JPS60227676A - 複合酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はでん粉をマルトテラオースとマルトペンタオー
スを主成分とする糖化物に分解するアミラーゼとプルラ
ナーゼとの複合酵素の製造法に関するものである。

従来、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミ
ラーゼ、グルコアミラーゼなどでん粉に対する分解様式
を異にする種々のアミラーゼが知られ、グルコースやマ
ルトースの製造に利用されてきた。そして、最近は、よ
り分子量の大きい、例えば、マルトトリオース（Ｇ３）
、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（
Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）などのオリゴ糖製
造技術の開発が要望されている。これらの糖は食品の甘
味料、増量剤、賦形剤、包接剤として食品、薬品及び種
々の工業品に広く利用できると考えられているが、未だ
製法は確立されていない。

本発明者は、これらオリゴ糖生産能の強い微生物をめて
、広く土壌中より微生物の検索を行ってきた結果、ハシ
ルス属の微生物が、でん粉をマルトテトラオース（Ｇ４
）とマルトペンタオース（Ｇ５）を主成分とする糖化物
に分解するアミラーゼを菌体外に著量に生産することを
認めた。

マルトテトラオースを生成する酵素としては、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｚｅｒｉの生産するアミラーゼ
が、゛アミロースやアミロペクチンの非還元性末端から
マルテとラオースを生成することが知られている｛Ａｒ
ｃｈｉｖｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　第１４５巻、１０５〜１１４頁
（１９７１）｝が、この酵素はマルトペンタオースを生
成しない。

一方、マルトペンタオースを生成するアミラーゼとして
は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの
生産する耐熱性α−アミラーゼがでん粉からＧ５を主成
分とする糖化物を生産することが報告されているがこの
酵素のマルトテトラオースの生成能はマルトペンタオー
スの生成能に比べ著しく少なく１／４程度である。また
、この酵素は６１〜６１２め各成分も同時に生成する酵
素である（　Ａｒｃｈｉｖｅ　ｏＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ第１５５巻、
２９０〜２９８　（１９７３）Ｌ、この他、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラーゼもでん粉か
らマルトテトラオースやマルトペンタオースを含んだ種
々の糖混合物を生成するが−、マルトテトラオースやマ
ルトペンタオースを主成分をなすものではないために、
これら糖の製造には適していない。

しかるに、本発明のアミラーゼにより生産されるでん粉
分解物の糖組成は、使用するでん粉のＤＥや糖化時の反
応条件によっても異なる（でん初濃度、反応時のｐＨ３
酵素量によっても少し変動し、また、フル１〜ペンタオ
ースは反応時間が長くなると、次第にマルトースとマル
トトリオースに分解する）が、通常、マルトテトラオー
スが１５〜３５％、そしてマルトペンタオースが１５〜
３０％を占めており、これら糖の合計は３０〜６０％に
達する。

すなわち、本発明の生産するアミラーゼはアミロース、
アミロベクチン、でん粉などからマルトテトラオースと
マルトベンタオースの単位で分解し、マルトテトラオー
スとマルトベンタオースを主成分とする糖化物を生成す
るアミラーゼであり、この様な特徴のある酵素はいまま
で知られておらず、全く新規な酵素である。本発明者は
この酵素をアミラーゼＧ４、５と命名した。以下に本酵
素の酵素的性質を記載する。

本酵素の酵素的性質は下記にしめす通りである。

（１）作用；でん粉、アミロース、アミロペクチン、デ
キストリンなどのグルカンをマルトテトラオースとマル
トペンタオースの単位で分解し、これら糖を主成分とす
る糖化物を生成する。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は５０〜５５°Ｃ（］％でん初濃度
、最適作用ｐＨで３０分間反応）。

（３）最適ｐＨ範聞及び最適作用ｐｆ（；ｐＨ４，５〜
１１の範囲に作用最適作用ｐＨは６．５〜７．５゜ （４）熱安定性；ｏ、０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，０
＞の存在下で加熱した場合５０℃、１０分間の加熱で７
０〜９０％失活する。

