JPH0429355B2

JPH0429355B2 -

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Publication number: JPH0429355B2
Application number: JP59043369A
Authority: JP
Priority date: 1984-03-07
Filing date: 1984-03-07
Publication date: 1992-05-18
Also published as: JPS60186295A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、広い最適作用PH域をもつ新規なプル
ラナーゼによるデンプンの糖化方法に関するもの
である。プルラナーゼは、Benderらにより、プルラリ
ヤ・プルランの生産する多糖類プルランを加水分
解する酵素として、エーロバクター・エーロゲネ
ス（Aerobacter aerogenes）に、はじめて見出
された［Biochem.Biophys.Acta、36、309
（1959）、特公昭46−7559など］。その後、この酵
素は、アミロペクチンのα−1.6−グルコシド結
合を加水分解し、β−アミラーゼとの併用によ
り、デンプンからマルトースを収量よく生産でき
ることから注目され、現在までに同種の酵素が
種々の微生物により生産されることが知られてい
る。この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラー
ゼなど種々の名称で呼ばれているが、総称してα
−1.6−グルコシダーゼと言われている。たとえ
ば、エツセリシア・インターメデイアのイソアミ
ラーゼ［Escherichia intermedia、Applied.
Microbiol.、15、492（1967）］、ストレプトコツカ
ス・ミテイスのプルラナーゼ［Streptococcus
mitis，Biochem.J.108、33、（1968）］、ストレプ
トマイセス・sp.NO.28のイソアミラーゼ［J.
Ferment.Tech.，49、552（1971）］、バシルス属の
プルラナーゼ［Agric.Biol.Chem.，40、1515
（1976）、Starch，34、340（1972）など］などが
ある。最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα
−1.6−グルコシダーゼは、デンプンからグルコ
ースの製造や、デンプンからマルトース、マルト
トリオース、マルトテトラオース、マルトペンタ
オース、マルトヘキサオースなどのマルトオリゴ
糖の生産においても、これら糖の増収に有効であ
ることが認められている。しかるに、従来、知られているプルラナーゼや
イソアミラーゼなどα−1.6−グルコシダーゼは、
一般に熱安定性に劣り（多くは最適温度45〜50
℃）、また、作用PH範囲が狭いため、グルコアミ
ラーゼのように酸性側で作用し、熱安定性に優れ
た酵素（最適作用PH4.5付近、最適作用温度60℃）
や、中性〜弱アルカリ性に最適作用PHをもつ微生
物起源のマルトオリゴ糖生成酵素の、全てのアミ
ラーゼに対して使用するには技術的および経済的
に問題があつた。そこで、本発明者らは、グルコアミラーゼ、β
−アミラーゼやマルトトリオース以上のマルトオ
リゴ糖を生成するアミラーゼの、いずれのアミラ
ーゼとも併用できる、最適作用PH範囲が広く、且
つ熱安定性に優れたα−1.6−グルコシダーゼを
求めて、広く自然界から微生物の検索を行つてい
た結果、土壌中より分離し、クレブシラ・ニユー
モニア（Klebsiella pneumoniae）と同定した細
菌の生産するプルラナーゼが新規な耐熱性プルラ
ナーゼであることを認めた。すなわち、この酵素は作用温度範囲が約０〜75
℃、至適作用温度範囲約60〜約63℃、作用PH範囲
が約2.5〜約10、至適作用PH範囲が約4.5〜約7.5か
らなる新規な耐熱性プルラナーゼである。以下、本酵素を新規な耐熱性プルラナーゼＡと
いう。そして、本発明は、このような新規な耐熱性プ
ルラナーゼＡとグルコアミラーゼ、β−アミラー
ゼやマルトース以上のマルトオリゴ糖を生成する
エクソ型またはエンド型アミラーゼを併用するこ
とからなるデンプンの糖化方法に関するものであ
る。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。本発明において使用される、クレブシラ・ニユ
ーモニア（Klebsiella pneumoniae）は、Begey
の細菌同定書（Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology，The Williams＆
Wilkins Co.）において、以前はエーロバクタ
ー・エーロゲネス（Aerobacter aerogenes）と
区別されていたが、第８版において、エーロバク
ター・エーロゲネスはクレブシラ・ニユーモニア
に包含されている。エーロバクター属やクレブシ
ラ属細菌がプルラナーゼを生産することについて
は、すでに本発明以前に公知である。たとえば、
Biochem.Z.，334、79（1961）、Method in
Enzymology 、555（1966）、特公昭46−7559、
Agric.Biol.Chem.，37、2821（1973）などには、
エーロバクター・エーロゲネスの生産するプルラ
ナーゼの記載があり、また、特公昭51−5072特公
昭58−22197などには、クレブシラ・ニユーモニ
アなどクレブシラ属の生産するα−1.6−グルコ
シダーゼについての記載がある。しかし、これら
文献や特許公報に記載されている酵素は、いずれ
も熱安定性に劣つている。すなわち、Biochem.
