ０４５ Ｘ １０− ’阿からなる培養
５０ｖａ ｎに、乳糖を０．１〜１％量添加し、２００
＋＋＋Ｉ２容三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、
クレブシラーニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＦＥＲＭＰ −７３８７を接種し
、３０℃で２日間振温培養した。
培養後、遠心分離機により除菌し、得られた上澄液につ
いて、生産されたプルラナーゼ活性を測定した結果は第
１表に示す通りであった。
いて、生産されたプルラナーゼ活性を測定した結果は第
１表に示す通りであった。
実施例２
実施例１の培地において、可溶性デンプンの代りに、モ
チ米デンプンを２％添加した培地と、これに乳糖を０．
５％添加した培地５０＋ａ Ｑを２００ｍ ｍ容三角フ
ラスコに入わ、常法により殺菌後クレブシラ・ニューモ
ニアＦ［ｌ’ＲＭＰ −７３８７を接種し、３０℃で２
日間培養した。培養後、遠心分離した上澄液について、
プルラナーゼ活性を測定した結果、乳糖無添加の場合６
．４６単位／ｍＱ培地であったのに対し、乳糖を添加し
た場合は１０．８単位／ｍΩ培地であった。
チ米デンプンを２％添加した培地と、これに乳糖を０．
５％添加した培地５０＋ａ Ｑを２００ｍ ｍ容三角フ
ラスコに入わ、常法により殺菌後クレブシラ・ニューモ
ニアＦ［ｌ’ＲＭＰ −７３８７を接種し、３０℃で２
日間培養した。培養後、遠心分離した上澄液について、
プルラナーゼ活性を測定した結果、乳糖無添加の場合６
．４６単位／ｍＱ培地であったのに対し、乳糖を添加し
た場合は１０．８単位／ｍΩ培地であった。
以上の実験結果から明らかなように、プルラナーゼの生
産に際し、デンプン質多糖類を含む培地に乳糖を添加す
ることにより、プルラナーゼの生産効率を著しく向上さ
せ得ることがわかる。
産に際し、デンプン質多糖類を含む培地に乳糖を添加す
ることにより、プルラナーゼの生産効率を著しく向上さ
せ得ることがわかる。
Claims (1)
- （１）プルラナーゼを生産するクレブシエラ属菌を培養
して、プルラナーゼを生産するに際し、デンプン質系多
糖類を含む培地に乳糖を添加することを特徴とするプル
ラナーゼの生産法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22544284A JPS61104786A (ja) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | プルラナ−ゼの生産法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22544284A JPS61104786A (ja) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | プルラナ−ゼの生産法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61104786A true JPS61104786A (ja) | 1986-05-23 |
| JPH0116158B2 JPH0116158B2 (ja) | 1989-03-23 |
Family
ID=16829425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22544284A Granted JPS61104786A (ja) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | プルラナ−ゼの生産法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61104786A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111235135B (zh) * | 2020-03-16 | 2021-11-02 | 江南大学 | 一种中性普鲁兰酶突变体及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50117989A (ja) * | 1974-02-28 | 1975-09-16 | ||
| JPS50117987A (ja) * | 1974-02-25 | 1975-09-16 | Staley Mfg Co A E |
-
1984
- 1984-10-26 JP JP22544284A patent/JPS61104786A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50117987A (ja) * | 1974-02-25 | 1975-09-16 | Staley Mfg Co A E | |
| JPS50117989A (ja) * | 1974-02-28 | 1975-09-16 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0116158B2 (ja) | 1989-03-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |