JPH0423985A

JPH0423985A - プルラナーゼ

Info

Publication number: JPH0423985A
Application number: JP12992090A
Authority: JP
Inventors: Akira Ozaki; 彰尾崎; Kyoji Goto; 後藤　京二; Shinjiro Kono; 河野　慎次郎
Original assignee: Daiwa Kasei KK
Current assignee: Daiwa Kasei KK
Priority date: 1990-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1992-01-28
Anticipated expiration: 2014-01-06
Also published as: JP2843110B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新規プルラナーゼに関する。

（従来の技術）澱粉性基質を加水分解してグルコース、マルトース等を
含む加水分解生成物を得るには、一般に、澱粉性基質の
α−１，４−グルコシド結合およびα１．６−グルコシ
ド結合を分解する酵素が併用される。酵素およびエネル
ギーの消費量をできるだけ少なくして酵素反応を行い、
グルコースやマルトースの収率を高めるために、種々の
方法が提案されている。例えば、特公昭６２−２５０３
６号公報には、グルコアミラーゼまたはβ−アミラーゼ
とプルラナーゼとを併用することが開示されている。

プルラナーゼは、プルラン、アミロペクチン、デキスト
リンなどのα−１，６−グルコシド結合を加水分解する
酵素である。現在、以下の菌に由来するプルラナーゼが
知られている。

クレブシーラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｒｎａｎｉａｅ）　、ノカルデイア・アステロ
イデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、
ラクトバシラスープランタラム（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ミクロコツカス・リン
デイクテイカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｉｎｄｉ
ｃｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ）、バシラス・セレ
ウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バシラスー
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａ
ｒ。

ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・アシドプルリ
ティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌ
ｙｔｉｃｕｓ）、バシラス・セフトラマス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｅｃｔｏｒｒａｍｕｓ）、ストレプトマイセ
ス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）、クロスト
リジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ、）、バシ
ラス・フラボカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｌａ
ｖｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモアナｘ。

バクター・フィー１−　イ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｆｉｎｉｉ）、サーモバクテロイデス・
アセトエチリクス＜Ｔｈｅｒｍｏ−ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ　ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ）、サーマス属（
Ｔｈｅｒｍｕｓｓｐ、　）。

ところで、上記澱粉性基質の加水分解反応において、グ
ルコアミラーゼの至適反応条件は５５℃〜６０℃、ｐＨ
４，５〜５．０であり、β−アミラーゼのそれは５５℃
〜６０℃、ｐ）１５．　Ｏ〜６．０である。このような
反応条件に極めて近い至適温度および至適ｐＨを有する
プルラナーゼであって、現在工業的に生産されているも
のは、バシラス　アシドプルリティカスおよびバシラス
　セフトラマス由来のプルラナーゼだけである。前者は
、ノボ・インダス）　ＩＪイ社（Ｎｏｖａ　Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉ＾／Ｓ）からプロモザイム（Ｐｒ。

ｍｏｚｙｍｅ）　２０ＯＬの商品名で販売されている。

後者は、グルコアミラーゼとの混合酵素剤としてシルバ
ラーゼ（Ｓｉｌｖｅｒａｓｅ　）の商品名で大野製薬■
から販売されている。

（発明が解決しようとする課題）上記両者のプルラナーゼの至適反応条件は、グルコアミ
ラーゼまたはβ−アミラーゼの至適反応条件とよく合致
するため、これらの酵素との併用に優れている。上記以
外にも、さらに、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼな
どと至適反応条件が合致するようなプルラナーゼが求め
られている。

特に、澱粉はアミロースとアミロペクチンとで構成され
ているので、アミロペクチンに基質特異性が高く、効果
的にα−１，６−グルコシド結合を切断し得るプルラナ
ーゼが求められている。

本発明の目的は、実用条件であるｐＨ４，５〜５．５、
作用温度６０℃を、最適の反応条件とし、かつ澱粉中の
α−１，６−グルコシド結合を効果的に切断する新規な
プルラナーゼを提供することにある。