Z.，334、79（1961）とMethod in Enzymology
、555（1966）にはエーロバクター・エーロゲ
ネスのプルラナーゼの最適作用温度は47.5℃とあ
り、Agric.Biol.Chem.，37、2821（1973）には、
同じくエーロバクター・エーロゲネスのプルラナ
ーゼの最適作用温度は50℃であると記載されてい
る。そして、特公昭51−5072には、クレブシラ・ニ
ユーモニアの最適作用温度は45〜50℃にあり、基
質の不在下では、50℃で１時間加熱処理すると殆
んど失活すると記載されている。このように、従来、知られているエーロバクタ
ー属やクレブシラ属のプルラナーゼやα−1.6−
グルコシダーゼの最適作用温度は45〜50℃程度で
あると考えられるのに対し、本発明の新規な耐熱
性プルラナーゼＡの最適作用温度は60〜63℃の高
温側にあり、基質の不在下で50℃で１時間加熱し
ても殆んど活性の低下は認められない（第１図及
び第２図）など、熱安定性に優れた酵素である。
本酵素は基質の存在下では当然熱安定性化され、
またカルシウムなどの金属塩の存在下でも熱安定
化されるので、実用的な反応条件においても、最
低60℃の温度で反応を行なうことができる。一方、最適作用PHについてみてみると、エーロ
バクター・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラ
ナーゼやα−1.6−グルコシダーゼの最適作用PH
は5.0付近｛Method in Enzymology 、555
（1966）、特公昭51−5072など｝、または、PH６付
近｛Agric.Biol.Chem.，37、2821（1973）｝にあ
り、いずれの場合も、特に、PH６以上においては
著しく活性が低下することが知られている。本発明以前に、比較的熱安定性に優れたα−
1.6−グルコシダーゼを生産する微生物として、
たとえば、パシルス属のプルラナーゼ｛特開昭57
−174089、Starch、34、340（1982）｝およびスト
レプトマイセス属のイソアミラーゼ｛J.Ferment.
Technol.，49、552（1971）｝が知られている。こ
れらの微生物の生産するプルラナーゼやイソアミ
ラーゼの最適作用温度は約60℃にあるが、いずれ
も最適作用PHは5.0にあり、PH５以上では著しく
活性が低下する。以上、説明したように、本発明以前に知られて
いたエーロバクター属やクレブシラ属の酵素は熱
安定性に劣り、最適作用温度は50℃前後にあり、
また、最適作用PHも5.0または6.0の狭い範囲にあ
る。これに対し、本発明により生産されるクレブ
シラ・ニユーモニアの新規な耐熱性プルラナーゼ
Ａは、最適作用PHが約4.5〜約7.5の極めて広い範
囲にあり、そして最適作用温度は60〜63℃と極め
て熱安定性に優れた酵素であり、従来、知られて
いたエーロバクタ属やクレブシラ属の酵素とは違
つた新規な酵素と認められるものである。以下に、本発明の新規な耐熱性プルラナーゼＡ
の酵素的性質についてより詳細に記載する。 (1) 作用；プルランのα−1.6−グルコシド結合
を分解してマルトトリオースを生成する。ま
た、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン
またはこれらの分解により派生するデキストリ
ンおよび各種オリゴ糖のα−1.6−グルコシド
結合を分解する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH、PH約2.5〜約10
の極めて広いPH範囲で作用し、最適作用温度は
PH約4.5〜7.5の広い範囲に認められた｛２％プ
ルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH３〜5.5）、トリ
ス緩衝液（PH5.5〜7.5）およびトリシン緩衝液
（PH７〜8.5）のもとで50℃で30分間反応、第１
図ａ｝ (3) 作用温度範囲及び最適作用温度；約75℃まで
作用し、最適作用温度は約63℃に認められた
｛２％プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH5.0）又
は0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）のもとで30分
間反応、第１図ｂ｝。 (4) 熱安定性；酵素水溶液を50℃、55℃と60℃で
加熱処理してのち、残存活性を測定した。その
結果、50℃では１時間の加熱後も失活は殆んど
認められなかつた。55℃の加熱では20分の加熱
