JPH0369510B2

JPH0369510B2 -

Info

Publication number: JPH0369510B2
Application number: JP58785A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1991-11-01
Also published as: JPS61162182A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、新規な澱粉糖化酵素剤に関するもの
である。〔従来技術〕アミラーゼは澱粉中に存在するα−１，４−グ
ルコシド結合あるいはα−１，６−グルコシド結
合を分解する酵素の総称であり、分解する結合や
分解様式により、種々の名称で呼ばれる酵素が知
られている。たとえば、α−１，４−グルコシド
結合を切断するアミラーゼに、α−アミラーゼ、
β−アミラーゼなどがあり、α−１，６−グルコ
シド結合を分解する酵素にイソアミラーゼ、プル
ラナーゼ、アミロ−１，６−グルコシダーゼ、Ｒ
−酵素など、一般に枝切り酵素（debranching
enzyme）と呼ばれる酵素がある。そして、α−
１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシ
ド結合の両結合を切断する酵素としてはグルコア
ミラーゼがあり、α−１，４−グルコシド結合と
α−１，６−グルコシド結合からなるアミロペク
チンまたはこれを含む澱粉を、その非還元性末端
から、ほぼ完全にグルコースに加水分解する。α
−１，６−グルコシド結合を分解する枝切り酵素
は、最近、β−アミラーゼと組み合わせて澱粉に
同時に作用させることにより、マルトースを収量
よく生産するのに使用したり、また、グルコアミ
ラーゼのα−１，６−グルコシドの分解切断能力
を補うために、グルコアミラーゼと併用すること
により、澱粉からグルコースを収量よく製造する
ために使用される有用な酵素である。しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
４〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55〜60℃で長時間使用できる熱安
定性をもち、且つPH４〜５で作用できる酵素であ
ることが要求される。しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの｛バシルス・ステアロ
サーモフライス〔日本農芸化学会大会昭和47年度
講演要旨集第88頁〕、バシルス・アシドプルリテ
イカス〔特開昭57−174089、starch、34，340
（1982）〕｝を除き、殆んどは最適作用温度が40〜
50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠点で
あつた。〔目的〕本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、PH約５〜約7.5の広
いPH範囲に最適PHをもつ耐熱性のプルラナーゼ様
酵素が、バシルス・ズブチルス（Bacillus
subtilis）TUと同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。本酵素は、プルランに作用させたとき、殆んど
マルトトリオースに分解するα−１，６−グルコ
シダーゼ活性を示すが、同酵素剤を澱粉に作用さ
せたとき、マルトースとマルトトリオースを特異
的、且つ高収量で生産する新規で興味ある酵素活
性を示し、澱粉からマルトースとマルトトリオー
スをそれぞれ約40〜約50％含む新規な水飴が製造
できることを認めた。本発明はこのような知見に
基づいてなされたものである。〔構成〕すなわち、本発明は、澱粉を、主としてマルト
ースとマルトトリオースに分解する新規なα−ア
ミラーゼ酵素活性をもち、且つプルランをマルト
トリオースに分解する酵素活性をもつ新規なプル
ラナーゼ様複合酵素剤に関するものである。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。本発明により生産される新規なα−アミラーゼ
活性をもつプルラナーゼ様酵素は、プルランを基
質とするとき、最終的に主としてマルトトリオー
スを生成するプルラナーゼ活性を示すが、同時
に、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン
などのα−１，４−グルコシド結合分解活性をも
ち、マルトースとマルトトリオースを主成分とし
て生成する興味ある新規な酵素剤であるが、この
プルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫安
分画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交換体
による吸着クロマトグラフイー、ゲル濾過、無機
担体などへの吸着、などのタンパク質精製方法に
よつては分離されず、Sephadex Ｇ−200
（Pharmatia Fine Chemicals製）、Cellulofine
GC700ｍ（チツソ(株)製）やBiogel Ａ−0.5ｍ
（Bio−Rad Lab.製）などを用いたゲル濾過法に
より測定した分子量が45〜55万の高分子量である
（通常のプルラナーゼの分子量は10万前後）こと
から、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニツ
