JPS6170985A - 新規オリゴ−１，６−グルコシダ−ゼおよびその製法 - Google Patents
新規オリゴ−１，６−グルコシダ−ゼおよびその製法Info
- Publication number
- JPS6170985A JPS6170985A JP19260084A JP19260084A JPS6170985A JP S6170985 A JPS6170985 A JP S6170985A JP 19260084 A JP19260084 A JP 19260084A JP 19260084 A JP19260084 A JP 19260084A JP S6170985 A JPS6170985 A JP S6170985A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- glucosidase
- oligo
- isomaltose
- acts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（イソマ
ルターゼ）およびその製造法に関する。
ルターゼ）およびその製造法に関する。
近年、単糖と多糖の挟間にあって開発・利用の遅れてい
たマルトオリゴ糖が注目されるようになり、その用途と
して臨床検査での血中アミラーゼ □測定基質、化
学合成原料２食品素材、生化学用試薬などが挙げられて
いる。そこで、各種マルトオリゴ糖生産酵素を用いたマ
ルトオリゴ糖の製造が行なわれている。これらの製造に
用いられている原料は澱粉、可溶性澱粉などであるが、
澱粉、可溶性澱粉を直接用いると、分子内にα−１，４
結合以外にα−１，６結合があるため、分岐オリゴ糖が
副生じ、しかも現行の各種カラムクロマトグラフィーで
は目的とするオリゴ糖と同じ重合度の分岐オリゴ糖を分
離できない。そのため、高純度マルトオリゴ糖を生産す
る場合、澱粉、可溶性澱粉にまずプルラナーゼを作用さ
せて短鎖アミロースとし、このアミロースにマルトオリ
ゴ糖生産酵素を作用させているが、完全には枝切りがで
きないことと、生成したアミロースの老化の問題などに
より相対的に製造費が高くなっている。そこで、プルフ
ーゼを使用しない方法として、澱粉、可溶性澱粉にマル
トオリゴ糖生産酵素を作用させつつ、副生ずる分岐オリ
ゴ糖を分解する方法が考えられ、その目的のためにはオ
リゴ−１，６−グルコシダーゼを併用すればよい′。し
かし、従来純化され性質の明らかとなっている微生物由
来のオリゴ−１，６−グルコシダーゼは至適温度が４０
℃以上のものしか知られていない（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｅｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ。
たマルトオリゴ糖が注目されるようになり、その用途と
して臨床検査での血中アミラーゼ □測定基質、化
学合成原料２食品素材、生化学用試薬などが挙げられて
いる。そこで、各種マルトオリゴ糖生産酵素を用いたマ
ルトオリゴ糖の製造が行なわれている。これらの製造に
用いられている原料は澱粉、可溶性澱粉などであるが、
澱粉、可溶性澱粉を直接用いると、分子内にα−１，４
結合以外にα−１，６結合があるため、分岐オリゴ糖が
副生じ、しかも現行の各種カラムクロマトグラフィーで
は目的とするオリゴ糖と同じ重合度の分岐オリゴ糖を分
離できない。そのため、高純度マルトオリゴ糖を生産す
る場合、澱粉、可溶性澱粉にまずプルラナーゼを作用さ
せて短鎖アミロースとし、このアミロースにマルトオリ
ゴ糖生産酵素を作用させているが、完全には枝切りがで
きないことと、生成したアミロースの老化の問題などに
より相対的に製造費が高くなっている。そこで、プルフ
ーゼを使用しない方法として、澱粉、可溶性澱粉にマル
トオリゴ糖生産酵素を作用させつつ、副生ずる分岐オリ
ゴ糖を分解する方法が考えられ、その目的のためにはオ
リゴ−１，６−グルコシダーゼを併用すればよい′。し
かし、従来純化され性質の明らかとなっている微生物由
来のオリゴ−１，６−グルコシダーゼは至適温度が４０
℃以上のものしか知られていない（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｅｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ。
４４５、３８６ （１９７６）、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ５！６６ 。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ５！６６ 。
６２ （１９７９）、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、Ａｃｔａ、 ７０４．４７６（１９８２）、昭和
５８年Ｉ！日本農芸化学会講演要旨集Ｐ４８８］。
ｙｓ、Ａｃｔａ、 ７０４．４７６（１９８２）、昭和
５８年Ｉ！日本農芸化学会講演要旨集Ｐ４８８］。
したがって、マルトオリゴ糖生産酵素の至適温 ゛度、
安定温度が４０℃以下である場合、従来のオリゴ−１，
６−グルコシダーゼではその要請に十分に応じることが
できない（例えば特開昭５８−１４２３３０号）。
安定温度が４０℃以下である場合、従来のオリゴ−１，
６−グルコシダーゼではその要請に十分に応じることが
できない（例えば特開昭５８−１４２３３０号）。
そこで本発明者らは、３０℃以下の温度でも十分に活性