（５）ｐＨ安定性；０．０５Ｍ緩衝液で、室温で３時間
放置後、残存活性を測定した。その結果ｐＨ約６〜約１
０の範囲で安定であった。

（６）安定化；カルシウムイオンの存在により熱安定性
の増加が認められた。

（７）阻害剤：本酵素は５×１０−３ＭのＨｇＣｌ２、
ＺｎＳＯ４、ＦｅＳＯ４ＣｏＣｌ２、ＡｇＮＯ３などに
より９５％以上失活した。

（８）生成方法及び分子量；本酵素は液体培養物の濾液
から、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマ
トグラフィー（ＫＣｌ０．２〜０．６Ｍでグラジェント
溶出）、セファディツクスＧ２００カラムクロマトグラ
フィーとセファティックス０１００カラムクロマトグラ
フイーにより分子量が約４万と約１１万の２つのアイソ
マー分離されるが、通常、分子量の小さい成分が主成分
を占めている。そして、両者の酵素的性質には大きな差
は認められない。

（９）力価測定法；０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解させた
１％可溶性でん粉液（Ｔ）Ｉ（７，Ｏ）　０．　５　ｍ
ｌに適量の酵素を加え、水で全量１ｍｔａとし、４０℃
で反応させる。この条件で１時間に１■のグルコースに
相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

また、本菌株は前記のアミラーゼＧ４．５と同時に以下
に示されるプルラナーゼを同時に生産する。

（１）作用；プルランに存在するα−１，６−グルコシ
ド結合を分解し、マルトトリオースを生成する。また、
でん粉、アミロペクチン、グリコーゲン又はその派生物
のα−１，６グルコシド結合を分解する。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は５０〜５５℃（１％プルラン、０
．０５Ｍ）リス緩衝液のもとて３０分間反応）。

（３）作用ｐＨ範聞及び最適作用ｐＨ；ｐＩ（約５〜約
９の範囲に作用し、最適作用ｐＨは７付近にある（１％
プルラン、０．０５Ｍトリス緩衝液の下で４０℃で反応
）。

（４）熱安定性ｉ０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，０
）のもとで、各温度で１０分間加熱後、残存活性を測定
した。その結果、５０℃、１０分間の加熱で約７３％失
活し、５５℃、１０分間の加熱で約９７％失活した。

（５）ｐＨ安定性、　ｐ　Ｈ約６〜約９で安定（０，１
Ｍ酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液の下で、温室（２５℃）
で放置後、残存活性を測定）。

（６）阻害剤；本酵素はＣｕ”、Ｚｎ”、Ａｇ”　、ｌ
１ｇ”、ｐｅ　２　＋などにより強く阻害される。

（７）安定化；カルシウムイオンは本酵素の熱安定性を
増加する。

（８）精製方法；本酵素は培養濾液から硫安分画、ＤＥ
ＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー（ＫＣｌ
ｏ、２〜０．５Ｍでグラジェント溶出することにより、
アミラーゼＧ４．５と分離でき、その後、セファデック
スＧ−２００カラムクロマドグラフィーによりクロマト
的に均一まで精製できる。

（９）分子量；セファデックスＧ−２００ゲル濾過法に
よる分子量は約７万であった。

（１０）力価測定法；０．１Ｍリン緩衝液に溶解させた
１％プルラン液（ｐＨ７，０）　０．　５１１１７！に
適量の酵素を加え、水で全量１ｍｌとし、４０℃で反応
させる。この条件で１時間に１■のマルトトリオースに
相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

本複合酵素を生産するバシルス属菌の例示菌としてバシ
ルス　サーキュランスＧ　４’　５を挙げる。本菌株の
菌額適性質は下記の通りであり、本菌株は微工研菌寄第
６２３７号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。