トがかなり強固に結合し、複合酵素を形成してい
ることが考えられる（第３図はBiogel Ａ−1.5ｍ
によるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及
びタンパク質の溶出曲線を示しているが、これら
三者の溶出パターンは完全に一致している）。本発明により生産される酵素剤のプルラン分解
活性の酵素的性質を以下に記載する。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の下で30分間反
応したとき、約80℃まで作用し、最適作用温度
は60〜63℃（第２図）。 (3) 作用PH及び最適作用PH；１％プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約４〜約10の
広いPH範囲に作用する。第１図に示す通り、PH
約５とPH７〜7.5のピークが認められ、最適作
用PHは約５〜約7.5の広い範囲にあると考えら
れる（クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液と
リン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分間反
応）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果50℃、10
分間の加熱までは殆んど失活が認められず、55
℃、10分の加熱で約30％失活した。そして、60
℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定；0.1M緩衝液のもとで30℃で３時間
放置後、プルランを基質として残存活性を測定
した結果、PH約５〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤；１×10^-3MのHgCl₂、AgNO₃で90
％以上阻害された。また同濃度のZnSO₄により
約70％阻害された。 (7) 安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。１×10^-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた（１％プルラン、30分反応）。 (8) 精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾過か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸溜水
で洗浄後、0.5MKClまたは、リン酸−カリウ
ム溶液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロー
スカラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5ｍ
によるカラムクロマトグラフイー、同カラムに
よる再クロマトグラフイー等により、クロマト
的及び電気泳動的に均一まで精製することがで
きる。 (9) 分子量；Biogel Ａ 0.5ｍで測定した分子量
は約55万であつた。 (10) 活性測定法；プルラナーゼの測定は0.1Mリ
ン酸緩衝液に溶解させた１％プルラン溶液（PH
7.0）0.5mlに適量の酵素を加え、水で全量１ml
とし、40℃で反応させる。この条件で１分間に
1μmolのグルコースに相当する還元力を生成す
る酵素量を１単位とした。以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ活性はPH約５〜約7.5の極めて広いPH範囲に最
適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60〜
63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であり、
本発明以前に知られているバシルス属のプルラナ
ーゼ〔例えば、Agric.Biol.Chem、40，1523
（1976）、（最適PH６〜6.5、最適温度50℃）、特公
昭59−39630（最適PH7.0、最適温度45℃）、特開昭
昭57−174089（最適PH3.5〜5.5、最適温度約60
℃）〕とは異なつた新規なプルラナーゼ様酵素で
あるということができる。本発明において、例示菌として使用されるバシ
ルス・ズブチルスTU株の菌学的性質は下記の通
りであり、本菌は微工研条寄第684号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態的性質；桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ、非運動
性、グラム陽性、胞子は球形、楕円形。 (2) 培養的性質； (a) 肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁寒天培
養よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養；生育はよくないが混濁を生
じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育す
る。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆつくり液
化する。 (f) ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次い