を有するオリゴ−１，６−グルコシダーゼを検索すべく
研究を重ねた結果、本発明者らが土壌より分離したバチ
ルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｃｅｒｅｕｓ−）
ＮＹ−１４を好気的に培養することにより、３０℃以
下の温度でも十分に活性を有するオリゴ−１，６−グル
コシダーゼが菌体内に生産・蓄積されることを見出し、
この知見に基いて本発明を完成したのである。
を有するオリゴ−１，６−グルコシダーゼを検索すべく
研究を重ねた結果、本発明者らが土壌より分離したバチ
ルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｃｅｒｅｕｓ−）
ＮＹ−１４を好気的に培養することにより、３０℃以
下の温度でも十分に活性を有するオリゴ−１，６−グル
コシダーゼが菌体内に生産・蓄積されることを見出し、
この知見に基いて本発明を完成したのである。
本発明は、第１に下記の性質を有する新規オリ：ｌ”−
１，６−グルコシダーゼに関する。
１，６−グルコシダーゼに関する。
（１）１％イソマルトース０．０５ ＩＩＬｌおよび本
酵素Ｃ３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８６）、５ ｍ
Ｍ ］１ｉＤＴＡ含有） ｏ、１ｔｄを３０分間作用さ
せたとき至適温度が２１℃付近に存在する。
酵素Ｃ３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８６）、５ ｍ
Ｍ ］１ｉＤＴＡ含有） ｏ、１ｔｄを３０分間作用さ
せたとき至適温度が２１℃付近に存在する。
（２） 本酵素はイソマルトース、イソマルトトリオ
ース、パノース、パラニトロフェニル−α−グルコピラ
ノシドに作用し、マルトース、マルトトリオース、マル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオース、インパノース、可溶性澱粉
、アミロペクチン、デキストリン、プルランには作用し
ない。
ース、パノース、パラニトロフェニル−α−グルコピラ
ノシドに作用し、マルトース、マルトトリオース、マル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオース、インパノース、可溶性澱粉
、アミロペクチン、デキストリン、プルランには作用し
ない。
（３）本酵素は３０℃にて田６．２〜７．３が至適であ
り、ＰＨ７，５〜８付近で安定である。
り、ＰＨ７，５〜８付近で安定である。
（４） 本酵素はＦ４（６，２以下および州９．１以
上にて４℃で２４時間放置すると失活する。また、４０
℃では３０分間の加熱により失活する。
上にて４℃で２４時間放置すると失活する。また、４０
℃では３０分間の加熱により失活する。
（５） 本酵素の至適−は６．２〜７．２である。
（６） 本酵素の分子量は約ｓ １．００ ｏ （５
Ｄ８−アクリルアミドゲル電気泳動による）である。
Ｄ８−アクリルアミドゲル電気泳動による）である。
第２の本発明は、バチルス属に属し、上記の性質を有す
る新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼ生産能を有する
微生物を培養し、菌体内に該オリゴ−１，６−グル；シ
ダーゼを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼの製造法である。
る新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼ生産能を有する
微生物を培養し、菌体内に該オリゴ−１，６−グル；シ
ダーゼを蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼの製造法である。
本発明の新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼの生産菌
として用いられる微生物はバチルス属に属し、上記した
性質を有するオリゴ−１，６−グルコシダーゼを生産す
る能力を有するものであればよく、たとえば本発明者ら
が土壌中から分離したバチルス・セレウスＮＹ−１４が
あげられる。本菌の口字的性質は次に示す通りである。
として用いられる微生物はバチルス属に属し、上記した
性質を有するオリゴ−１，６−グルコシダーゼを生産す
る能力を有するものであればよく、たとえば本発明者ら
が土壌中から分離したバチルス・セレウスＮＹ−１４が
あげられる。本菌の口字的性質は次に示す通りである。
■ 形態的性質
■ 細胞の形および大きさ
０．５％塩化ナトリウム肉汁培地に３０°Ｃ１−２４時
間好気的に培養した細胞は１μ×３．０〜４．０μの長
桿菌で単独または２個から多い時は５〜６個連鎖して存
在する。
間好気的に培養した細胞は１μ×３．０〜４．０μの長
桿菌で単独または２個から多い時は５〜６個連鎖して存
在する。
■ 正動性の有無
運動性は無い。鞭毛も無い。
■ 胞子の形成
有り。０．７〜０．８μの楕円形で、中央または中央に
近い所にある。胞子のう細胞はふ（らまない。
近い所にある。胞子のう細胞はふ（らまない。
■ ダラム染色性
陽性である。
■ 各種培地における生育状態
■ 肉汁寒天平板培！！（３０℃、４８時間）集落は拡
張性で表面は平らで粗く、また周縁は耳状で灰色がかっ
た白色。
張性で表面は平らで粗く、また周縁は耳状で灰色がかっ
た白色。
■ 肉汁寒天斜面培養（３０℃、４８時間）生育は豊か
で粗く、不透明、拡張性で周縁生育は裂状。粘着性は無
