JP3119523B2 - 新規なイソアミラーゼ、その製造法及びそれを用いた糖類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フラボバクテリウム・
オドラタムKU株（Flavobacterium odoratumKU）を培養
して得られる新規なイソアミラーゼ、その製造法及びそ
れを用いた糖類の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イソアミラーゼは、デンプン、アミロペ
クチン、グリコーゲン、及びそれらの部分加水分解物中
のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵
素である。イソアミラーゼ生産菌としては、シュードモ
ナス・アミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa)(Bi
ochim. Biophys. Acta., 212巻、458 頁、1970年）、サ
イトファ−ガ属（Cytophaga)(FEBS LETTERS、 12 巻、 96
項、 1970年) 、フラボバクテリウム属(Flavobacteriu
m)、(Starch/Starke、32巻、132 項、 1980年) などが報
告されている。また、これらのイソアミラーゼを各種起
源のβ−アミラーゼと併用して高純度マルトースを生産
する方法も報告されている。例えばシュ−ドモナス・ア
ミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa）が生産する
イソアミラーゼを用いる方法(J. Jpn. Soc. Starch Sc
i.、 31 巻、 38項、 1984年) や、フラボバクテリウム(Fl
avobacterium)属が生産するイソアミラーゼを用いる方
法(Starch/starke、32巻、352 項、 1980年) などであ
る。

【０００３】しかしながら、これらのイソアミラーゼ
は、それらの至適ｐＨや至適温度などが、併用される各
種アミラーゼと合致せず、必ずしも有利なものではなか
った。すなわち、一般にデンプン糖の生産は、５０℃以
上の高温でｐＨ５．０〜６．０の弱酸性条件下で行われ
ているが、シュ−ドモナス・アミロデラモサ(Pseudomon
as amyloderamosa) が生産するイソアミラーゼは、至適
ｐＨが３．０〜４．０と酸性領域に片寄っており、耐酸
性の大豆β−アミラーゼとは併用可能であるが、麦芽β
−アミラーゼや細菌β−アミラーゼ及び耐酸性の弱いα
−アミラーゼとは併用が困難であった。また、フラボバ
クテリウム(Flavobacterium)属やサイトファーガ(Cytop
haga) 属が生産する従来のイソアミラーゼにおいては、
至適温度が４０℃と低く、耐熱性の点で工業的使用が困
難であった。

【０００４】一方、デンプン、アミロペクチン、プルラ
ン及びそれらの部分加水分解物中のα−１，６−グルコ
ピラノシド結合を加水分解する酵素として、クレブシエ
ラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)(Biochem.
Z. 、３３４巻、７９頁、１９６１年) などが生産する
プルラナーゼが知られているが、この酵素は、工業的な
マルトース生産に用いられているような２０％（ｗ／
ｖ）以上という高濃度基質存在下では、イソアミラーゼ
とは違って反応が可逆的であり、マルトースを重合して
４糖を生成し、また、マルトースをアミロースに転移さ
せ、イソアミラーゼの場合のような高い純度のマルトー
スを製造できない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、従来
のイソアミラーゼは、その至適ｐＨや至適温度などが、
各種アミラーゼと合致しないので、アミラーゼと併用し
て高純度のマルトースなどの糖類を工業的に生産する上
で不利であった。このため、５０℃以上で、しかも弱酸
性〜中性領域で、工業的に使用可能な新規イソアミラー
ゼの開発が強く求められていた。このような酵素を開発
することによって、デンプンからのマルトースなどのマ
ルトオリゴ糖や分岐ＣＤなどの製造を安価かつ高い生産
性で実施することが可能となる。

【０００６】したがって、本発明の第１の目的は、上記
要件を満足する新規なイソアミラーゼを提供することで
ある。

【０００７】本発明の第２の目的は、上記新規イソアミ
ラーゼを簡単且つ高い収率で製造する方法を提供するこ
とである。

【０００８】本発明の第３の目的は、上記要件を満足す
る新規なイソアミラーゼを使用し、デンプンもしくはそ
の分解生成物から収率よく糖類を得る方法を提供するこ
とである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的使
用において、５０℃以上で、かつ、弱酸性側で糖化可能
なイソアミラーゼを生産する微生物を得るべく鋭意検索
した結果、鹿児島県内の土壌から採取された細菌が上記
目的を達成する上で極めて有用であり、これを好気的に
培養することにより、培養物中に上記要件を満足する新
規イソアミラーゼが高収率で生成蓄積することを見いだ
し、本発明を完成したものである。

