JPS6015315B2 - アミラ−ゼｇ３の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、澱粉をマルトトリオースを主成分とする糖化
物に分解するアミラーゼの製造方法い関するものである
。

従来、アミラーゼとしては澱粉を、その非還元性末端か
らグルコース単位に分解するグルコアミラーゼ、マルト
ース単位に分解するＢーアミラ−ゼや澱粉をその内部鎖
から切断するＱ−アミラーゼが知られ、グルコースやマ
ルトースの工業的製造に使用されている。

そした最近は、より分子量の大きい、例えば、マルトト
リオース（０３）、マルトテトラオース（Ｇ４）マルト
ベンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）な
どのオリゴ糖製造技術の開発が要望されている。

これらのオリゴ糖は食品の増量剤、賦形剤、包鞍剤など
食品、医薬及び工業製品に広く製造できるものと考えら
れているが、末だ製法は確立されていないと云っても過
言ではない。本発明者は、各種オリゴ糖の製法を開発す
ることを目的として、澱粉よりこれらオリゴ糠を特異的
に生産するアミラーゼの探索を行ってきた結果バチルス
魔の微生物が澱粉をマルトトリオースを主成分とする糖
化物に分解するアミラーゼを生産することを認めた。

澱粉からマルトトリオースを特異的に生成するアミラー
ゼとしては、Ｓｕｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｌｓｅｕｓの
生産するＮ−Ａ４６８酵素（樽公昭５７−６９１５、特
開昭１１００４９澱粉化学、第２３巻、第３号、第１７
５〜１８１頁（１９７９）が知られている。

しかしこの酵素は、６ーアミラーゼと同様に澱粉をマル
トトリオース単位でｅｘｏ型で分解するアミラーゼであ
り、反応生成物中の糖は殆んどマルトトリオースのみで
あると報告されている。しかいこ、本発明の酵素は分解
生成糠がＱ‐糖であることからＱーアミラーゼの一種で
あり、澱粉を最終的には沃度反応が殆んど消失するまで
、主としてマルトトリオースを含む分解物に分解するア
ミラーゼであり、ポテト澱粉糖化物の梶組成の一例は第
１表に示す通りである。

第１表この他、酵素の最適温度、熱安定性、ｐＨ安定性
、分子量などの酵素的性質においても著しい差異が認め
られるものである。

また、従釆、知られている多くのＱーアミラーゼは澱粉
分解物の１つとしてマルトトリオースを生成するか、マ
ルトトリオースのみを特異的に大量生成するものではな
い。本発明のァミラーゼは、第１表から明らかなように
、マルトトリオースを６０％以上の高収量で生産すると
いう、極めて特徴のあるアミラーゼであって、本発明者
はこの酵素をアミラーゼＧ３と命名した。

以下に本酵素の酵素的性質を記載する。アミラーゼＧ３
の酵素的性質【１’作用；澱粉、アミロース、アミロベ
クチン、デキストリン、グリコーゲンなどのグルカンを
マルトトリオースを主成分とする分解物に分解する。

生成糖はＱ‐型であって、本酵素はＱ−アミラーゼの一
種と考えられるものである。澱粉及び液化でん粉からの
マルトトリオースの収量は約５０〜約６５％である。‘
２１ 作用温度範囲及び最適作用温度：約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約５０℃である｛１％澱粉濃度、
最適作用ｐＨで３０分間反応、第１図ｂ｝‘３’ 作用
母範囲及び最適作用餌；解約４〜約１１の範囲に作用し
、最適作用ｐＨは６〜７、｛第１図ａ｝‘４）熱安定性
：０．０９Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の存在下で加
熱した場合、５ぴ０、ＩＱ分間の加熱で約７０％失活し
、１０分間の加熱で９０％以上失活する｛第１図ｃ｝の
白抜き丸｝‘５’餌安定性；０．１Ｍ緩衝液の下で、室
温（２５℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。

