JPH0116158B2

JPH0116158B2 -

Info

Publication number: JPH0116158B2
Application number: JP59225442A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-10-26
Filing date: 1984-10-26
Publication date: 1989-03-23
Also published as: JPS61104786A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、広い最適作用PH域をもつ新規なプル
ラナーゼの生産改良方法に関するものである。〔従来技術〕プルラナーゼは、Benderらにより、プルラリ
ヤ・プルランの生産する多糖類プルランを加水分
解する酵素として、エーロバクター・エーロゲネ
ス（Aerobacter aerogenes）に、はじめて見出
された〔Biochem.Biophys.Acta，36，309
（1959）、特公昭46―7559など〕。その後、この酵
素は、アミロペクチンのα―１，６―グルコシド
結合を加水分解し、β―アミラーゼとの併用によ
り、デンプンからマルトースを収量よく生産でき
ることから注目され、現在までに同種の酵素が
種々の微生物より生産されることが知られてい
る。この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラー
ゼなど種々の名称で呼ばれているが、総称してα
―１，６―グルコシダーゼと言われている。たと
えば、エツセリシア・インターメデイアのイソア
ミラーゼ（Escherichia intermedia，Applied.
Microbiol.，15，492（1967）〕、ストレプトコツカ
ス・ミテイスのプルラナーゼ〔Streptococcus
mitis，Biochem.J.108，33，（1968）〕、ストレプ
トマイセス・sp.No.28のイソアミラーゼ〔J.
Ferment.Tech.，49，552（1971）〕、バシルス属の
プルラナーゼ〔Agric.Biol.Chem.，40，1515
（1976）、Starch，34，340（1982）など〕などが
ある。最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα
―１，６―グルコシダーゼは、デンプンからグル
コースの製造や、デンプンからマルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオースなどのマルトオリ
ゴ糖の生産においても、これら糖の増収に有効で
あることが認められている。しかるに、従来、知られているプルラナーゼや
イソアミラーゼなどのα―１，６―グルコシダー
ゼは、一般には熱安定性に劣り（多くは最適温度
45〜50℃）、また、作用PH範囲が狭いため、グル
コアミラーゼのように酸性側で作用し、熱安定性
に優れた酵素（最適作用PH4.5付近、最適作用温
度60℃）や、中性〜弱アルカリ性に最適作用PHを
もつ微生物起源のマルトオリゴ糖生成酵素の、全
てのアミラーゼに対して使用するには技術的およ
び経済的に問題があつた。そこで、本発明者らは、グルコアミラーゼ、β
―アミラーゼがマルトトリオース以上のマルトオ
リゴ糖を生成するアミラーゼの、いずれのアミラ
ーゼとも併用できる、最適作用PH範囲が広く、且
つ熱安定性に優れたα―１，６―グルコシダーゼ
を求めて、広く自然界から微生物の検索を行つて
きた。結果、土壌中より分離し、クレブシラの生
産するプルラナーゼが新規な耐熱性プルラナーゼ
であることを認めた。そして、本酵素を工業的に
生産すべく、生産力価の向上方法について鋭意研
究を行つてきた結果、本酵素の生産菌を窒素源と
デンプンまたはアミロペクチンを含む培地で培養
してプルラナーゼを生産するに際し、乳糖を添加
すると、プルラナーゼの生産量が顕著に増大でき
ることを認めた。本発明はこの知見にもとずいて
なされたものである。〔目的〕本発明の目的は、プルラナーゼの改良生産法を
提供することを目的とする。〔構成〕本発明は、クレブシラ・ニユーモニアに属する
プルラナーゼ生産菌を、窒素源とデンプンまたは
アミロペクチンを含む培地で培養してプルラナー
ゼを生産するに際し、乳糖を存在させることを特
徴とするプルラナーゼの生産方法を提供するもの
である。以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。本発明において例示菌として使用される、クレ
ブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
pneurmoniae）は、Begeyの細菌同定書
（bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology，The Williams ＆ Wilkins
Co.）において、以前はエーロバクター・エーロ
ゲネス（Aerobacter aerogenes）と区別されて
いたが、第８版において、エーロバクター・エー
ロゲネスはクレブシラ・ニユーモニアに包含され
ている。エーロバクター属やクレブシラ属細菌が
プルラナーゼを生産することについては、すでに
本発明以前に公知である。たとえば、
Biochem.8.334，79（1961）、Method in
Enzymology ，555（1966）、特公昭46―7559、