い。
で粗く、不透明、拡張性で周縁生育は裂状。粘着性は無
い。
■ 肉汁穿刺培養（３０℃、５日間）
生育は表面−面に厚く、また穿刺線に沿ってのみ生育す
る。
る。
■ 肉汁液体培養（３０℃、５日間）
生育は良好で、液は透明で沈査ができ、菌膜は産生ぜず
、くずれやすい菌膜を形成する。
、くずれやすい菌膜を形成する。
色素は生成しない。
■ ０．５％塩化ナトリウム肉汁寒天平板培養（３０℃
、４８時間） 集落の形は不規則で表面は平らで粗く、また周縁は耳状
で灰色がかった白色。コンマの形をした集落はない。
、４８時間） 集落の形は不規則で表面は平らで粗く、また周縁は耳状
で灰色がかった白色。コンマの形をした集落はない。
■ ０．５％塩化す） ＩＪウム肉汁寒天斜面培養（３
０℃、４８時間） 生育は豊かで粗く、不透明、拡張性で周縁生育は裂状。
０℃、４８時間） 生育は豊かで粗く、不透明、拡張性で周縁生育は裂状。
粘着性は無い。
■ ０．５％塩化ナトリウム肉汁穿刺培養（３０℃、５
日間） 生育は表面−面に厚く、また穿刺線に沿ってのみ生育す
る。
日間） 生育は表面−面に厚く、また穿刺線に沿ってのみ生育す
る。
■ ０．５％塩化す） ＩＪウム肉汁液体培養（３０℃
、５日間） 生育は良好で液は濁り、沈査ができる。菌膜１色素は産
生じない。
、５日間） 生育は良好で液は濁り、沈査ができる。菌膜１色素は産
生じない。
■ ミルク寒天平板培養（３０°Ｃ９２４時間）カゼイ
ンの水解帯は広い。
ンの水解帯は広い。
Ｏ肉汁ゼラチン穿刺培養（２０℃、７日間）噴火状ない
し層状に迅速に液化する。
し層状に迅速に液化する。
■ 生理学的性質
■ 硝酸塩の還元 ：還元する
■ ＶＰテスト ニアセチルメチルカルビノー
ルを生ずる ■ ＭＲテスト ＝ＶＩ７Ｉ性■ クエン酸の
利用 ：利用する ■ インドールの生成 ：生成しない ■ 硫化水素の生成 ：生成する ■ アンモニアの生成 ；生成する ■ ミルクに対する作用：凝固する ■ カタラーゼ ：＠性 ■ 生育の範囲 ：Ｆ４（５，２〜１０，２．温度
７〜３７℃ ■ 酸素に対する態度：好気性、嫌気性条件下でグルコ
ースに生育する。
ルを生ずる ■ ＭＲテスト ＝ＶＩ７Ｉ性■ クエン酸の
利用 ：利用する ■ インドールの生成 ：生成しない ■ 硫化水素の生成 ：生成する ■ アンモニアの生成 ；生成する ■ ミルクに対する作用：凝固する ■ カタラーゼ ：＠性 ■ 生育の範囲 ：Ｆ４（５，２〜１０，２．温度
７〜３７℃ ■ 酸素に対する態度：好気性、嫌気性条件下でグルコ
ースに生育する。
００−Ｆテスト ：嫌気的にも糖（グルコース）を分
解して酸を生成する。
解して酸を生成する。
０ サブロー・デキストロース培養液／寒天斜面培養で
の生育 ：生育する ■ 糖類から酸およびガスの生成の有無：Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、マンニトール
、Ｄ〜ラフィノース、グリセロール、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−マンノース、乳糖、ショ糖には生育しない。
の生育 ：生育する ■ 糖類から酸およびガスの生成の有無：Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、マンニトール
、Ｄ〜ラフィノース、グリセロール、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−マンノース、乳糖、ショ糖には生育しない。
可溶性澱粉、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、トレ
ハロニス、サリシン、 麦芽糖に生育して酸を生成する
が、ガスの発生はない。
ハロニス、サリシン、 麦芽糖に生育して酸を生成する
が、ガスの発生はない。
［相］ ０．００１％リゾチーム中での生育：生育する
［相］ ０．０２％アザイド中での生育：生育する０
７％食塩中での生育 ：生育する以上に示した性
質をパージエイズ・マニュアル・オブ・デターミナテイ
ブ・バクテリオロジー第８版（１９７４年） （Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ′ｏｆ Ｄｅｔｓｒｍｆ−
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８ｔｈ ｅ
ｄ、 １９７４ ） Ｋ照合すると、本菌はバチルス・
セレウスに属しており、本発明者らは本菌をバチルス・
セレウスＮＹ−１４と命名した。本菌は工業技術院微生
物工業技術研究所にＦｌｉ：ＲＭ Ｐ−６６４８（ＦＥ
ＲＮ ＢＰ−３２９）として寄託されている。なお、前
述した如く、本発明において使用する微生物はバチルス
属に属し、上記した性質を有するオリゴ−１，６−グル
コシダーゼの生産能力を有するものであればよく、バチ
ルス・セレウスＮＹ−１４およびその変種、変異種に限
定されるものではない。
［相］ ０．０２％アザイド中での生育：生育する０
７％食塩中での生育 ：生育する以上に示した性
質をパージエイズ・マニュアル・オブ・デターミナテイ
ブ・バクテリオロジー第８版（１９７４年） （Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｎｕａｌ′ｏｆ Ｄｅｔｓｒｍｆ−
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８ｔｈ ｅ
ｄ、 １９７４ ） Ｋ照合すると、本菌はバチルス・