その結果、解約６〜約９の範囲で安定であった｛第１図
ｄ｝■ 安定化；カルシウムイオンの存在下で熱安定性
の増加が認められた｛第１図ｃの黒丸｝【７１ 阻害剤
；．本酵素は５×１０‐３ＭのＨｇＣ１２、ＡｇＮ０３
、ＣｕＳ０４、ＺｎＳＱ、ＦｅＳ０４の存在下で、それ
ぞれ約灘％、約８０％、約９７％、約９５％、約６０％
阻害された。

‘８｝ 精製方法；本酵素は液体培養物の遠心上燈液か
ら、硫安分面、ＤＥＡＥーセフアロースカラムクロマト
グラフィー（ＫＣＩ濃度０〜０．２Ｍでグラジェント溶
出）、次いでセフアデックスＧ−１００カラムクロマト
グラフイー及び同カラムによる再クロマトグラフィーに
より、クロマト的及び蚤気泳動的にほぼ均一にまで精製
された‘９１ 分子量；セフアデツクスＧ−１００を用
いるゲル炉過法により測定された本酵素の分子量は約２
５０００であった。

ＯＱ 力価測定法：０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解させた
１％可溶性澱粉液（ｐＨ７．０）０．５の‘に適量の酵
素を加え、水で全量１の‘とし、４０ｑｏで反応させる
。

この条件で１時間に１の９のグルコースに相当する還元
力を生成する酵素量を１単位とした。本酵素を生産する
例示菌として、バシルス・ＹＴ−１００４を挙げる。

本微生物の菌学的性質は下記に示す通りであり、徴工研
菌寄第５８５４号として工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。○’形態；短樟菌、大きさ、中０
．５〜０．７仏×１．７〜２．４ム、単樟菌、非運動性
、グラム陰性又はグラム ／ゞリアブル■ 胞子：胞子
髪細胞のふくらみはあっても非常に小さい、球形〜楕円
形の胞子を形成する｛３１ゼラチン；ゆっくり液化する
。

■ 肉汁寒天；生育良好、表面スムース、黄色を帯びる
。

‘５’グルコ−ス肉汁寒天；肉汁寒天よりも生育不良、
淡黄色■ グルコース硝酸寒天；生育わずか ‘７｝ 肉汁；少し混濁、沈降する。

‘８’ 食塩肉汁・；食塩の存在は生育を促進する。

１０％食塩でも生育する。

■ クエン酸寒天；生育わずか ‘ＩＱ チロシン寒天；生育良好、黄色、チロシナーゼ
陰性（１１）グルコースーアスパラギン寒天；生育わず
か（１２）インドール；生成しない。

（１３）ミルク；ゆっくりと凝固、ベブトン化（１り
ポテト；生育わずか（１５）ァセチルメチルカルビノー
ル：生成する。

（１６）硫化水素；生成する。（１７）硝酸塩の還元：
陰性 （１８）ウレアーゼ；生成しない。

（１９）カタラーゼ：生成する。

（２０）澱粉の加水分解：陽性 （２１）炭水化物の利用：Ｄ−グルコース、Ｄーフラク
トース、Ｄーマンノース、Ｄーガラクトース、Ｄーキシ
ロース、ｔーアラビノース、シユークロース、ラクトー
ス、マルトース、澱粉グリコーゲンなどから生駁するが
ガスの生成はなし。

（２２）生育温度；最適生育温度滋〜４６ｑｏ、最高生
育温度約５０ｑ○。

以上の菌学的諸性質について、技ｒ袋ｙ，ｓＭａｎ船ｌ
ｏｆＤｅにｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙの第７版及び第８版（Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ
＆ ＷｉｌｋｉｎＳＣｏｍｐａｎｙ，１９５７年及び
１９７山王）を参照し同定した結果、本菌はバシルス
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ泌ｔｉｌｉｓ）の変種
の一種と考えるのが妥等と思われた。

本菌株はアミラーゼＧ３の他にＱ−１．６ーグルコシダ
ーゼ（プルラナーゼ）を同時に生産する能力があり、こ
の酵素がアミロベクチンの分岐結合であるＱ‐１．６ー
グルコシド結合を分解するため、澱粉やアミロベクチン
などの分岐結合のある基質に対し、アミラーゼＧ３と共
同して作用し澱粉からマルトトリオースを収量よく生産
するのに重要な役割をしている。