（課題を解決するための手段）本発明のプルラナーゼは、次の性質を有する。

■作用および基質特異性：α−１，６−グルコシド結合
を有する多糖類またはオリゴ糖類に作用し、該α−１，
６−グルコシド結合を分解して、直鎮アミロースを生成
する。

■至適ｐＨ範囲：２％プルランを基質として、６０℃で
３０分間反応させたときの至適ｐＨは４．５〜５．５で
ある。

■至適温度：２％プルランを基質として、ｐＨ５，０で
３０分間反応させたときの至適温度は約６０℃である。

■温度安定性：　ｐＨ５，０の酢酸緩衝液中で３０分間
加熱処理したときの残存活性が、６０℃で１００％であ
る。

■分子量ニゲル濾過法による測定で分子量は約７５００
０である。

■等電点：等電点電気泳動法による等電点は３．６であ
る。

本発明のプルラナーゼは、発明者らにより土壌より分離
された。この酵素は、表１に示す菌学的性質を有する細
菌から生産される。　表１に示す菌学的性質に基づいて
、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第２巻（Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ。

Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　１９８６年）を参照したところ
、この閑は、バシラス　プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｂｒｅｖｉｓ）に属する新規な菌株であることがわかっ
た。本菌は、工業技術院微生物工業技術研究所において
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ　ＰＬ−１微工研菌寄
第１１４５７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４５７＞として寄
託されている。

表１において特に記載のない限り培養温度は３０℃であ
る。

表次に、本菌から本発明のプルラナーゼを採取するための
条件について説明する。

培養条件炭素源としては、可溶性澱粉、コーンスターチ、ポテト
スターチ液化液のような澱粉類が用いられる。窒素源と
してはポリペプトン、コーンステイープリカー、各種大
豆蛋白分解物１．酵母エキス、肉エキス、硫安などが用
いられる。適当な炭素源および窒素源に、適当な塩類を
加えてｐ１１５．０〜５．５に調整した培地が好適に用
いられる。殺菌した培地に、菌を接種して、２０〜４０
℃の温度で、１〜３日間、静置、振盪または通気撹拌し
ながら培養を行う。この酵素は、培地中に分泌される。

酵素の採取法上記培養液から本発明酵素を採取・精製するには既知の
方法が単独もしくは併用して利用されつる。例えば、培
養液を遠心分離または濾過法により除菌して上清を得る
。上清液はエバポレータ、限外濾過、逆浸透法等により
濃縮または透析することができる。酵素を含有した濃縮
液を必要に応じて活性炭により脱色した後、硫酸アンモ
ニウムなどの塩類を加えて塩析を行うことにより、本酵
素を採取する。この塩析により得られた粗酵素は、ＣＭ
−セファデックスＣ−５０（ファルマシア製）ナトのカ
ラムクロマトグラフィにより精製される。α１．６−グ
ルコシダーゼ活性を示すフラクションを集めて、ディス
ク電気泳動にかけたところ、単一のバンドを示した。

以下、後述の酵素の性質は、この精製酵素を用いて調べ
られた。

なお、本酵素の活性は、以下のように、ソモギネルソン
法により、生成した還元糖を定量することにより測定し
た。

活性測定法４％プルラン溶液１ｍ１（０，１Ｍの酢酸緩衝液中、ｐ
Ｈ５，０）を６０℃で１０分間予熱する。これに、酵素
液（０，０１Ｍ酢酸緩衝液中、ｐＨ５，０）　　１ｍｌ
を加えて、３０分間酵素反応をさせる。この反応液０．
２ｍｌを、１ｍｌのソモギーネルソン銅試薬に添加する
。次いで、水０．８ｒｎｌを加え、沸騰湯浴中で２５分
間加熱する。水冷後、さらにネルソン試薬１ｍｌを加え
て撹拌する。これに、水２２ｍ１を加えて希釈し、希釈
液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素の活性
は、基質の還元力で表す。１分間に１μｍｏｉのグルコ
ースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（ｌ　
ＰＬ［Ｉ）とする。