セレウスに属しており、本発明者らは本菌をバチルス・
セレウスＮＹ−１４と命名した。本菌は工業技術院微生
物工業技術研究所にＦｌｉ：ＲＭ Ｐ−６６４８（ＦＥ
ＲＮ ＢＰ−３２９）として寄託されている。なお、前
述した如く、本発明において使用する微生物はバチルス
属に属し、上記した性質を有するオリゴ−１，６−グル
コシダーゼの生産能力を有するものであればよく、バチ
ルス・セレウスＮＹ−１４およびその変種、変異種に限
定されるものではない。
本発明の新規オリゴ−１，６−グルコシダーゼを生産す
るための微生物の培養は通常の微生物が利用し得る栄養
物を含有する培地で行なう。具体的には、新規オ・リボ
−１，６−グルコシダーゼの生産のためには、α−１，
４−グルコシド結合を含むポリサッカライドまたはオリ
ゴサツカライド、たとえば各種澱粉、アミロペクチン、
アミロース、デキストリン、マルトヘキサオース等が必
要である。
るための微生物の培養は通常の微生物が利用し得る栄養
物を含有する培地で行なう。具体的には、新規オ・リボ
−１，６−グルコシダーゼの生産のためには、α−１，
４−グルコシド結合を含むポリサッカライドまたはオリ
ゴサツカライド、たとえば各種澱粉、アミロペクチン、
アミロース、デキストリン、マルトヘキサオース等が必
要である。
したがって、バチルス・セレウスＮＹ−１４の培地には
これらポリサッカライドまたはオリゴサツカライドの１
種またはそれ以上と菌の生育に必要な他の成分、たとえ
ば有機・無機の窒素源；有機・無機の塩類；ビタミン等
を適宜含有するものが使用される。
これらポリサッカライドまたはオリゴサツカライドの１
種またはそれ以上と菌の生育に必要な他の成分、たとえ
ば有機・無機の窒素源；有機・無機の塩類；ビタミン等
を適宜含有するものが使用される。
本発明で用いる微生物の培養条件については、使用する
菌等によって異なるが、目的とする新規オリゴ−１，６
−グルコシダーゼの生産量が最大になるように選定すべ
きであり、具体的にはバチルス・セレウスＮＹ−１４株
の場合、培地の田を８．０゜培養温度は３０℃，培養時
間は２４時間程度が適当であり、好気的培養を行なう。
菌等によって異なるが、目的とする新規オリゴ−１，６
−グルコシダーゼの生産量が最大になるように選定すべ
きであり、具体的にはバチルス・セレウスＮＹ−１４株
の場合、培地の田を８．０゜培養温度は３０℃，培養時
間は２４時間程度が適当であり、好気的培養を行なう。
培地に加えるポリサッカライドまたはオリゴサツカライ
ドの量は、たとえば可溶性澱粉の場合、０．５〜ｌＯ％
の範囲が有効である。
ドの量は、たとえば可溶性澱粉の場合、０．５〜ｌＯ％
の範囲が有効である。
培養終了後、菌体かも新規オリゴ−１，６−グルゴＳノ
Ｊ−−Ｊ＋’ルｔ５！旨、！−訓ナスｔけ四軸の摘島？
ｒす法を組合せて行なうことができる。、たとえば、−
過、遠心分離等の適当な手段によって培養物から菌体を
得、該菌体よりオリゴ−１，６−グルコシダーゼを抽出
後、硫安分画、ゲルー過やイオン交換などのクロマトグ
ラフィー等にかけてオリゴ−１，６−グルコシダーゼの
精製品を得ることができ毬。
Ｊ−−Ｊ＋’ルｔ５！旨、！−訓ナスｔけ四軸の摘島？
ｒす法を組合せて行なうことができる。、たとえば、−
過、遠心分離等の適当な手段によって培養物から菌体を
得、該菌体よりオリゴ−１，６−グルコシダーゼを抽出
後、硫安分画、ゲルー過やイオン交換などのクロマトグ
ラフィー等にかけてオリゴ−１，６−グルコシダーゼの
精製品を得ることができ毬。
このようにして得られるオリゴ−１，６−グルコシダー
ゼは以下のような性質を有してイル。
ゼは以下のような性質を有してイル。
（１）基質特異性
本酵素はイソマルトース、イソマルトトリオース、パノ
ース、ハラニトロフェニル−α−グルコピラノシドに作
用し、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオ
ース、マルトペンタオース。
ース、ハラニトロフェニル−α−グルコピラノシドに作
用し、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオ
ース、マルトペンタオース。
マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、可溶性澱粉
、アミロペクチン、デキストリン、プルランには作用し
ない。
、アミロペクチン、デキストリン、プルランには作用し
ない。
（２）至遠田、および安定一
本酵素は３０℃にて…６．２〜７．３が至適であり、Ｆ
Ｉ′１７．５〜８で安定である。田値とアミラーゼ活性
との関係は第１図に示す如くであり、その活性測定法は
以下の条件下で下記３に示す力価、測定法にしたがった
。
Ｉ′１７．５〜８で安定である。田値とアミラーゼ活性
との関係は第１図に示す如くであり、その活性測定法は
以下の条件下で下記３に示す力価、測定法にしたがった
。
測定条件：温度３０℃、川５では０．５ Ｍ酢酸緩衝液
、ｐｌ（６〜８では０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９では
帆５Ｍトリス緩衝液を使用した。
、ｐｌ（６〜８では０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９では
帆５Ｍトリス緩衝液を使用した。
（３）力価測定法
１％イソマルトース０．０５１ｄに対し酵素液０．１”
Ａ’（５０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ６，８６） ５