でペプトン化する。 (g) ポテト培養；生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質； (a) 硝酸塩の還元；陰性 (b) カタラーゼ；陽性 (c) チロシナーゼ；陰性 (d) インドール；生成しない (e) クエン酸の利用；陽性 (f) 硫化水素の生成；陽性 (g) ウレアーゼ；陰性 (h) 澱粉の加水分解；陽性 (i) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト
ース、シユークロース、マルトース、ラクト
ース、デンプン、デキストリン、グリコーゲ
ン、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ
−アラビノースなどの炭水化物から酸を生成
するが、ガスの発生は認められない。 (4) 生育PH及び生育温度；本菌は、中性付近よりも、弱アルカリ性のPH
7.5〜8.5で良好に生育する。生育最適温度は35
〜45℃にあり、最高生育温度は約50℃である。〔効果〕本発明により生産される新規なプルラナーゼ様
酵素はプルランをマルトトリオースに分解するα
−１，６−グルコシド結合分解活性の他に、澱粉
などα−１，４−グルカンを主としてマルトース
とマルトトリオースに分解するα−アミラーゼ活
性をもつているため、この活性をもたないプルラ
ナーゼやイソアミラーゼなどに比べ、グルコアミ
ラーゼに併用して澱粉の糖化に使用する場合、澱
粉の糖化反応を促進し、且つ最終的なグルコース
の収量も、通常、0.5〜３％高く収得することが
できる。例えば、グルコアミラーゼ単独で30％濃
度の液化澱粉に作用させた場合、グルコースの収
量は94〜95％である。そして、グルコアミラーゼ
に市販のプルラナーゼを共存させた場合、グルコ
ースの収量は約96.5％であつたが、同一プルラナ
ーゼ活性の本発明の酵素剤を共存させた場合は
97.0〜97.5％の収量でグルコースが得られた、こ
のように、グルコースの収量が高いばかりでな
く、最高の糖化率に到達する時間も、本発明の酵
素剤を使用する場合、著しく短縮することができ
る。すなわち、このことはグルコアミラーゼの使
用量を節減できることを意味している。また、本発明の酵素剤はアミロース、アミロペ
クチン、デンプン、グリコーゲンなどに作用させ
た場合、主として、マルトースとマルトトリオー
スを生成するが、本酵素がα−１，６−グルコシ
ド結合分解活性をもつているため、マルトースと
マルトトリオースを極めて高い収量で得ることが
できる。例えば、本酵素剤を液化デンプンに作用
させた時、マルトースとマルトトリオースは、い
ずれも約40〜約50％の高収量で得られる。マルト
ースとマルトトリオースをこのような糖組成で生
成するアミラーゼは未だ知られていない。本発明
の酵素剤を使用して得られるこのような糖化物は
マルトースとマルトトリオースの両方の特性をも
つものであり、甘味料、甘味調製剤、食品増量剤
など、種々の食品の添加剤として利用できるので
ある。また、本発明の酵素は、極めて熱安定性に
優れ、グルコアミラーゼの限界温度である60℃に
おいても長時間の反応を行うことができるばかり
か、PH4.5〜5.0のグルコアミラーゼの良好な作用
PH範囲でも好適に利用することができる。このよ
うに、本発明の酵素剤は種々の効果をもつ新規な
酵素剤である。本発明のα−アミラーゼ活性をもつプルラナー
ゼ様酵素を生産するためには、窒素源として、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン、コー
ン・ステイープ・リカー、大豆類、魚粉のような
有機窒素源や、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムのようなアンモニウム
塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのような硝酸
塩あるいは尿素のような無機窒素源のいずれか、
または両方を使用する。炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。培養は、PH約５〜約９、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH７〜９、温度30℃前後
で２〜４日間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硝酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈澱物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ−アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH４〜９、温度40℃〜70℃で
行われる。以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。実施例１大豆粒５％、コーン・ステイープ・リカー0.6
％、肉エキス0.3％、リン酸二カリ0.3％、硫酸マ
グネシウム0.1％、可溶性デンプン２％、尿素0.3
％、ソデイウム・ドデシルサルフエート0.1％、
硫酸銅５×10^-5M、塩化マンガン2.5×10^-6M、
塩化カルシウム１×10^-3M、硫酸亜鉛１×
10^-4M、硫酸鉄１×10^-5Mからなる倍地（PH7.2）
30mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法により