例えば、本菌の生産するＱ‐１．６ーグルコシダーゼと
同時に反応を行った場合、マルトトリオースの収量は基
質の種類によってもことなるが、通常１０〜２５％増加
する。本菌の生産するＱ‐１．６ーグルコシダーゼの酵
素的性質は下記に示す通りである。‘１’ 作用；プル
ランに存在するＱ‐１．６ーグルコシド結合を分解し、
マルトトリオースを生成する。

また、澱粉、アミロベクチン、グリコーゲン又はその派
生物のＱ‐１．６ーグルコシド結合を分解する。■ 作
用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作用し、最
適作用温度は約６０ｑｏ（１％プルラン、０．０８Ｍト
リス緩衝液のもとで３び分間反応、第１図ｂ）｛３１作
用−範囲及び様簿作用ｐＨ；ｐＨ約４〜約１０の広いｐ
Ｈ範囲に作用し、ＰＨ５付近とＰＨ７〜７．５付近に作
用極大が認められる。

｛１％プルラン、０．０８Ｍ緩衝液（酢酸緩衝液ｐＨ３
．５〜５．ふ りン酸緩衝液ｐＨ５．５〜１０）の下で
４０『０で反応、第２図ａ｝‘４１熱安定性：０．０８
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）のもとで、各温度で１
０分間加熱後、残存活性を測定した。

その結果、５０℃、１■ふ間の加熱では殆んど失活せず
、６０℃、１０分間の加熱で約７０％失済した。｛第２
図ｃ白抜き丸｝‘５｝ ｐＨ安定性：ｐＨ約５〜約１０
で安定｛０．１Ｍ緩衝液の下で室温（２５℃）で放置後
、残存存活性を測定、第２図ｄ｝‘６’ 阻害剤；本酵
素は５×１０‐３のＨ＆１２、ＡｇＮ０３、ＣｕＳ０４
などにより、それぞれ約９８％、約蝋％、約８７％阻害
された。

‘７１ 安定化：カルシウムイオンの存在は本酵素の熱
安定性を増加する。

第２図ｃ黒丸【８１精製方法；本酵素は液体培養物の上
澄液から硫安分画、ＤＥＡＥーセフアロースカラムクロ
マトグラフイー（ＫＣＬＯ．〜０．９Ｍでグラジエント
溶出）、その後セフアデックスＧ‐２００カラムクロマ
トグラフィーによりクロマト的且つ亀気泳動的にほぼ均
一まで精製することができる■ 分子量：セフアデツク
スＧ‐２００ゲル炉過法により測定された分子量は約５
５方であった。

ＯＱ 力価測定法；０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解させた
１％プルラン液（ＦＨ７．００．５奴‘‘こ適量の酵素
を加え、水で全量１の‘とし、４０℃で反応させる。こ
の条件で１時間に１の９のマルトトリオースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位ときた。本発明による
アミラーゼＧヱ生産のための培養は、窒素源としてべプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン、コーン、ステ
イプ・リカー、大豆粕など通常に用いられる有機窒素源
が使用されまた、炭素源としては澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース、シユークロースなどが使用さ
れ、そして、これに補足する栄養源として無機窒素源、
リン酸塩、マグネシウム塩と各種金属塩を含む培地が使
用される。

培養はｐＨ約５〜９、温度２５〜５５ｑｏで好気的に行
なわれる。アミラーゼＧ３及びプルラナーゼは菌体外に
生産される酵素であるので、培養終了後、炉過又は遠心
分離して除菌し、上澄液を回収する。

そして、必要に応じ、濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムな
どによる塩折によるか、又はアセトソ、ィソプロパノー
ル、エタノール、メタノールなどの有機溶剤を加えて、
酵素を沈澱物として収得、乾燥、保存する。本酵素によ
る澱粉の糖化は、通常５〜４０％の液化澱粉の下で、ｐ
Ｈ５．５〜８、温度４０〜６０ｑｏで行なわれる。