ｍＭ ）ｉｉＤＴＡ含有〕を加えて３０℃で適当時間作
用させた後、３分間沸騰水浴中で加熱した後、生成した
グルコースをＰａｐａｄｏｐｏｕｌａｓ ｅｔ ａｌ
の方法（還元糖の定量法、Ｐ１３９：学会出版センタ
ー）で定量し、１分間に１μｍｏｌのグルコシド結合を
切断する酵素量を１単位とした。
Ａ’（５０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ６，８６） ５
ｍＭ ）ｉｉＤＴＡ含有〕を加えて３０℃で適当時間作
用させた後、３分間沸騰水浴中で加熱した後、生成した
グルコースをＰａｐａｄｏｐｏｕｌａｓ ｅｔ ａｌ
の方法（還元糖の定量法、Ｐ１３９：学会出版センタ
ー）で定量し、１分間に１μｍｏｌのグルコシド結合を
切断する酵素量を１単位とした。
（４）作用適温の範囲
本酵素の至適温度は第２図に示した如く、−６，８６で
２１℃付近にある。なお、温度とオリゴ−１，６−グル
コシダーゼ活性との関係の測定は反応温度１５〜６０℃
に変化させたこと以外は上記（３）の測定法にしたがっ
た。
２１℃付近にある。なお、温度とオリゴ−１，６−グル
コシダーゼ活性との関係の測定は反応温度１５〜６０℃
に変化させたこと以外は上記（３）の測定法にしたがっ
た。
（５） １．温度などによる失活の条件本酵素は田６
．２以下および１）ｔ（９，１以上にて４℃で２４時間
放置すると失活する。また、４０℃では３０分間の加熱
により失活する。
．２以下および１）ｔ（９，１以上にて４℃で２４時間
放置すると失活する。また、４０℃では３０分間の加熱
により失活する。
（６） 阻害および活性化
本酵素の各種金属イオン（最終０度Ｉ Ｘ １０−’Ａ
１）に対する影響（３０℃、１０分間処理）を第１表に
示す。表から明らかなように、コバルト。
１）に対する影響（３０℃、１０分間処理）を第１表に
示す。表から明らかなように、コバルト。
銅、水銀、亜鉛に阻害作用が認められた。また、バリウ
ム、カルシウム、 ＥＤ’Ｉ’Ａに活性化作用が認めら
れた。
ム、カルシウム、 ＥＤ’Ｉ’Ａに活性化作用が認めら
れた。
第 １ 表
金属化合物 相対活性（％）Ｍｇ０！、
１０５ Ｆｅ８０４１１０ ０ｏＣｊ、 ５９ Ｃｕｒｌ、 ４８ Ｈｇ０１． ７ ＢａＯｌ、 ’ １６９ＺｎＳＯ４２
８ ＣａＯ１１１１４０ ＥＤＴＡ １９３ （７） 精製方法 ２０１ジャーファーメンタ−による液体培養によって得
られた培養液を汗過して集菌し、菌体から５ ｍＭ Ｂ
Ｄ’ｌ’Ａを含む０．０５ Ｍリン酸緩衝液（田６．８
６ ）で酵素を抽出した液を粗酵素液として使用した。
１０５ Ｆｅ８０４１１０ ０ｏＣｊ、 ５９ Ｃｕｒｌ、 ４８ Ｈｇ０１． ７ ＢａＯｌ、 ’ １６９ＺｎＳＯ４２
８ ＣａＯ１１１１４０ ＥＤＴＡ １９３ （７） 精製方法 ２０１ジャーファーメンタ−による液体培養によって得
られた培養液を汗過して集菌し、菌体から５ ｍＭ Ｂ
Ｄ’ｌ’Ａを含む０．０５ Ｍリン酸緩衝液（田６．８
６ ）で酵素を抽出した液を粗酵素液として使用した。
粗酵素液を水冷し、０〜５℃に保ちながら硫安を添加し
、０．６から０．９飽和の間の沈でん両分を体数する。
、０．６から０．９飽和の間の沈でん両分を体数する。
得られた沈でんを少量の５０ ｍＲｉリン酸緩衝液（Ｆ
４（６，８６，５ｍＭ ＥＤ’ｌ’Ａ含有）に溶、
解後、０〜５℃の温度で同緩衝液で１昼夜透析膜で透析
を行なう。透析された酵素液中に生じた不溶物はさらに
遠心分離等によって除去する。次いで、本酵素を５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（Ｆ４（６，８６，１５ｍＭ ′ＥＤＴ
ム含有）により平衡化したＤＢＡ／Ｅ −８ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ａ −５０ｍカラム（カラム容積＝１．０ｃＩｒ
Ｌ×１７．５ｃＩＩＬ）に載せ、０．１ Ｍ Ｍａｉ
ｌを含む同緩衝液で洗浄後、０．３ Ｍ Ｎａ１ｌを含
む同緩衝液で酵素を溶出する。次に、活性画分を濃縮後
、５０ ｍＭ ！ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，８６，５ｍＭ
ＩＤＴＡ含有）により平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ ＨＷ５０Ｆカラム（カラム＝二！ｊ″二″″二ｊ：
：ニュ：７、二、−−ニニご、″、″２５Ｑｍカラム（
カラム容積： １．０ｃＷＬｘ １７ｃｍ）に載せ、Ｏ
−２Ｍ Ｍａｉｌを含む同緩衝液で洗浄後、０．２
Ｍ Ｍａｉｌ 〜０．３ Ｍ ＮａＣｊｌを含む同緩衝
液で溶出する。次に、活性画分を０．０５ Ｍ リン酸
緩衝液（Ｆ４（６，８６）で１昼夜透析後、同緩衝液で
平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（カラ、ム容
積： １−ＯｃＩＬＸ １６．５ ａｎ ）に載せ、同
緩衝液で洗浄後、０．１Ｍまでのリン酸緩衝液で溶出す
る。活性両分を濃縮後、５０ ｍＭＭ酢酸緩衝液 ）１
１６．８６．５ ｍｈ（ＩｆＤＴＡ含有）で平衡化した
５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −１００カラム（カラム容積：
１．５ｃｍＸ ４５ｃＩＩＬ）に負荷し、同緩衝液で
溶出する。このようＫして得られた活性画分は凍結乾燥
により粉末とする。
４（６，８６，５ｍＭ ＥＤ’ｌ’Ａ含有）に溶、
解後、０〜５℃の温度で同緩衝液で１昼夜透析膜で透析