Agric.Biol.Chem.，37，2821（1973）などには、
エーロバクター・エーロゲネスの生産するプルラ
ナーゼの記載があり、また、特公昭51―5072、特
公昭58―22197などには、クレブシラ・ニユーモ
ニアなどクレブシラ属の生産するα―１，６―グ
ルコシダーゼについての記載がある。しかし、こ
れら文献や特許公報に記載されている酵素は、い
ずれも熱安定性に劣つている。すなわち、
Biochem.8.334，79（1961）とMethod in
Enzymology ，555（1966）にはエーロバクタ
ー・エーロゲネスのプルラナーゼの最適作用温度
は47.5℃とあり、Agric.Biol.chem.，37，2821
（1973）には、同じくエーロバクター・エーロゲ
ネスのプルラナーゼの最適作用温度は50℃である
と記載されている。そして、特公昭51―5072に
は、クレブシラ・ニユーモニアの最適作用温度は
45〜50℃にあり、基質の不在下では、50℃で１時
間加熱処理すると殆んど失活すると記載されてい
る。このように、従来、知られているエーロバクタ
ー属やクレブシラ属のプルラナーゼやα―１，６
―グルコシダーゼの最適用温度は45〜50℃程度で
あると考えられるのに対し、本発明のプルラナー
ゼの最適作用温度は60〜63℃の高温側にあり、基
質の不在下で50℃で１時間加熱しても殆んど活性
の低下は認められない（第１図）など、熱安定性
に優れた酵素である。本酵素は基質の存在下では
当然熱安定性化され、またカルシウムなどの金属
塩の存在下でも熱安定化されるので、実用的な反
応条件においても、60℃の温度で反応を行うこと
ができる。一方、最適作用PHについてみてみると、エーロ
バクター・エーロゲネスやクレブシラ属のプルラ
ナーゼやα―１，６―グルコシダーゼの最適作用
PHは5.0付近｛Method in Enzymology ，555
（1966）、特公昭51―5072など｝、または、PH６付
近｛Agric Biol.Chem.，37，2821（1973）｝にあ
り、いずれの場合も、特に、PH６以上においては
著しく活性が低下することが知られている。本発明以前に、比較的熱安定性に優れたα―
１，６―グルコシダーゼを生産する微生物とし
て、たとえば、バシルス属のプルラナーゼ｛特開
昭57―174089、Sarch，34，340（1982）｝、および
ストレプトマイセス属のイソアミラーゼ｛J.
Ferment.Technol.，49，552（1971）｝が知られて
いる。これらの微生物の生産するプルラナーゼや
イソアミラーゼの最適作用温度は約60℃にある
が、いずれも最適作用PHは5.0にあり、PH５以上
では著しく活性が低下する。このように、本発明以前に知られていたエーロ
バクター属やクレブシラ属の酵素は熱安定性に劣
り、最適作用温度は50℃前後にあり、また、最適
作用PHは5.0または6.0の狭い範囲にある。これに
対し、本発明により生産されるクレブシラ・ニユ
ーモニアの新規な耐熱性プルラナーゼは、最適作
用PHが約4.5〜約7.5の極めて広い範囲にあり、最
適作用温度は60〜63℃と極めて熱安定性に優れた
酵素であり、従来、知られていたエーロバクタ属
やクレブシラ属の酵素とは違つた新規な酵素と認
められるものである。以下に、本発明の新規な耐熱性プルラナーゼの
酵素的性質についてより詳細に記載する。 (1) 作用：プルランのα―1.6―グルコシド結合
を分解してマルトトリオースを生成する。ま
た、澱粉、アミロペリチン、グリコーゲンまた
はこれらの派生物のα―1.6―グルコシド結合
を分解する。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH：PH約2.5〜約10
の極めて広いPH範囲で作用し、最適作用温度は
PH約4.5〜約7.5の広い範囲に認められた｛２％
プルラン、0.05M酢酸緩衝液、トリス緩衝液お
よびトリシン緩衝液のもとで50℃で30分間反
応｝。 (3) 作用温度範囲及び最適作用温度：約75℃まで
作用し、最適作用温度は約63℃に認められた
｛２％プルラン、0.05M酢酸緩衝液（PH5.0）又
は0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）のもとで30分
間反応｝。 (4) 熱安定性；酵素水溶液を50℃、55℃と60℃で
加熱処理してのち、残存活性を測定した。その
結果、50℃では１時間の加熱後も失活は殆んど
認められなかつた。55℃の加熱では20分の加熱
で約20％失活し、１時間の加熱で約60％失活し
た。そして、60℃の加熱では30分間の加熱で約
80％失活した。 (5) PH安定性；PH約４〜約10の範囲で安定であつ
た｛0.1M酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはト
リス緩衝液のもと、室温（25℃）で３時間放置
後、残存活性を測定した｝ (6) 阻害剤；本酵素は１×10^-3MのCuSO₄，
HgCl₂，ZnSO₄，FeSO₄により、それぞれ約93
％、約89％、約29％阻害された。同濃度の
AgNO₃によつては殆んど阻害されなかつた。 (7) 精製方法；本酵素は培養上澄液から硫安分画
（40〜70％飽和）、DEAE―セフアロースカラム
クロマトグラフイー（KCl0〜0.5Mでリニヤー
グラジエント溶出）とセフアデツクスＧ―200
カラムクロマトグラフイーにより、クロマト
的、電気泳動的に均一まで精製することができ
る。 (8) 分子量；セフアデツクスＧ―200ゲル濾過法