【００１０】すなわち、本発明の新規なイソアミラーゼ
は、以下の理化学的性質を有することを特徴とする。 （イ）作用 アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、及びそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合を特異的に加水分解する。 （ロ）基質特異性 アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン中のα−１，
６−グルコピラノシド結合を加水分解し、プルランを加
水分解しない。 （ハ）至適ｐＨ ５．５〜６．０ （ニ）安定ｐＨ ３０℃、２４時間の条件下でｐＨ４．５〜８．０で安定
である。 （ホ）作用適温 ４５℃ （ヘ）失活温度、ｐＨ ４５℃、１０分間の条件下では、ｐＨ４及びｐＨ８で完
全に失活し、ｐＨ６．０、１５分間の条件下では、５０
℃で完全に失活する。 （ト）温度安定性 ｐＨ６、１５分間の条件下では、４０℃まで安定であ
る。 （チ）阻害、活性化及び安定化 本酵素は、銅、水銀、亜鉛で阻害され、カルシウムで安
定化される。 （リ）分子量（SDS-PAGE法） ８８，０００ （ヌ）等電点（Isoelectric Focusing法） ８．７

【００１１】上記イソアミラーゼは、菌体外分泌型酵素
であることが好ましい。

【００１２】また、本発明のイソアミラーゼの製造法
は、フラボバクテリウム・オドラタム（Flavobacterium
odoratum)に属するイソアミラーゼ生産菌を培養し、培
養物から上記イソアミラーゼを採取することを特徴とす
る。

【００１３】上記イソアミラーゼ生産菌としては、本発
明者らにより、新たに自然界から検索、単離されたフラ
ボバクテリウム・オドラタムKU株（Flavobacterium odo
ratum KU、微工研菌寄第１２７１１号) が好ましく使用
される。この微生物の菌学的性質は、以下に示す通りで
ある。

【００１４】（１）形態的特徴 栄養細胞が０．８〜１．０×１．５〜２．０μｍの桿菌
で胞子を形成せず運動性はない。

【００１５】（２）生理的性質 表１に示す通りであ
る。

【００１６】

【表１】

【００１７】以上の菌学的性質について、バージェイス
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー（Bergy's Mannual of Systematic Bacteriology)
第１巻を参照し、本菌をフラボバクテリウム・オドラタ
ムKU株(Fravobacterium odoratum KU)と命名した。な
お、本菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に平成４
年１月１８日に寄託され、その受託番号は、微工研菌寄
第１２７１１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７１１）である。

【００１８】本発明のイソアミラーゼの製造法につい
て、更に詳しく説明すると、上記のようなフラボバクテ
リウム・オドラタム（Flavobacterium odoratum)に属す
るイソアミラーゼ生産菌を適当な培地に摂取し、その生
育温度、好ましくは２５〜４０℃、更に好ましくは３０
〜３７℃にて、好ましくは２４〜９６時間好気的に培養
することにより、培養液中に菌体外分泌型酵素として、
前記イソアミラーゼが生成蓄積される。

【００１９】なお、上記の培地としては、安価に入手し
得る公知の各種材料を使用することができる。例えば、
窒素源としては、コーン・スティープ・リカー、ポリペ
プトン、大豆粕、フスマ、肉エキス、酵母エキス、アミ
ノ酸液などが用いられ、炭素源としては、水飴、マルト
ース、各種デンプン、可溶性デンプン、デンプン液化
液、デキストリン、サイクロデキストリンなどが用いら
れる。また、これらの窒素源や炭素源の他に、各種の
塩、例えば、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩等
の無機塩や、各種ビタミン類を必要により添加する。好
ましい培地の例としては、例えば０．５％可溶性デンプ
ン、０．１％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．
１％ＮＨ₄ ＮＯ₃ 、０．１４％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．０２
％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ、０．０１％Ｌ−グルタミン酸
ナトリウムを含有する液体培地が挙げられる。

【００２０】前記イソアミラーゼ生産菌は、イソアミラ
ーゼを菌体外に産生するため、培養を行った後、培養上
清から遠心分離により菌体を除去することにより、本発
明のイソアミラーゼの粗酵素液を得ることができる。工
業的には、この粗酵素液をそのまま用いることができ、
経済的で有利である。しかし、これを更に精製して使用
することもできる。精製方法としては、例えば、硫安等
による塩析、エタノール、アセトン、イソプロパノール
等による溶媒沈殿法、デンプン吸着法、限外濾過法、イ
オン交換樹脂等による一般的な酵素精製法を採用するこ
とができる。