以下に実施例により本発明の詳細を説明する。

実施例 １２００肌客三角フラスコに、Ｋ２ＨＰ０４０
．３％、ＭｇＳ０４・７日２００．１％、魚肉エキス３
％、可溶性澱粉１％、硫酸マンガン５×１０‐５Ｍから
なる液体培地を入れ、常法により殺菌後、バシルス属菌
株（徴工研菌寄第５８５４号）を接種し、３０℃で２日
間振鶴培養した。

培養後、遠心分離機で除菌し、得られた上燈液について
、生産されたアミラーゼＧ３を測定した結果、培地肌【
当り８０．＄単位であった。そして、同時に生産された
Ｑ‐１．６−グルコシダーゼは培地の‘当り１１．９単
位であった。培養上燈液に硫安を６０％飽和になるよう
に加えて、沈澱区分を集め、乾燥保存した。本酵素剤に
はアミラーゼＧ３の他にプルラナーゼが存在しているの
で、アミラーゼＧ３は次の操作で精製した。

前記酵素剤を水に溶解後、遠心分離した上燈液について
、蒸留水に対して透析後、２．５×１０‐３Ｍトリス緩
衝液で緩衝化したＤＥＡＥーセフアロースカラムに吸着
、同緩衝液で洗液後、同緩衝液を含むＫＣＩ溶液で０〜
０．８Ｍまでリニャーグラジェントにより溶出した。こ
の結果、プルラナーゼを含まないアミラーゼＧ３を得る
ことができた。硫安沈澱物からの収量は約３０％であっ
た。該精製酵素液３．３単位をＤＥ４．３の液化澱粉溶
液（固形分５０奴）に加え、塩化カルシウムを５×１０
‐３Ｍ添加し、全量１の‘として５０ｑｏで反応させた
。

得られた糖化物の一部をペーパークロマトグラフ法によ
り３重展開（溶媒：ピリジン／ｎーフタノール／水＝４
／６／３）後、各糖区分を切抜き、水で抽出後、フェノ
ール一硫酸法により定量した。その結果、グルコース２
．８％、マルトース１２．１％、マルトトリオース５５
．３％、マルトテトラオース４．４％、その他のオリゴ
糖２５．４％であった。実施例 ２ 実施例１において、培地としてＫ２ＨＰ０４０．３％、
ＭｇＳ０４・７日２００．１％、魚肉エキス３％、可溶
性澱分２％、ＭｎＣ１２２．５×１０‐６Ｍ、ＣａＣ１
２１×１０‐３Ｍ、ＺｎＳ０４１×１０‐４Ｍ、ＣｕＳ
０４５×１０‐５Ｍを含む液体塔地を使用し、３０ｑｏ
で４日間振濠培養した。

その結果、生産されたアミラーゼＧ３は培地肌当り１５
２．４単位であった。又、同時に生産されたプルラナ−
ゼは培地凧【当り１７．３単位であった。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ、ｂ、ｃとｄは、それぞれバシルス属アミラー
ゼＧ３の最適解、最適温度、熱安定性とｐＨ安定性を示
している。 第２図ａ、ｂ、ｃとｄは、それぞれバシルス属Ｑ‐１．
６ーグルコシダーゼの最適ｐＨ、最適温度、熱安定性と
苗安定性を示している。汐’鼠 次Ｚ欄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バシルス属に属しアミラーゼＧ３を生産する微生物
   を培養し、培養物からアミラーゼＧ３を採取することを
   特徴とするバシルス属アミラーゼＧ３の製造法。 ２ バシルス属に属し、アミラぜゼＧ３とα−１．６−
   グルコシダーゼを同時に生産する微生物を培養し、培養
   物からアミラーゼＧ３とα−１．６−グルコシダーゼを
   採取することを特徴とするバシルス属アミラーゼＧ３と
   α−１．６−グルコシダーゼの製造法。