を行なう。透析された酵素液中に生じた不溶物はさらに
遠心分離等によって除去する。次いで、本酵素を５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（Ｆ４（６，８６，１５ｍＭ ′ＥＤＴ
ム含有）により平衡化したＤＢＡ／Ｅ −８ｅｐｈａｄ
ｅｘ Ａ −５０ｍカラム（カラム容積＝１．０ｃＩｒ
Ｌ×１７．５ｃＩＩＬ）に載せ、０．１ Ｍ Ｍａｉ
ｌを含む同緩衝液で洗浄後、０．３ Ｍ Ｎａ１ｌを含
む同緩衝液で酵素を溶出する。次に、活性画分を濃縮後
、５０ ｍＭ ！ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，８６，５ｍＭ
ＩＤＴＡ含有）により平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ ＨＷ５０Ｆカラム（カラム＝二！ｊ″二″″二ｊ：
：ニュ：７、二、−−ニニご、″、″２５Ｑｍカラム（
カラム容積： １．０ｃＷＬｘ １７ｃｍ）に載せ、Ｏ
−２Ｍ Ｍａｉｌを含む同緩衝液で洗浄後、０．２
Ｍ Ｍａｉｌ 〜０．３ Ｍ ＮａＣｊｌを含む同緩衝
液で溶出する。次に、活性画分を０．０５ Ｍ リン酸
緩衝液（Ｆ４（６，８６）で１昼夜透析後、同緩衝液で
平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（カラ、ム容
積： １−ＯｃＩＬＸ １６．５ ａｎ ）に載せ、同
緩衝液で洗浄後、０．１Ｍまでのリン酸緩衝液で溶出す
る。活性両分を濃縮後、５０ ｍＭＭ酢酸緩衝液 ）１
１６．８６．５ ｍｈ（ＩｆＤＴＡ含有）で平衡化した
５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −１００カラム（カラム容積：
１．５ｃｍＸ ４５ｃＩＩＬ）に負荷し、同緩衝液で
溶出する。このようＫして得られた活性画分は凍結乾燥
により粉末とする。
上記の方法により精製された酵素はポリアクリルアミド
ゲルによる電気泳動で単一であった。
ゲルによる電気泳動で単一であった。
（８） 分子量
５Ｄ８−アクリルアミドゲル電気泳動（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、 ２６． ３
〜２７頁、 １９７２年）によると、本酵素は分子量
が約６１．０００である。
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、 ２６． ３
〜２７頁、 １９７２年）によると、本酵素は分子量
が約６１．０００である。
（９） ポリアクリルアミドディスク電気法−動ＣＢ
、 Ｊ、 Ｄａｖｉｓ＊ Ａｎｎ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、。
、 Ｊ、 Ｄａｖｉｓ＊ Ａｎｎ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、。
１２１ 、 Ａｒｔ ２．４０４ （１９６４） ）を
参考にしてトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８，３）中７
．５％の標準ゲルにて３ｍＡ／本で９０分間泳動し、そ
の後クマシーブルーにて染色すると、本酵素は第３図の
如く１つのバンドを示した。
参考にしてトリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８，３）中７
．５％の標準ゲルにて３ｍＡ／本で９０分間泳動し、そ
の後クマシーブルーにて染色すると、本酵素は第３図の
如く１つのバンドを示した。
本発明によれば、耐熱性のないマルトオリゴ糖生成アミ
ラーゼとの併用で澱粉、可溶性澱粉から高純度のマルト
オリゴ環を犬ｆ［ＶＣ生産することが可能であり、前記
した用途をはじめマルトオリゴ環の利用分野の拡大が期
待される。
ラーゼとの併用で澱粉、可溶性澱粉から高純度のマルト
オリゴ環を犬ｆ［ＶＣ生産することが可能であり、前記
した用途をはじめマルトオリゴ環の利用分野の拡大が期
待される。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
なお、実施例における炭水化物量はフェノール硫酸法に
よりグルコースで換算し、糖の分析゛は高速液体クロマ
トグラフィーで行なった。
よりグルコースで換算し、糖の分析゛は高速液体クロマ
トグラフィーで行なった。
アミラーゼ活性は１％可溶性澱粉０．５ｄに対し５０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｍ ６．０ 、 １０ ｍＭ ０ａ
ｌｌＩＩ含有）０．２５ｍＡ！に酵素液９．２５ｍを加
えて３０℃で作用させた後、反応液の０６２コを０．４
ｄのジニトロサリチル酸液に加え、５分間沸騰水浴中で
加熱した後、水１．８ｄを加えて５４０μｍにて比色し
、１分間に１μｍｏｊのグルコース相当の還元力を生成
する酵素量を１単位とした。
ｍＭ酢酸緩衝液（ｍ ６．０ 、 １０ ｍＭ ０ａ
ｌｌＩＩ含有）０．２５ｍＡ！に酵素液９．２５ｍを加
えて３０℃で作用させた後、反応液の０６２コを０．４
ｄのジニトロサリチル酸液に加え、５分間沸騰水浴中で
加熱した後、水１．８ｄを加えて５４０μｍにて比色し
、１分間に１μｍｏｊのグルコース相当の還元力を生成
する酵素量を１単位とした。
実施例１
可溶性澱粉２．５％、ペプトン１％１食塩０．５％を含
む培地（ＰＨ８，０）１０１を２０１ジャーファーメン