【００２１】本発明のイソアミラーゼの製造法の好まし
い具体例を挙げると、次の通りである。フラボバクテリ
ウム・オドラタムKU株（Flavobacterium odoratum KU、
微工研菌寄第１２７１１号) を、２％可溶性デンプン、
１％大豆タンパク（商品名「ソルピーＫ」、日清製油株
式会社製）、０．１％ＮＨ₄ ＮＯ₃ 、０．１４％ＫＨ₂
ＰＯ₄ 、０．１％ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、０．０２％Ｍ
ｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、０．０１％Ｌ−グルタミン酸ナト
リウムを含む培地に植菌し、３０℃にて９６時間好気的
に培養する。こうして得られた培養液を１０，０００×
ｇ、４℃にて遠心して菌体を除去し、約１．３Ｌ（リッ
トル）の上澄液（粗酵素液）を得る。次いで、この上澄
液に１３ｇのコーンスターチを添加し、４℃で２時間放
置し、イソアミラーゼをデンプンに吸着させる。そし
て、イソアミラーゼを吸着させたデンプンを１０，００
０×ｇ、４℃にて遠心して集める。このデンプンを１０
０ｍＬ（ミリリットル）の１％（ｗ／ｖ）マルトテトラ
オース溶液（ｐＨ６．０）に溶解し、室温にて攪拌しな
がら２時間放置し、イソアミラーゼをデンプンより溶出
させる。この溶出液を１０，０００×ｇ、室温にて遠心
してデンプンを除き、得られた上澄液を、０．２ＭＮａ
Ｃｌを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に対して、一夜４℃で透析する。この酵素液を分画分子
量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮した後、上記
トリス・塩酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３０
０ＨＲカラムを用いてゲル濾過を行い、活性画分を集め
る。こうして得られた精製酵素は、ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動法において単一のバンドを有する
ことが確認され、活性収率は約２３％であった。

【００２２】こうして得られる本発明の新規なイソアミ
ラーゼは、前述したような理化学的性質を有している。

【００２３】本発明におけるイソアミラーゼの活性測定
法並びに活性表示法は、以下の通りである。すなわち、
０．５％もち米デンプン溶液０．３５ｍＬに、０．５Ｍ
の酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍＬを混合し、適時
希釈した酵素液を０．１ｍＬ加え、４５℃で１５分間反
応させる。その後、０．１Ｎ ＨＣｌにて５倍希釈した
ヨード液（０．０５Ｍヨウ素を含む０．５Ｍヨウ化カリ
ウム溶液）０．５ｍＬを加えて酵素反応を止め、１０ｍ
Ｌの水を加えて十分に攪拌した後、分光光度計を用いて
６１０ｎｍで測定する。酵素活性の単位は、上記条件下
で１分間に０．０１吸光度を増加する酵素量を１単位と
した。

【００２４】次に、本発明の糖類の製造法は、上述した
新規なイソアミラーゼと、α−アミラーゼ、β−アミラ
ーゼ及びグルコアミラーゼからなる群より選ばれた少な
くとも一種の酵素とを併用して、デンプンもしくはその
加水分解物に作用させることを特徴とする。

【００２５】ここで、α−アミラーゼとしては、例え
ば、細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（商品名「クライ
スターゼＴ−５」、大和化成株式会社製）、バチルス属
（Bacillus) 起源のマルトトリオース生成酵素、シュー
ドモナス・スツュツェリ（Pseudomonas stutzeri）起源
のマルトテトラオース生成酵素などを用いることができ
る。また、β−アミラーゼとしては、例えば、大豆由来
のβ−アミラーゼ（長瀬生化学株式会社製）、麦芽由来
のβ−アミラーゼ（商品名「ウルトラザイム」、Enzyme
Biosystems 社製）などを用いることができる。更に、
グルコアミラーゼとしては、例えば、リゾプス属（Rhiz
opus) 起源のグルコアミラーゼ（商品名「スミチー
ム」、新日本化学株式会社製）、アスペルギルス属（As
pergillus)起源のグルコアミラーゼ（商品名「アミログ
ルコシダーゼ」、ノボ社製）などを用いることができ
る。なお、本発明においては、上記酵素の他に、必要に
応じてプルラナーゼなどを併用してもよい。

