JPH10229876A - α−１，３−多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
α−１，３−多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH10229876A JPH10229876A JP9037691A JP3769197A JPH10229876A JP H10229876 A JPH10229876 A JP H10229876A JP 9037691 A JP9037691 A JP 9037691A JP 3769197 A JP3769197 A JP 3769197A JP H10229876 A JPH10229876 A JP H10229876A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 α−1,3−結合の分岐を有する多分岐デ
キストランに作用し、グルコースを生成する新規なα−
1,3−多分岐デキストラン水解酵素、及びスフィンゴバ
クテリウム属に属する微生物を用いて前記酵素の製造方
法並びに前記酵素を用いた環状イソマルトオリゴ糖の製
造法。 【効果】 本酵素は、環状イソマルトオリゴ糖の分離精
製時に混入している既存のエキソ型グルコアミラーゼ、
グルコデキストラナーゼ等では殆ど水解されない分岐環
状イソマルトオリゴ糖の分岐鎖を特異的に水解でき、該
環状オリゴ糖の精製を更に簡略化でき且つ環状イソマル
トオリゴ糖の純度の向上に寄与することができた。従っ
て、本発明は、産業上極めて有意義である。
キストランに作用し、グルコースを生成する新規なα−
1,3−多分岐デキストラン水解酵素、及びスフィンゴバ
クテリウム属に属する微生物を用いて前記酵素の製造方
法並びに前記酵素を用いた環状イソマルトオリゴ糖の製
造法。 【効果】 本酵素は、環状イソマルトオリゴ糖の分離精
製時に混入している既存のエキソ型グルコアミラーゼ、
グルコデキストラナーゼ等では殆ど水解されない分岐環
状イソマルトオリゴ糖の分岐鎖を特異的に水解でき、該
環状オリゴ糖の精製を更に簡略化でき且つ環状イソマル
トオリゴ糖の純度の向上に寄与することができた。従っ
て、本発明は、産業上極めて有意義である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なα−1,3−
多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソ
マルトオリゴ糖の製造法に関する。
多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソ
マルトオリゴ糖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】環状イソマルトオリゴ糖は、本発明者ら
が土壌より単離した微生物をデキストラン含有培地で培
養して始めて得た新規な環状オリゴ糖である。この環状
イソマルトオリゴ糖はサイクロデキストリンと同様に低
分子化合物と包接化合物を形成するものであるから、医
薬品、食品等への利用が期待されている有用な糖である
(特開平6−197783号公報)。また、この環状イソマルト
オリゴ糖は、虫歯の原因菌として知られているストレプ
トコッカス(Streptococcus)属に属する微生物の生産す
るグルカン合成酵素を特異的に阻害する作用を有するも
のであることから、抗う蝕剤への応用も期待されている
（特開平8−59484号公報）。この環状イソマルトオリゴ
糖の製法としては、デキストランから環状イソマルトオ
リゴ糖を合成する酵素である環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素を用いて効率よく該オリゴ糖の製造する方法が開
発されている（特開平7-8276号公報) 。
が土壌より単離した微生物をデキストラン含有培地で培
養して始めて得た新規な環状オリゴ糖である。この環状
イソマルトオリゴ糖はサイクロデキストリンと同様に低
分子化合物と包接化合物を形成するものであるから、医
薬品、食品等への利用が期待されている有用な糖である