タ−に入れて殺菌した。一方、この培地と同じ組成の培
地にバチルス・セレウスＮＹ−１４（ＦＩＲＭ ＢＰ−
３２９）を３０℃で２４時間振盪培養し、この前培養液
２００１＋１４を前記培地に接種し、３０℃で４８時間
（１５０ｒｐｍ、 １６１ ’ａｉｒ／ｍ１ｎ）振盪培
養を行なった。
む培地（ＰＨ８，０）１０１を２０１ジャーファーメン
タ−に入れて殺菌した。一方、この培地と同じ組成の培
地にバチルス・セレウスＮＹ−１４（ＦＩＲＭ ＢＰ−
３２９）を３０℃で２４時間振盪培養し、この前培養液
２００１＋１４を前記培地に接種し、３０℃で４８時間
（１５０ｒｐｍ、 １６１ ’ａｉｒ／ｍ１ｎ）振盪培
養を行なった。
培養後、培養物を遠心分離して菌体２５６ｇを得、以下
前記（７）精製方法に記載した方法で最終酵素標品な得
た。最終酵素標品の比活性は１．１０Ｕ／■であり１，
３７倍に精製された。
前記（７）精製方法に記載した方法で最終酵素標品な得
た。最終酵素標品の比活性は１．１０Ｕ／■であり１，
３７倍に精製された。
実施例２
可溶性澱粉０．５％、ペプトン１％１食塩０．５％を含
む培地（Ｆ４−［８，０） １０１を２０１１ジャーフ
ァーメンタ−に入れて殺菌した。一方、この培地と同じ
組成の培地にバチルス・セレウスＮＹ−１４（ＦＩＲＭ
ＢＰ−３２９）を３０℃で２４時間振盪培養し、この
前培養液２００１ｄを前記培地に接社し、３０℃で２４
時間（１５Ｑ ｒｐｍ、 １６１ ａｉｒ／ｍｉｎ ）
振盪培養を行なった。
む培地（Ｆ４−［８，０） １０１を２０１１ジャーフ
ァーメンタ−に入れて殺菌した。一方、この培地と同じ
組成の培地にバチルス・セレウスＮＹ−１４（ＦＩＲＭ
ＢＰ−３２９）を３０℃で２４時間振盪培養し、この
前培養液２００１ｄを前記培地に接社し、３０℃で２４
時間（１５Ｑ ｒｐｍ、 １６１ ａｉｒ／ｍｉｎ ）
振盪培養を行なった。
培養後、培養物を遠心分離して菌体２２１１Ｉを得、以
下前記（７）精製方法に記載した方法で最終酵素標品を
得た。最終酵素標品の比活性は１．１８ Ｕ／ｒｎ９で
あった。
下前記（７）精製方法に記載した方法で最終酵素標品を
得た。最終酵素標品の比活性は１．１８ Ｕ／ｒｎ９で
あった。
第１図は本発明のオリゴ−１，６−グルコシダーゼの田
と活性との関係を示すグラフ、第２図は同じく温度と活
性の関係を示すグラフである。第３図は精製されたオリ
ゴ−１，６−グルコシダーゼのアクリルアミドゲルディ
スク電気泳動図である。 特許出願人 サッポロビール株式会社第１図 舅 第２図 第３図 Ｈ 手続補正凹（自発） 昭和５９年１０月２４日
と活性との関係を示すグラフ、第２図は同じく温度と活
性の関係を示すグラフである。第３図は精製されたオリ
ゴ−１，６−グルコシダーゼのアクリルアミドゲルディ
スク電気泳動図である。 特許出願人 サッポロビール株式会社第１図 舅 第２図 第３図 Ｈ 手続補正凹（自発） 昭和５９年１０月２４日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有する新規オリゴ−１，６−グルコシ
ダーゼ。 （１）１％イソマルトース０．０５ｍｌおよび本酵素〔
５０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ６．８６）、５ｍＭＥＤ
ＴＡ含有〕０．１ｍｌを３０分間作用させたとき至適温
度が２１℃付近に存在する。 （２）本酵素はイソマルトース、イソマルトトリオース
、パノース、パラニトロフェニル−α−グルコピラノシ
ドに作用し、マルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース
、マルトヘプタオース、イソパノース、可溶性澱粉、ア
ミロペクチン、デキストリン、プルランには作用しない
。 （３）本酵素は３０℃にてｐＨ６．２〜７．３が至適で
あり、ｐＨ７．５〜８付近で安定である。 （４）本酵素はｐＨ６．２以下およびｐＨ９．１以上に
て４℃で２４時間放置すると失活する。また、４０℃で
は３０分間の加熱により失活する。 （５）本酵素の至適ｐＨは６．２〜７．２である。 （６）本酵素の分子量は約６１，０００（ＳＤＳ−アク
リルアミドゲル電気泳動による）である。 ２、バチルス属に属し、下記の性質を有する新規オリゴ
−１，６−グルコシダーゼ生産能を有する微生物を培養
し、菌体中に該オリゴ−１，６−グルコシダーゼを蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする新規オリゴ−
１，６−グルコシダーゼの製造法。 （１）１％イソマルトース０．０５ｍｌおよび本酵素〔
５０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ６．８６）、５ｍＭＥＤ
ＴＡ含有〕０．１ｍｌを３０分間作用させたとき至適温
度が２１℃付近に存在する。 （２）本酵素はイソマルトース、イソマルトトリオース
、パノース、パラニトロフェニル−α−グルコピラノシ
ドに作用し、マルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース
、マルトヘプタオース、イソパノース、可溶性澱粉、ア
ミロペクチン、デキストリン、プルランには作用しない
。 （３）本酵素は３０℃にてｐＨ６．２〜７．３が至適で
あり、ｐＨ７．５〜８付近で安定である。 （４）本酵素はｐＨ６．２以下およびｐＨ９．１以上に
て４℃で２４時間放置すると失活する。また、４０℃で
は３０分間の加熱により失活する。 （５）本酵素の至適ｐＨは６．２〜７．２である。 （６）本酵素の分子量は約６１，０００（ＳＤＳ−アク