【００２６】また、本発明において、デンプンの加水分
解物とは、デンプンを液化型α−アミラーゼで液化した
デンプン液化液や、マルトースをはじめとする各種のマ
ルトオリゴ糖、サイクロデキストリン、これらの混合物
等を意味する。イソアミラーゼと併用する酵素の種類
や、基質の種類は、目的とする加水分解物に応じて定め
られる。

【００２７】

【作用】本発明の新規なイソアミラーゼは、アミロペク
チン、デンプン、グリコーゲン中のα−１，６−グルコ
ピラノシド結合を加水分解する。デンプン糖の生成反応
は、低温かつ弱酸性条件下で実施された場合、微生物汚
染に起因する様々な悪影響を受けることが知られてい
る。そこで、このデンプンの酵素加水分解反応をできる
だけ高温条件下で行い、また、弱酸性〜中性側のｐＨ条
件で実施することが望ましいとされている。

【００２８】しかしながら、これまでに単離されたイソ
アミラーゼは熱安定性に劣り、殆どが４０℃以下の至適
温度を示すにすぎなかった。また、シュードモナス・ア
ミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa）が生産する
イソアミラーゼは、約５０℃という高い至適温度を有し
ているが、前述したように至適ｐＨが３．０〜４．０と
低いため、併用できる酵素が限られているという問題が
あった。

【００２９】これに対して、本発明の新規なイソアミラ
ーゼは、至適ｐＨが５．５〜６．０であり、作用適温が
４５℃と高いため、工業的に使用されている殆どのα−
アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼと併用
することができ、デンプンの加水分解反応を５５℃以上
で、しかも弱酸性領域近傍で実施することが可能とな
る。このことは、微生物汚染を確実に防止することを保
証し、また汚染に基づくｐＨ低下を補償する目的でアル
カリ試薬を添加する必要もなくなり、大幅な製造コスト
低減が期待できることを意味する。更に、高温での反応
が可能なことから反応速度の改善が期待され、分解生成
物の生産性を高めることができる。

【００３０】本発明のイソアミラーゼを、β−アミラー
ゼと併用して、デンプンもしくはその加水分解物に作用
させれば、マルトースを高収率で生産することができ
る。また、本発明のイソアミラーゼを、マルトリオース
生成酵素、マルトテトラオース生成酵素などと併用し
て、デンプンもしくはその加水分解物に作用させれば、
マルトトリオース、マルトテトラオースなどのマルトオ
リゴ糖を高収率で生産することができる。更に、本発明
のイソアミラーゼを、マルトトリオースなどのマルトオ
リゴ糖と、サイクロデキストリンとを含む糖液に作用さ
せると、イソアミラーゼの逆合成反応により、分岐サイ
クロデキストリンを得ることもできる。

【００３１】

【実施例】

実施例１ フラボバクテリウム・オドラタムKU株（Flavobacterium
odoratum KU、微工研菌寄第１２７１１号) を、２％マ
ルトース、１％大豆タンパク（商品名「ソルピーＫ」、
日清製油株式会社製）、０．１％ＮＨ₄ ＮＯ₃ 、０．１
４％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．１％ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、
０．０２％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、０．０１％Ｌ−グル
タミン酸ナトリウムを含む培地（ｐＨ６．０）を１００
ｍＬずつ分注したフラスコ１５本に植菌し、３０℃で９
６時間、１８０ｒｐｍで回転振とう培養した。培養終了
後、培養液を１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分
離して菌体を除き、８．３単位／ｍＬの粗酵素液１，３
００ｍＬを得た。

【００３２】この粗酵素液に１３ｇのコーンスターチを
添加し、４℃で２時間放置し、イソアミラーゼをデンプ
ンに吸着させた。そして、イソアミラーゼを吸着させた
デンプンを１０，０００×ｇ、４℃にて遠心して集め
た。このデンプンを１％（ｗ／ｖ）マルトテトラオース
溶液（ｐＨ６．０）１００ｍＬに懸濁し、室温にて攪拌
しながら２時間放置し、イソアミラーゼをデンプンより
溶出させた。この溶出液を１０，０００×ｇ、室温にて
遠心してデンプンを除き、得られた上澄液を０．２ＭＮ
ａＣｌを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に対して、一夜４℃で透析した。この酵素液を分画
分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮した後、
上記トリス・塩酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−
３００ＨＲカラムにかけてゲル濾過を行い、活性画分を
集めた。こうして得られた精製酵素は、ポリアクリルア
ミドゲルディスク電気泳動法において単一のバンドを有
することが確認され、活性収率は約２３％であった。