酵素の性質 ■作用および基質特異性本酵素は、α−１，６−グルコシド結合を有する多糖類
またはオリゴ糖類に作用し、該α−１，６グルコシド結
合を分解して、直鎖アミロースを生成する。

プルラン、溶性デンプン、ポテトのアミロペクチン、′
コーンのアミロペクチン、およびカキのグリコーゲンを
各々基質として含有する溶液（ｐＨ５，０）に、本酵素
を含有する酵素液を添加して、６０℃で３０分間反応さ
せた。各基質に対する作用力は活性測定法に準じ、生成
した還元糖量を測定した。各基質に対する作用力を相対
活性で表２に示す。相対活性は、至適ｐＨおよび至適温
度において、プルランを基質として用いたときの還元糖
生成量を１００％とした場合の相対値（％）で示す。バ
シラス　アシドプルリティカス由来のプルラナーゼにつ
いても同様の測定を行った。この値を表２に示す。さら
に、バシラス　アシドプルリティカス由来のプルラナー
ゼおよびバシラス　セフトラマス出来のプルラナーゼに
ついて、上記基質に対する相対活性値（％）の文献値が
あるものについては、その値を表２に示す。

バシラス　アシドプルリティカス由来のプルラナーゼの
相対活性値はＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５２（９）、
　２２９３頁、　（１９８８年）、バシラスセクトラマ
ス由来のプルラナーゼの相対活性値は特開昭６３−１８
５３８０号公報に各々記載されている値を引用した。な
お、文献値を（）内に示す。

（以下余白）表表２から、本酵素は、基質としてアミロペクチンを用い
たときの酵素活性が、他のプルラナーゼの場合よりも高
いことがわかる。基質としてアミロペクチンを用いたと
きの酵素活性および基質としてプルランを用いたときの
酵素活性の比は、０．３〜０．５である。よって本酵素
は、澱粉中のα−１゜６−グルコシド結合を効果的に分
解することがわかる。

■至適ｐＨ範囲本酵素を用い、２％のプルラン溶液を基質として用いて
、ｐＨ３，５〜６．０の範囲のｐＨ条件下で、６０℃、
３０分間酵素反応させ、活性測定法に準じて酵素活性を
測定した。その結果を第１図に示す。第１図から、２％
のプルラン溶液を基質としたときの至適ｐＨは４．５〜
５．５であることがわかる。

■至適温度の範囲本酵素を用い、２％のプルラン溶液を基質として用いて
、５５〜７０ｔ”の範囲において活性測定法に準じて酵
素反応を行った。その結果を第２図に示す。第２図から
、２％のプルラン溶液を基質としたときの至適温度は６
１）を付近であることがわかる。

■温度安定性５０ｍＭノ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）中７３０分間、所
定の温度で加熱処理後の酵素の残存活性を測定した。

その結果を第３図に示す。６０ｔで加熱処理後の酵素の
残存活性は１００％であり、６５℃で加熱処理後の酵素
の残存活性は４０％である。

■金属塩の影響本酵素を用い、５ｍＭの金属塩を存在させた溶液中で活
性測定法に準じて酵素反応を行った。その結果を表３に
示す。

（以下余白）表［ ■分子量ゲル濾過法による分子量は約７５０００であった。

■等電点等電点電気泳動法により３．６であった。

既知酵素との比較本酵素と、これまでに報告されているプルラナーゼとの
比較結果を、表４に示す。

（以下余白）表４から、本酵素は、既知のプルラナーゼとは異なる新
規なプルラナーゼであることがわかる。

実施例（Ａ）バチルス　プレビスＰＬ−１株の培養：可溶性澱
粉７．２％、ポリペプトン３．６％、コーンステイープ
リカー０．９％、酵母エキス０．５４％、Ｋ２１ｔＰＯ
。