リルアミドゲル電気泳動による）である。 ３、バチルス属に属する新規オリゴ−１，６−グルコシ
ダーゼ生産菌がバチルス・セレウスＮＹ−１４（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３２９）である特許請求の範囲第２項記載の
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19260084A JPS6170985A (ja) | 1984-09-17 | 1984-09-17 | 新規オリゴ−１，６−グルコシダ−ゼおよびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19260084A JPS6170985A (ja) | 1984-09-17 | 1984-09-17 | 新規オリゴ−１，６−グルコシダ−ゼおよびその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6170985A true JPS6170985A (ja) | 1986-04-11 |
Family
ID=16293958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19260084A Pending JPS6170985A (ja) | 1984-09-17 | 1984-09-17 | 新規オリゴ−１，６−グルコシダ−ゼおよびその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6170985A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008059992A1 (fr) * | 2006-11-17 | 2008-05-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé pour produire un aliment contenant de l'amidon et amidon modifié |
-
1984
- 1984-09-17 JP JP19260084A patent/JPS6170985A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008059992A1 (fr) * | 2006-11-17 | 2008-05-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé pour produire un aliment contenant de l'amidon et amidon modifié |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0131253B1 (en) | Novel thermostable, aciduric alpha-amylase and method for its production | |
| EP0184019B1 (en) | Thermostable alpha-amylase-producing, thermophilic anaerobic bacteria, thermostable alpha-amylase and process for producing the same | |
| JPS61162183A (ja) | プルラナ−ゼ様酵素の製造法 | |
| US5281527A (en) | Process for producing pullalanase | |
| CA1081633A (en) | Heat and acid-stable alpha-amylase enzymes and processes for producing the same | |
| JPS5917983A (ja) | アミラ−ゼｇ３の製造法 | |
| JPS6170985A (ja) | 新規オリゴ−１，６−グルコシダ−ゼおよびその製法 | |
| JPS6331195B2 (ja) | ||
| JPS6342696A (ja) | 糖類の製造法 | |
| JPS61170387A (ja) | 新規マルタ−ゼおよびその製造法 | |
| JPH04200386A (ja) | β―フラクトフラノシダーゼ及びその製造方法 | |
| JPS6331194B2 (ja) | ||
| JP2559400B2 (ja) | マルトオリゴ糖生成アミラ−ゼ及びその製造法 | |
| JPH0369509B2 (ja) | ||
| JP2866460B2 (ja) | 多糖類の糖化方法 | |
| JPH0429355B2 (ja) | ||
| KR960007741B1 (ko) | 신규 α-1, 6-글루코시다제 및 그의 제조방법 | |
| JPS60227676A (ja) | 複合酵素の製造法 | |
| JPH0365149B2 (ja) | ||
| JPH0119878B2 (ja) | ||
| JPH0378990B2 (ja) | ||
| JPS61104786A (ja) | プルラナ−ゼの生産法 | |
| JPS60188061A (ja) | シユ−ドモナスｋｏ−８９４０ | |
| JPH0423985A (ja) | プルラナーゼ | |
| JPS6027513B2 (ja) | 耐熱性α−１，６−グルコシダ−ゼＡの製造法 |