【００３３】実施例２ 以下の項目について、実施例１で調製した精製イソアミ
ラーゼの理化学的性質を調べた。

【００３４】（１）特異性 アミロペクチン、グリコーゲン、プルランを含む２％溶
液５ｍＬに、基質１ｇに対して３００単位の上記精製イ
ソアミラーゼを添加し、４５℃で２４時間反応させた。
反応生成物をＨＰＬＣ法で測定したところ、アミロペク
チン、及びグリコーゲンは、明らかに分解されていた
が、プルランは分解されていなかった。

【００３５】（２）至適ｐＨ ０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、５．０、５．５、
６．０）、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、７．
０、７．５、８．０）、又は０．２Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ９．０）に溶解させた０．５％（ｗ／ｖ）もち米
デンプン溶液０．４５ｍＬに、上記精製イソアミラーゼ
を予め１ｍＭ ＥＤＴＡを含む水で一夜透析したイソア
ミラーゼ含有溶液０．１ｍＬを混合し、先に述べた方法
でイソアミラーゼ活性を測定した。この結果を図１の
（Ａ）に示す。イソアミラーゼの至適ｐＨは、ｐＨ６．
０における酵素活性を１００とする相対活性で示した。

【００３６】（３）安定ｐＨ （２）と同様に処理して得たイソアミラーゼ含有溶液
を、ｐＨ４〜９．５の範囲で、３０℃で２４時間及び４
５℃で１０分間処理し、ｐＨ６．０で処理した時の残存
酵素活性を１００とする相対活性を求めた。この結果を
図２の（Ａ）に示す。図中、○−○は、３０℃、２４時
間処理した結果、●−●は、４５℃、１０分処理した結
果を示す。なお、使用した緩衝液は、酢酸緩衝液（ｐＨ
４〜６）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜８．０）及びグ
リシン−ＮａＯＨ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５〜９．
５）である。

【００３７】（４）作用適温 （２）と同様に処理して得たイソアミラーゼ含有溶液の
活性を、各温度で測定し、４５℃で測定した時の酵素活
性を１００とする相対活性を求めた。この結果を図１の
（Ｂ）に示す。

【００３８】（５）失活条件及び温度安定性 （１）で得た精製イソアミラーゼを（２）と同様に処理
した後、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏの存在下、及
び不存在下で、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５
５℃で１５分間処理し、残存する活性をした。その結果
を図２の（Ｂ）に示す。図中、○−○は、ＣａＣｌ₂ ・
２Ｈ₂ Ｏを添加しないときの結果、●−●は、ＣａＣｌ
₂ ・２Ｈ₂ Ｏを添加したときの結果を示す。このよう
に、Ｃａ²⁺イオンを添加することにより、温度安定性が
向上し、５０℃以上の温度条件下でも活性が維持される
ことがわかる。

【００３９】（６）阻害化 （２）と同様に処理したイソアミラーゼ含有溶液に、終
濃度１ｍＭ（ただし、水銀は０．１ｍＭと１ｍＭの両
方）となるように、各種金属の塩酸塩又は化学試薬を添
加し、活性を測定した。そして、無添加の活性を１００
とする相対活性を求めた結果を表２に示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】（７）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドを用いた電気泳動法により
求めた本発明のイソアミラーゼの分子量は、８８，００
０であった。図３は、上記電気泳動法の実験結果を示
す。

【００４２】（８）等電点 Isoelectric Focusing法により求めた本発明のイソアミ
ラーゼの等電点は、８．７であった。図４は、上記等電
点の測定結果を示す。