で約20％失活し、１時間の加熱で約60％失活し
た。そして、60℃の加熱では30分間の加熱で約
80％失活した｛第２図ａ｝ (5) PH安定性；PH約４〜約10の範囲で安定であつ
た｛0.1M酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはト
リス緩衝液のもと、室温（25℃）で３時間放置
後、残存活性を測定した｛第２図ｂ｝。 (6) 阻害剤；本酵素は１×10^-3MのCuSO₄、
HgCl₂、ZnSO₄、FeSO₄により、それぞれ約93
％、約89％、約86％、約29％阻害された。同濃
度AgNO₃によつては殆んど阻害されなかつた。 (7) 精製方法；本酵素は培養上澄液から硫安分画
（40〜70％飽和）、DEAE−セフアロースカラム
クロマトグラフイー（KCl0〜0.5Mでリニヤ−
グラジエント溶出）とセフアデツクスＧ−200
カラムクロマトグラフイーにより、クロマト
的、電気泳動的に均一まで精製することができ
る。 (8) 分子量；セフアデツクスＧ−200ゲル濾過法
により測定した分子量は約12万であつた。 (9) 力価測定法；0.1Mトリオ緩衝液に溶解させ
た１％プルラン液（PH7.0）0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし40℃で反応させる。
この条件下で１時間に１mgのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。また、本発明において使用される新規な耐熱性
プルラナーゼＡ生産菌の菌学的性質は下記に示す
通りである。 (1) 形態的性質；約0.8×約1.3μの桿菌、通常、
単桿菌あるいは２連状に連なり生育する運動性
はなく、また胞子形成は認められない。 (2) 培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のあ
る円形状の集落を形成する。集落の周縁は全縁
で、表面隆起は頭状を示す。肉汁液体培養で
は、培地全体に混濁を生成する。穿刺培養では、寒天高層の上層、中部、深部
ともに糸状に生育が認められ、寒天表面にも集
落の形成が認められる。 (3) 生理的性質生育温度；約50℃の温度まで生育するが、最適
生育温度は約43℃。生育PH；PH約５〜約９の範囲で生育する。最適
生育PHは７付近。グラム染色；陰性。酸素に対する態度；通性嫌気性。カタラーゼ；陽性。オキシダーゼ；陰性 β−ガラクトシダーゼ；陽性硝酸塩の還元；陽性炭水化物の利用；グルコース、アドニトール、
Ｌ−アラビノース、エクスリン、イノシトー
ル、マンニトール、Ｌ−ラムノースなどを利
用し酸を生成する。クエン酸の利用；陽性マロン酸の利用；陽性メチルレツド反応；陰性 VP反応；陽性アルギニンの加水分解；陽性ゼラチンの液化；陰性硫化水素の生成；陽性インドール反応；陰性リジンの脱炭酸；陽性オルニチンの脱炭酸；陽性ウレアーゼ反応；陽性フエニールアラニンからのフエニルピルビン酸
の生成；陰性以上の菌学的性質について、Bergey′s
Manual of Determinative Bacterriologyの第
８版（The Williams＆Wilkins Co.1974年）を
参照し、本菌をクレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoniae）の一菌株と同定当す
るのが適当と考えた。本菌は工業技術院微生物工
業技術研究所において、Klebsiella pneumoniae
FERMP−7387として寄託されている。本菌による新規な耐熱性プルラナーゼＡを生産
するためには、窒素源として、ペプトン、肉エキ
ス、カゼイン、コーンステイープ・リカーのよう
な有機窒素源あるいは尿素、硫酸アンモニウム、
硝酸塩などの無機窒素化合物と、炭素源として、
デンプン、アミロペクチン、デキストリン、マル
トース、グルコース、乳糖などを一種または一種
以上、そしてこれに補足する栄養源として、リン
酸塩、マグネシウム塩、塩化カリウムと、マンガ
ン塩、カルシウム塩、鉄塩などの金属塩を含む培
地が使用される。培養はPH５〜９、温度20〜45℃で、通常、好気
的に行われる。新規な耐熱性プルラナーゼＡは殆んど菌体外に
生産されることと、α−アミラーゼなどのデンプ
ン糖化において有害となる酵素は殆んど生産され
ないため、培養後は、濾過または遠心分離により
除菌し、上澄液を回収して、これを濃縮するか、
あるいは必要に応じて、硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウムなどによる塩析によるか、または、ア