(特開平6−197783号公報)。また、この環状イソマルト
オリゴ糖は、虫歯の原因菌として知られているストレプ
トコッカス(Streptococcus)属に属する微生物の生産す
るグルカン合成酵素を特異的に阻害する作用を有するも
のであることから、抗う蝕剤への応用も期待されている
（特開平8−59484号公報）。この環状イソマルトオリゴ
糖の製法としては、デキストランから環状イソマルトオ
リゴ糖を合成する酵素である環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素を用いて効率よく該オリゴ糖の製造する方法が開
発されている（特開平7-8276号公報) 。
【０００３】一方、この環状イソマルトオリゴ糖の精製
法として、粗環状イソマルトオリゴ糖に不純物として混
入している直鎖イソマルトオリゴ糖をグルコデキストラ
ナーゼを用いて特異的に除去する方法が開発されてお
り、これらの方法と該酵素遺伝子並びに該酵素の製造法
に関して特許出願がなされている（特願平８−230128号
公報）。しかし、該環状イソマルトオリゴ糖の分離精製
時には、直鎖イソマルトオリゴ糖以外に僅かではあるが
分岐オリゴ糖や分岐環状オリゴ糖も混入しているためこ
れらのオリゴ糖の除去が重要な問題となっている。これ
らのオリゴ糖は、上記グルコデキストラナーゼでは殆ど
水解されない難分解性のオリゴ糖であり、このオリゴ糖
の分岐鎖を特異的に水解できれば、該環状オリゴ糖の精
製がさらに簡略化され且つ環状イソマルトオリゴ糖の純
度の向上が可能となる。
法として、粗環状イソマルトオリゴ糖に不純物として混
入している直鎖イソマルトオリゴ糖をグルコデキストラ
ナーゼを用いて特異的に除去する方法が開発されてお
り、これらの方法と該酵素遺伝子並びに該酵素の製造法
に関して特許出願がなされている（特願平８−230128号
公報）。しかし、該環状イソマルトオリゴ糖の分離精製
時には、直鎖イソマルトオリゴ糖以外に僅かではあるが
分岐オリゴ糖や分岐環状オリゴ糖も混入しているためこ
れらのオリゴ糖の除去が重要な問題となっている。これ
らのオリゴ糖は、上記グルコデキストラナーゼでは殆ど
水解されない難分解性のオリゴ糖であり、このオリゴ糖
の分岐鎖を特異的に水解できれば、該環状オリゴ糖の精
製がさらに簡略化され且つ環状イソマルトオリゴ糖の純
度の向上が可能となる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、環状
オリゴ糖には作用せずに分岐オリゴ糖の分岐鎖を特異的
に水解する作用を有する新規な酵素を見出し、該酵素の
製法及び該酵素を用いて、環状イソマルトオリゴ糖の精
製をさらに簡略化しそして前記環状イソマルトオリゴ糖
の純度を向上させることにある。
オリゴ糖には作用せずに分岐オリゴ糖の分岐鎖を特異的
に水解する作用を有する新規な酵素を見出し、該酵素の
製法及び該酵素を用いて、環状イソマルトオリゴ糖の精
製をさらに簡略化しそして前記環状イソマルトオリゴ糖
の純度を向上させることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記の環状オリゴ糖には作用せずに分岐オリゴ糖の分岐
鎖を特異的に水解する作用を有する新規な酵素を得るた
めに、鋭意検討した結果、α−1,3−多分岐デキストラ
ンの資化菌であるスフィンゴバクテリウム・エスピー．
(Sphingobacterium sp.)V−54株の培養液中に上記性質
を有する酵素が存在していることを見出し、該酵素を培
養液より分離精製し、その性質を明らかにするととも
に、本酵素を用いると分岐環状オリゴ糖の分岐鎖が効率
的に水解されることを確認し、本発明を完成した。
上記の環状オリゴ糖には作用せずに分岐オリゴ糖の分岐
鎖を特異的に水解する作用を有する新規な酵素を得るた
めに、鋭意検討した結果、α−1,3−多分岐デキストラ
ンの資化菌であるスフィンゴバクテリウム・エスピー．
(Sphingobacterium sp.)V−54株の培養液中に上記性質
を有する酵素が存在していることを見出し、該酵素を培
養液より分離精製し、その性質を明らかにするととも
に、本酵素を用いると分岐環状オリゴ糖の分岐鎖が効率