【００４３】実施例３ ２％可溶性デンプン、１％大豆タンパク（商品名「ソル
ピーＫ」、日清製油株式会社製）、０．１％ＮＨ₄ ＮＯ
₃ 、０．１４％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．１％ＣａＣｌ₂ ・２
Ｈ₂ Ｏ、０．０２％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、０．０１％
Ｌ−グルタミン酸ナトリウムを含む培地（ｐＨ６．０）
を、５００ｍＬ容の三角フラスコ２０本に１００ｍＬず
つ入れ、フラボバクテリウム・オドラタムKU株（Flavob
acteriumodoratum KU、微工研菌寄第１２７１１号) を
それぞれ植菌し、３０℃で９６時間、１８０ｒｐｍで回
転振とう培養した。この培養液を１０，０００×ｇ、４
℃で２０分間遠心分離して菌体を除去し、１０．５単位
／ｍＬの粗酵素液を１８５０ｍＬ得た。

【００４４】次いで、粗酵素液に１５ｇのコーンスター
チを添加し、４℃で２時間放置し、イソアミラーゼをデ
ンプンに吸着させた。そして、１０，０００×ｇ、４℃
にて遠心してイソアミラーゼを吸着させたデンプンを集
めた。このデンプンを１００ｍＬ（ミリリットル）の１
％（ｗ／ｖ）マルトテトラオース溶液（ｐＨ６．０）に
懸濁し、室温にて攪拌しながら２時間放置し、イソアミ
ラーゼをデンプンより溶出させた。この溶出液を１０，
０００×ｇ、室温にて遠心して、デンプンを除いた上澄
液を得た。この上澄液を分画分子量１０，０００の限外
濾過膜を用いて濃縮し、２，５００単位／ｍＬの濃縮粗
酵素液を約５ｍＬ得た。

【００４５】次に、１０Ｌの２５％（ｗ／ｖ）馬鈴薯デ
ンプン懸濁液を、細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（商
品名「クライスターゼＴ−５」、大和化成株式会社製）
を用いて１０５℃で液化した後、直ちに１２５℃で３０
分間オートクレーブし、ＤＥ(Dextrose Equivalent :直
接還元糖に対する全固形物の割合）２．７のデンプン液
化液を得た。この液化液５ｍＬに、デンプン重量に対し
て、０．２５％の大豆由来のβ−アミラーゼ（長瀬生化
学株式会社製、１０，０００Ｕ／ｇ）と、０．００１％
の上記と同じ細菌液化型耐熱性α−アミラーゼと、４５
０単位の上記イソアミラーゼ濃縮粗酵素液を添加し、ｐ
Ｈ６．０、５５℃で、７２時間反応させた。

【００４６】反応終了後の糖液に対して、０．２％（ｗ
／ｖ）の活性炭を添加し、沸騰水浴中で５分間加熱した
後、０．４５μｍポアサイズのメンブランフィルターで
濾別した。こうして得られた糖液中の糖組成を、ウルト
ロン（ＵＬＴＲＯＮ）ＰＳ−８０Ｎ（商品名、親和化工
株式会社製）カラムを用いた高速液体クロマトグラフ法
で測定した結果、Ｇ₁ ：０．４％、Ｇ₂ ：８９．３％、
Ｇ₃ ：７．５％、オリゴ糖：２．８％であった。

【００４７】実施例４ 実施例３で得られた糖液に対して、特開平２−１１３８
８６号に記載されているサーモモノスポラ・ビリディス
ＴＦ−３５（Thermomonospora viridis ＴＦ−３５）由
来の酵素を、デンプン１ｇに対して１５０単位添加し、
更に４８時間反応させた。

【００４８】得られた糖液を、実施例３と同様の方法で
脱色して濾過した後、その糖組成を実施例３と同様な高
速液体クロマトグラフ法で測定した結果、Ｇ₁ ：３．０
％、Ｇ₂ ：９４．０％、Ｇ₃ ：２．５％、オリゴ糖：
０．５％であった。

【００４９】実施例５ 約１０Ｌの３０％（ｗ／ｖ）のとうもろこしデンプン懸
濁液を、細菌液化型耐熱性α−アミラーゼ（商品名「ク
ライスターゼＴ−５」、大和化成株式会社製）を用いて
９０℃で液化した後、直ちに１２０℃で３０分間オート
クレーブし、ＤＥ５．５のデンプン液化液を得た。

【００５０】このデンプン液化液の５ｍＬをとり、デン
プン１ｇ当たり０．２％の麦芽由来のβ−アミラーゼ
（商品名「ウルトラザイム」、Enzyme Biosystems 社
製）と、１００単位の実施例３で調製したイソアアミラ
ーゼ濃縮粗酵素液とを添加し、ｐＨ６．０、５５℃で、
７２時間反応させた。