セトン、イソプロパノール、エタノール、メタノ
ールなどの有機溶剤を加えて酵素を沈澱物として
収得するなどの手段により、容易に培養物から酵
素を回収することができる。本発明以前に知られているAerobacter属や
Klebsiella属の生産するプルラナーゼやイソアミ
ラーゼなどα−1.6−グルコシダーゼは、菌体内
に多量の酵素を蓄積する（例えば、特公昭46−
7559、特公昭51−5072など）ため、培養終了後、
菌体から酵素を抽出回収する操作が必要であると
いう問題があるが、本発明により生産される新規
な耐熱性プルラナーゼＡは、殆んどすべて菌体外
に生産されるため、培養物からの該酵素の回収は
容易であり、工業的に同酵素を製造する際に商業
的に有利に実施することができる特徴をもつもの
である。また新規な耐熱性プルラナーゼＡは前述
の如く、最適作用PHが約4.5〜約7.5の広い範囲に
あり、また熱安定性に優れた酵素であるため、現
在、知られているデンプンからグルコースを生産
するグルコアミラーゼ、デンプンからマルトース
を生産する植物や細菌のβ−アミラーゼなどのエ
クソ型アミラーゼはもとより、マルトトリオース
を生成するバシルス属のエンド型またはエクソ型
のアミラーゼ｛最適作用PH6.0〜6.5、発酵と工
業、41巻、477頁（1983）｝、マルトテトラオース
を生成するシユードモナス属のエクソ型α−アミ
ラーゼ｛最適作用PH6.5〜8.0、Arch.Biochem.
Biophys.，145、105（1971）など｝、マルトペン
タオースを生成するバシルス属エンド型α−アミ
ラーゼ｛最適作用PH５〜８、Arch.Biochem.
Biophys.，155、290（1973）｝、マルトヘキサオー
スを生成するエクソ型とエンド型のα−アミラー
ゼ｛最適作用PH6.8または8.0、Biochem.
Biophys.，Acta410、333（1975）及びAgric.Biol.
Chem.，46、1539（1982）｝など、いずれのアミラ
ーゼとも、それぞれのアミラーゼの最適条件下で
反応をおこなうことができる。更に、新規な耐熱性プルラナーゼＡと各種エク
ソ型またはエンド型アミラーゼとの併用によるデ
ンプンの糖化において、本発明の新規な耐熱性プ
ルラナーゼＡ単独でも十分効果を示すが、この酵
素の他に他の微生物の生産するα−1.6−グルコ
シダーゼと併用して用いると、一層、顕著な効果
を示す。たとえば、本発明の発明者により先に発
明されたバシルス属のα−1.6−グルコシダーゼ
｛Agric.Biol.Chem.，40、1515（1976）｝などのバ
シルス属の生産するα−1.6−グルコシダーゼと
本発明の新規な耐熱性プルラナーゼＡをβ−アミ
ラーゼと共に液化デンプンに作用させると、バシ
ルス属α−1.6−グルコシダーゼや本発明の耐熱
性プルラナーゼＡ、それぞれ単独の場合よりもマ
ルトースの収量を２％前後増収することができ
る。このことは、本発明の新規な耐熱性プルラナ
ーゼＡとバシルス属α−1.6−グルコシダーゼの
作用特異性に差があることによるものと考えられ
る。以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。実施例１尿素0.35％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、可溶性デンプン２％、KCl0.5％、
MnCl₂5×10^-5M、CaCl₂1×10^-3Mからなる培地
50mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法により
殺菌後、クレブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
pneumoniae）FERMP−7387を接種し、30℃で
２日間振温培養した。培養後、遠心分離機により
除菌し、得られた上澄液について生産された新規
な耐熱性プルラナーゼＡ活性を測定した結果、培
地ml当り5.6単位であつた。実施例２実施例１で使用したと同じ組成の培地３を５
容ジヤーフアーメンターに入れ、常法により殺
菌後、クレブシラ・ニユーモニアFERMP−7387
を接種し、通気量１／min.回転数250rpmで培
養した。培養後、遠心分離機により除菌し、硫安
70％飽和になるように加え、生成した沈澱物を粗
酵素として回収した。得られた酵素剤を用いて、
アミラーゼと併用してデンプンの糖化を行つた。 DE1.4の液化デンプン液（固形物として1g）
に、市販の大豆β−アミラーゼ300単位｛Agric.