殺菌後、バシルス・ズブチルスTU（FERM BP
−684）を接種し、30℃で３日間振盪培養した。
培養後、遠心分離して得た上澄液中のプルラナー
ゼ活性は倍地１ml当り9.6単位であつた。またα
−アミラーゼ活性は培地１ml当は45.2単位であつ
た。ここでα−アミラーゼ活性は以下のようにして
測定した。 0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％可溶性澱
粉液（PH7.0）0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１分間
に1μmolのグルコースに相当する還元力を生成す
る酵素量を１単位とした。実施例２実施例１で使用した培地と同じ組成の培地で培
養した、バシルス、ズブチルスTU株（FERM
BP−684）の培養上澄250mlに、0.4Mリン酸二ナ
トリウム溶液及び0.4M塩化カルシウム溶液各150
mlを滴下しながら添加してリン酸カルシウムゲル
を形成させるとともに、これに酵素を吸着させ
た。次いで、ガラスフイルターで濾過して吸着物
に回収し、蒸溜水で充分洗浄後、0.5Mリン酸−
カリウム溶液200mlで酵素を溶出し、透析、濃縮
した。次いで、2.5×10^-3Mトリス緩衝液で緩衝化し
たDEAE−セフアロースカラムで処理し、同緩衝
液で流出する。プルラナーゼ活性区分を集め、濃
縮、透析後、2.5×10^-3Mトリス緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したBiogel Ａ 1.5ｍカラムでゲル濾過
を行い、活性区分を集め、同カラムで再クロマト
グラフイーを繰返した。第３図はBiogel Ａ 1.5
ｍカラム（1.5×87cm）による溶出曲線を示して
いる。精製された酵素はタンパク質曲線、プルラ
ナーゼ活性曲線及びα−アミラーゼ活性曲線は完
全に一致している。最終的に回収された酵素標品
のプルラナーゼ活性は585単位、そしてα−アミ
ラーゼ活性は1070単位であつた。実施例３実施例２で調製した酵素剤を市販のグルコアミ
ラーゼと併用して澱粉の糖化反応を行つた。基質としては、ポテト澱粉を市販液化酵素で液
化したDE7.7のものを使用した（グルコアミーゼ
と液化酵素は、天野製薬(株)、ノボ・ジヤパン(株)な
どより入手することができる）。固形分として、各３ｇの液化澱粉に、グルコア
ミラーゼ（ノボ社製工業用酵素）を液化澱粉固形
分に対して、0.2％量と実施例２で調製した。本
発明の酵素剤または市販のプルラナーゼを加え、
１×10^-2M塩化カルシウムの存在下、PH4.8〜5.0
で、57.5℃で糖化反応を行つた（各プルラナーゼ
剤は、前記の活性測定法において、リン酸緩衝液
の代りに、酢酸緩衝液を用い、PH5.0で測定する
以外は同じ条件で行ない、基質１ｇに対し、0.5
単位の酵素量を添加した）。得られた結果は第１
表及び第２表に示す通りであつた。

【表】第１表は、糖化開始１、２、３、５と20時間目
におけるDE値（全糖中の還元糖をグルコースと
して表わした値）を示す。全糖はフエノール一硫
酸法で定量し、還元糖はフエリシアン化カリ法に
より定量した。表から明らかなように、本発明の
酵素剤を用いた場合、糖化開始初期における糖化
が促進されていることがわかる。第２表は、糖化開始後、22時間、25時間と28時
間目の糖化物を高速液体クロマトグラフイーによ
り糖組成を分析した結果を示している。表から明
らかなように、本発明の酵素剤を用いた場合、最
高97.1％の収量でグルコースが得られた。また糖
化22時間目のグルコース収量から明らかなよう
に、糖化反応が著しく促進されていることがわか
る。

【表】実施例４実施例３と同様にして、本発明の酵素剤を基質
ｇ当り0.5単位添加し、PH4.5〜5.3、温度55℃で糖
化した。糖化開始24時間後、２時間毎に生成した
グルコース収量を高速液体クロマトグラフイーに
より求めた。第３表は各糖化PHにおける最高値を
示したときのグルコース収量を示している。

【表】表から明らかなように、本発明の酵素はPH4.5
〜５のグルコアミラーゼの最適作用PH条件下で効
果的に作用し、無添加の場合に比べグルコース収
量を約２％増加することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図；プルランを基質としたときの最適PHを
示す。第２図；プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第３図；Biogel Ａ 1.5ｍカラム
（1.5×87cm）によるプルラナーゼ活性、アミラー
ゼ活性及びタンパク質（280nｍにおける吸収）
の溶出曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有するプルラナーゼ酵
素。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。また、澱粉のα−１，４−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトースとマルトトリ
オースを生成する。 (2) 最適PH；プルランに作用させたとき、PH約５
とPH７〜7.5にヒークが認められる。 (3) 最適温度；１％プルラン下で30分作用させた
とき、60〜63℃に認められる。 (4) 安定化；カルシウムイオンの存在により、熱
安定化される。 (5) 分子量が約55万である。