【００５１】得られた糖液を、実施例３と同様の方法で
脱色して濾過した後、その糖組成を実施例３と同様な高
速液体クロマトグラフ法で測定した結果、Ｇ₁ ：３．２
％、Ｇ₂ ：７６．５％、Ｇ₃ ：１４．７％、オリゴ糖：
５．６％であった。

【００５２】実施例６ 重量比で、マルトースとα−ＣＤ（サイクロデキストリ
ン）を３：１の割合、マルトースとβ−ＣＤを５：１の
割合、マルトースとγ−ＣＤを３：１の割合で含む、約
７０％（ｗ／ｖ）濃度のそれぞれの糖液に対して、実施
例３で調製したイソアミラーゼ濃縮粗酵素液を、基質１
ｇ当たり７，５００単位ずつ添加し、ｐＨ６．０、５５
℃で、７２時間反応させた。

【００５３】反応後のそれぞれの糖液について、Asahip
ak GS-320 （商品名、旭化成工業株式会社製）を用いて
糖組成を調べたところ、分岐α−ＣＤ１４．１％、分岐
β−ＣＤ７．９％、分岐γ−ＣＤ１５．２％がそれぞれ
生成していた。

【００５４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
至適ｐＨが弱酸性〜中性領域にあり、作用適温が高い新
規なイソアミラーゼを提供することができ、このイソア
ミラーゼを用いることにより、例えば５５℃程度の高温
域で糖化反応を行うことが可能となる。そして、このイ
ソアミラーゼと、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グ
ルコアミラーゼなどとを併用して用いることにより、プ
ルラナーゼでは得られなかった高純度のマルトース、あ
るいはそれ以上の重合度のマルトオリゴ糖、分岐ＣＤな
どを工業的に製造することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のイソアミラーゼの相対活性のｐＨ依存
性及び温度依存性を測定した結果を示す図表である。

【図２】本発明のイソアミラーゼの残存活性とｐＨ及び
温度との関係を測定した結果を示す図表である。

【図３】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドを用いた電気泳動
法により、本発明のイソアミラーゼを含むタンパク質の
分子量を測定した結果を示す図表である。

【図４】Isoelectric Focusing法により本発明のイソア
ミラーゼの等電点を測定した結果を示す図表である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｐ 19/16 Ｃ１２Ｒ 1:20） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12P 19/00 - 19/64 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するイソアミラ
   ーゼ。 （イ）作用 アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、及びそれら
   の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
   合を特異的に加水分解する。 （ロ）基質特異性 アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン中のα−１，
   ６−グルコピラノシド結合を加水分解し、プルランを加
   水分解しない。 （ハ）至適ｐＨ ５．５〜６．０ （ニ）安定ｐＨ ３０℃、２４時間の条件下でｐＨ４．５〜８．０で安定
   である。 （ホ）作用適温 ４５℃ （ヘ）失活温度 ４５℃、１０分間の条件下では、ｐＨ４及びｐＨ８で完
   全に失活し、ｐＨ６．０、１５分間の条件下では、５０
   ℃で完全に失活する。 （ト）温度安定性 ｐＨ６、１５分間の条件下では、４０℃まで安定であ
   る。 （チ）阻害、活性化及び安定化 本酵素は、銅、水銀、亜鉛で阻害され、カルシウムで安
   定化される。 （リ）分子量（SDS-PAGE法） ８８，０００ （ヌ）等電点（Isoelectric Focusing法） ８．７
2. 【請求項２】 菌体外分泌型酵素である特許請求の範囲
   第１項記載のイソアミラーゼ。
3. 【請求項３】 フラボバクテリウム・オドラタム（Flav
   obacterium odoratum)に属するイソアミラーゼ生産菌を
   培養し、培養物から請求項１記載のイソアミラーゼを採
   取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
4. 【請求項４】 前記フラボバクテリウム・オドラタム
   （Flavobacterium odoratum)に属するイソアミラーゼ生
   産菌として、フラボバクテリウム・オドラタムKU株（Fl
   avobacterium odoratum KU、微工研菌寄第１２７１１
   号) を用いる請求項３記載のイソアミラーゼの製造法。
5. 【請求項５】 請求項１記載のイソアミラーゼと、α−
   アミラーゼ、β−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから
   なる群より選ばれた少なくとも一種の酵素とを併用し
   て、デンプンもしくはその加水分解物に作用させること
   を特徴とする糖類の製造法。