Biol.Chem.，40、1515（1976）の測定法によつ
た｝と上記方法により得たクレブシラ・ニユーモ
ニアの新規な耐熱性プルラナーゼを１または２単
位を加え、PH6.0、55℃で反応させた。得られた
糖化物の糖は高速液体クロマトグラフ法により定
量した。結果は第１表に示す通りであつた。実施例３ DE7.7の液化デンプン液に、市販のグルコアミ
ラーゼと実施例２で調製した新規な耐熱性プルラ
ナーゼ１単位加え、固形分濃度30％、全容量10ml
として、PH5.0、温度60℃で糖化した。糖化液の
糖組成の分析は高速液体クロマトグラフ法によつ
た。得られた結果を第２表に示す。表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ
ーゼＡの添加によりグルコースの収量が増加し
た。ここでG₂，G₃はそれぞれグルコースの２量体、
３量体を示す。実施例４ DE4.2の液化デンプン液（固形分として1g）
に、バシルスSPYT−1004（微工研菌寄第5854号）
の生産するマルトトリオース生成アミラーゼ２単
位と実施例２で調製した新規な耐熱性プルラナー
ゼA1.5単位を加え、水で全量10mlとし、PH7.0、
温度50℃で糖化した。糖化液の糖組成を分析した
結果は第３表に【表】【表】【表】示す通りであつた。表から明らかなように、新規な耐熱性プルラナ
ーゼＡを添加することにより、マルトトリオース
の収量が著しく増加した。実施例５ DE1.4の液化デンプン液（固形分として1g）
に、バシルス・セレウス・バリエータス・ミコイ
デス（微工研菌寄第2391号）の生産するβ−アミ
ラーゼとプルラナーゼ（Agric.Biol.Chem.，48、
1515（1976）特公昭53−5749）それぞれ300単位と
30単位｛単位の定義は前記Agric.Biol.Chem.，
48、1515（1976）｝及びこれに実施例２で調製した
新規な耐熱性プルラナーゼＡを0.5または１単位
加え、PH６〜6.5、温度50℃で44時間糖化した。
糖化液の糖組成を分析した結果は第４表に示す通
りであつた。表から明らかなように、バシルス属のプルラナ
ーゼに加えて、本発明の耐熱性プルラナーゼＡを
１単位追加して加えることにより、その他の成分
が少なくなり、マルトースの収量は2.9％増加し
た。【表】

【図面の簡単な説明】

第１図ａとｂ、第２図ａとｂは、それぞれクレ
ブシラ・ニユーモニアの生産する新規な耐熱性プ
ルラナーゼの最適作用PH、最適作用温度、熱安定
性をPH安定性を示している。

Claims

【特許請求の範囲】

１クレブシラ・ニユーモニアの生産する新規な
耐熱性プルラナーゼＡをエクソ型またはエンド型
のアミラーゼと併用してデンプン、アミロペクチ
ン、グリコーゲンまたはこれらの分解により派生
するデキストリンおよび各種オリゴ糖に作用させ
ることを特徴とするデンプンの糖化法。