により測定した分子量は約12万であつた。 (9) 力価測定法；0.1Mトリス緩衝液に溶解させ
た１％プルラン液（PH7.0）0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし40℃で反応させる。
この条件で１時間に1μMのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。また、本発明において使用される新規な耐熱性
プルラナーゼ生産菌の菌学的性質は下記に示す通
りである。 (1) 形態的性質；約0.8×約1.3μの桿菌、通常、
単桿菌あるいは２連状に連なり生育する。運動
性はなく、また胞子形成は認められない。 (2) 培養的性質；肉汁寒天では、白色で光沢のあ
る円形状の集落を形成する。集落の周縁は全縁
で、表面隆起は頭状を示す。肉状液体培養で
は、培地全体に混濁を生成する。穿刺培養では、寒天高層の上層、中部、深部
ともに糸状に生育が認められ、寒天表面にも集
落の形成が認められる。 (3) 生理的性質生育温度；約50℃の温度まで生育するが、最適
生育温度は約43℃。生育PH；PH約５〜約９の範囲で生育する。最適
生育PHは７近付。グラム染色；陰性。酸素に対する態度；通性嫌気性。カタラーゼ；陽性。オキシダーゼ；陰性。 β―ガラクトシダーゼ；陽性。硝酸塩の還居；陽性。炭水化物の利用；グルコース、アドニトール、
Ｌ―アラビノース、エクスリン、イノシトー
ル、マンニトール、Ｌ―ラムノースなどを利
用し酸を生成する。クエン酸の利用；陽性。マロン酸の利用；陽性。メチルレツド反応；陰性。 VP反応；陽性。アルギニンの加水分解；陽性。ゼラチンの液化；陰性。硫化水素の生成；陽性。インドール反応；陰性。リジンの脱炭酸；陽性。オルニチンの脱炭酸；陽性。ウレアーゼ反応；陽性。フエニールアラニンからのフエニルピルビン酸の生成；陰性。以上の菌学的性質について、Bergey′s
Manual of Determinative Bacteriologyの第８
版（The Williams ＆ Wilkins Co. 1974年）
を参照し、本菌をクレブシラ・ニユーモニア
（Klebsiella pneumoniae）の一菌株と同定当す
るのが適当と考えた。本菌は工業技術院微生物工
業技術研究所においてKlebsiella pneumoniae
FERM Ｐ―7387として寄託されている。本菌により新規な耐熱性プルラナーゼを生産す
るためには、窒素源としては、ペプトン、肉エキ
ス、コーン・ステイープ・リカーのような有機窒
素源や尿素、塩化アンモニウム硫酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウムのようなアンモニウム塩
や硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのような硝酸塩
などの無機窒素源のいずれでも使用することがで
きるが、なかでも尿素は良好な窒素源である。炭素源としては、通常、トウモロコシ、ポテト
サツマイモ、モチトウモロコシ、モチ米デンプン
またはこれらの処理物が利用されるが、なかでも
モチトウモロコシ、モチ米デンプン、アミロペク
チンのような分岐結合の多い多糖類が望ましい。
そして、これらデンプン系多糖類を含む培地に対
し、乳糖が添加され、乳糖は培地に対して0.1％
程度の添加で十分効果を示すが、通常、0.5〜１
％程度添加すると、無添加の場合に比べ、プルラ
ナーゼの生産量は２〜３倍に増加する。前記の窒素源と炭素源に加え、これに補足する
培地原料として、リン酸塩、マグネシウム塩と少
量のカルシウム、マンガンなどの金属塩が添加さ
れる。培養は20〜45℃で１〜３日間好気的に培養
される。プルラナーゼは殆んど菌体外に生産されるの
で、培養後は、濾過または遠心分離により除菌
し、上澄液を濃縮するか、または硫酸ナトリウ
ム、硫酸アンモニウムなどによる塩析によるか、
または、アセトン、イソプロパノール、エタノー
ルやメタノールのような有機溶媒を加えて、酵素
を沈殿物として収得する。以下に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。実施例１尿素0.35％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、可溶性デンプン２％、MnCl₂5×
10^-5M、CaCl₂2×10^-3M、CuSO₄5×10^-5Mから
なる培養50mlに、乳糖を0.1〜１％量添加し、200
ml容三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、ク
レブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
pneumoniae）FERMP―7387を接種し、30℃で
２日間振温培養した。培養後、遠心分離機により
除菌し、得られた上澄液について、生産されたプ
ルラナーゼ活性を測定した結果は第１表に示す通
りであつた。

〔効果〕

以上の実験結果から明らかなように、プルラナ
ーゼの生産に際し、デンプン質多糖類を含む培地
に乳糖を添加することにより、プルラナーゼの生
産効率を著しく向上させ得ることがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

１プルラナーゼを生産するクレブシエラ・ニユ
ーモニア（FERMP―7387）をデンプンを含む培
地で培養して、プルラナーゼを生産するに際し、
乳糖を存在させることを特徴とするプルラナーゼ
の生産増強法。