０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％、（Ｎ）１
４）２５０４０．１％およびグルタミン酸す）　ＩＪウ
ム０．２％を含有する初発ｐＨ５，０からなる培地を坂
ロフラスコに入れ、これにバチルス　プレビスＰＬ−１
株を接種した。これを、３８℃で約７０時間振盪培養し
た。得られた培養液について、プルラナーゼの活性を測
定したところ、培養液１ｍｌ当たり０．１１ＰＬｔｌで
あった。

（Ｂ）酵素の採取方よび精製：（Ａ）項で得られた培養
液を遠心分離にかけ、菌体を除去した。上澄液をｐｔ１
５．０に調整した後、７０％飽和硫酸アンモニウムで塩
析した。沈澱物を遠心分離により採取した。得られた沈
澱物を０．　ＯＩＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４に再溶解した
。この溶液を、０．ＯＩＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）
に対して５℃で２４時間透析した。

得られた透析内液を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５
）で平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−５０カラムク
ロマトグラフイーにかけた。次いで、０．１〜０．７Ｍ
のＮａＣ１濃度勾配溶出法で溶出して、プルラナーゼ活
性画分を得た。

このプルラナーゼ活性画分を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
）１５．０）で平衡化したバイオゲルＰ−１５０カラム
を用いたゲル濾過法により精製した。その結果、プルラ
ナーゼ活性を示す単一ピークが得られた。プルラナーゼ
の分子量は７５０００であった。得られた精製プルラナ
ーゼをディスク電気泳動および等電点電気泳動にかけた
ところ、単一のバンドを示し、等電点は３．６であった
。比活性は２３ＰＬＵ／Ｂ、Ｉｌ、　。

であった。

（Ｃ）既知酵素との比較：コーンスターチ（固形分（Ｄ、５）３２％、ｐＨ４，５
、ＤＥＬ５．８＞を糖化用基質として用いた。以下に示
す酵素を用いて、６０℃で７０時間反応させた。酵素反
応後の反応液中のグルコース、２糖類、３糖類、４糖以
上の多糖類の含有率を高速液体クロマトグラフィー（Ｉ
ＩＰＬｃ）で測定した。

その結果を表５に示す。

（以下余白）（発明の効果）本発明によれば、このように、澱粉性基質中のα−１，
６−グルコシド結合を効果的に分解し得る新規プルラナ
ーゼが得られる。本酵素は、特に、対プルラン活性に対
する対アミロペクチン活性の比率が高い。

このような酵素を、グルコアミラーゼまたはβアミラー
ゼと組み合わせて澱粉の糖化に用いると、グルコースお
よびマルトースの収率を高めることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明酵素の至適ｐＨを示すグラフ、第２図
は本酵素の至適温度を示すグラフ、そして第３図は本酵
素の安定温度範囲を示すグラフである。以上

Claims

【特許請求の範囲】１、次の性質を有するプルラナーゼ。（１）作用および基質特異性：α−１，６−グルコシド
結合を有する多糖類またはオリゴ糖類に作用し、該α−
１，６−グルコシド結合を分解して、直鎖アミロースを
生成する。（２）至適ｐＨ範囲：２％プルランを基質として、６０
℃で３０分間反応させたときの至適ｐＨは４．５〜５．
５である。（３）至適温度：２％プルランを基質として、ｐＨ５．
０で３０分間反応させたときの至適温度は約６０℃であ
る。（４）温度安定性：ｐＨ５．０の酢酸緩衝液中で３０分
間加熱処理したときの残存活性が、６０℃で１００％で
ある。（５）分子量：ゲル濾過法による測定で分子量は約７５
０００である。（６）等電点：等電点電気泳動法による等電点は３．６
である。２、対プルラン活性に対する対アミロペクチン活性の比
率が０．３〜０．５である請求項１に記載のプルラナー
ゼ。