（１）形態；桿菌、大きさ、巾０．７〜０．８μ×長さ
２．５〜５μ、２〜３個連なったものが多い。非運動性
、グラム陰性。

（２）胞子；胞子嚢細胞はふくらみ、球形〜楕円形の胞
子を形成する。

（３）ゼラチン；液化する。

（４）肉汁寒天；生育良好、黄味がかった薄褐色（５）
グルコース肉汁寒天：生育不良、淡黄色（６）グルコー
ス硝酸塩寒天： （７）肉汁；わずかに混濁、白濁、沈降する（８）食塩
肉汁；１〜１０％食塩濃度でも生育、１〜５％で生育促
進（９）ミルク；分解力強くないが、凝固、その後ペプ
トン化する、リトマス還元 （１０）ポテト；生育普通、色素の生成なし（１１）チ
ロシン寒天；生育かなり良好、淡黄色、チロシナーゼ陰
性（１２）グルコース−アスパラギン寒天；殆ど生育し
ない（１３）インドール；生成しない （１４）アセチルメチルカルビノール；生成しない（１
５）硫化水素；弱いが生成する （１６）硝塩酸の還元；陽性 （１７）ウレアーゼ；生成しない （１８）カタラーゼ；陽性 （１９）電粉の加水分解；陽性 （２０）淡水化物の利用；グルコース、フラクトース、
マンノース、ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラ
ビノース、シュークロース、マルトース、Ｌ−ソルボー
ス、マンニトール、でん粉ヲ利用、生成するが、ガスの
発生なし。ラクトース、ラフイノース、ソルビット、イ
ヌリンから生酸は弱いが、殆どなし（２１）メチレンブ
ルー；還元する （２２）クエン酸；利用しない （２３）生育温度；最適生育温度は約３０℃、最高生育
温度は５０〜５７℃ （２４）死滅温度；１００℃で１０分間加熱しても死滅
しない（２５）最適生育ｐＨ；７．５〜８．５以上の菌
額適性質について、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ
　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ　の第７版及び第８版（Ｔｈｅ　ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ１９５７年
及び１９７４年）を参照し、本微生物はバシルス　サー
キュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　
）に近縁の微生物であると同定した。

本菌かぷはプルラナーゼを同時に生産する能力がありこ
の酵素がアミロペクチンの分岐結合であるα−１，６−
グルコシド結合を分解するため、でん粉やアミ、ロペク
チンなど分岐結合のある基質に対し、アミラーゼＧ４．
５と共同して作用してマルトテトラオースとマルトペン
タオースを収量よく生産するのに重要な役割をしている
。

本発明による酵素生産のための培養は、通常、用いられ
る固体培地または液体培地が使用され、液体培養のため
の培地の窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン、コーンステイープリカーなどまた炭素
源としては、でん粉、デキストリン、マルトース、グル
コース、シュクロースなどが使用され、そして、これに
補足する栄養源として、無機窒素源、リン酸塩、マグネ
シウム塩、金属塩を含む培地が使用される。培養はｐＨ
６〜９、温度２５〜５５℃で、通気培養により行われる
。

アミラーゼＧ４５は菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過膜または遠心分離して除菌し、上澄
液を回収する。そして、必要に応じ、濃縮、硫安、硫酸
ナトリウムなどによる塩折によるか、又は、アセトン、
エタノール、メタノール、イソプロパツールなどの有機
溶剤を加えて、酵素を沈澱物として収得、乾燥、保存す
る。

本酵素によるでん粉の糖化は、通常５〜４０％の液化で
ん粉に添加し、ｐＨ６〜９、温度４０〜６０℃でおこな
われる。

次ぎに実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 培地として、ポリペプトンＳ（大豆製）４％、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４０，３％、Ｍｇ５Ｏａ・７１１２００．　１％、可
溶性でん粉１％、硫酸アンモニウム０．１％と塩化コバ
ルト２．５Ｘ１０−’Ｍを含む培地を常法により殺菌後
、バシルス・サーキュランスＧ４５（ｍ工研菌寄第６２
３７号）を接種し、３０℃で２ヶ日間振盪培養した。培
養後、遠心分離機で除菌し、得られた上澄液について、
アミラーゼＧ４５とプルラナーゼ活性を測定した。その
結果、生産されたアミラーゼＧ４，５は培地ｌ当たり２
４．２単位であった。

又、同時に生産されたブルラナーゼは培地１ｍｌ当たり
０．５単位であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ハシルスに属しアミラーゼＧ４．５とプルラナーゼを同
   時に生産する微生物を培養し、培養物からアミラーゼＧ
   ４．５とプルラナーゼからなる複合酵素を採取すること
   を特徴とするバシルス属によるアミラーゼＧ４、５とプ
   ルラー是からなる複合酵素の製造法。