的に水解されることを確認し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、以下の理化学的性質
を有するα−1,3−多分岐デキストラン水解酵素であ
り、 作用 α−1,3−結合の分岐を有する多分岐デキストランに作
用し、グルコースを生成する。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは、7.0付近であり、安定pH範囲は、5.5〜8.0で
ある。
を有するα−1,3−多分岐デキストラン水解酵素であ
り、 作用 α−1,3−結合の分岐を有する多分岐デキストランに作
用し、グルコースを生成する。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは、7.0付近であり、安定pH範囲は、5.5〜8.0で
ある。
【０００７】基質特異性 グルコ２糖を基質とした場合には、α−1,2>α−1,4>α
−1,3>α−1,6 結合の順に良く作用する。多糖の場合に
は、デキストランに最も良く作用し、次いでα−1,3−
多分岐デキストランに良く作用するが、α−1,3−グル
カンであるムタンには殆ど作用しない。
−1,3>α−1,6 結合の順に良く作用する。多糖の場合に
は、デキストランに最も良く作用し、次いでα−1,3−
多分岐デキストランに良く作用するが、α−1,3−グル
カンであるムタンには殆ど作用しない。
【０００８】阻害及び活性化 Hg2+、Cu2+、Ni2+及びFe2+等で90%以上阻害され、Ca2+
で約30%活性化される。 分子量 ゲル濾過法では約９万であり、SDS PAGE法では約8万で
ある。
で約30%活性化される。 分子量 ゲル濾過法では約９万であり、SDS PAGE法では約8万で
ある。
【０００９】作用適温の範囲 45℃付近に適温を有する。 温度等による失活の条件 45℃、15分間の処理で約30％、50℃、15分間の処理でほ
ぼ失活する。
ぼ失活する。
【００１０】更に、本発明はスフィンゴバクテリウム属
に属し、α−1,3−多分岐デキストラン水解酵素生産能
を有する微生物を、デキストランを含有する培地で培養
し、培養物より該酵素を採取することを特徴とするα−
1,3−多分岐デキストラン水解酵素の製造法である。
に属し、α−1,3−多分岐デキストラン水解酵素生産能
を有する微生物を、デキストランを含有する培地で培養
し、培養物より該酵素を採取することを特徴とするα−
1,3−多分岐デキストラン水解酵素の製造法である。
【００１１】更に、本発明は、分岐環状イソマルトオリ
ゴ糖に、α−1,3−多分岐デキストラン水解酵素を作用
させて環状イソマルトオリゴ糖を製造することを特徴と
する環状イソマルトオリゴ糖の製造法である。
ゴ糖に、α−1,3−多分岐デキストラン水解酵素を作用
させて環状イソマルトオリゴ糖を製造することを特徴と
する環状イソマルトオリゴ糖の製造法である。
【００１２】なお、該環状イソマルトオリゴ糖の製造で
使用するα−1,3−多分岐デキストラン水解酵素は、精
製された該酵素、粗酵素の他、該酵素を産生するスフィ
ンゴバクテリウム属に属する微生物の培養液、菌体或い
は菌体処理物のいずれでもよい。
使用するα−1,3−多分岐デキストラン水解酵素は、精
製された該酵素、粗酵素の他、該酵素を産生するスフィ
ンゴバクテリウム属に属する微生物の培養液、菌体或い
は菌体処理物のいずれでもよい。
【００１３】
【発明の実施の形態】先ず、以下に、本酵素の理化学的
性質について述べる。 作用 α−1,3−結合の分岐を有する多分岐デキストランに作
用し、グルコースを生成する。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは、7.0付近であり、安定pH範囲は、5.5〜8.0で
ある。
性質について述べる。 作用 α−1,3−結合の分岐を有する多分岐デキストランに作
用し、グルコースを生成する。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは、7.0付近であり、安定pH範囲は、5.5〜8.0で
ある。
【００１４】基質特異性 グルコ2糖を基質とした場合には、α−1,2>α−1,4>α
−1,3>α−1,6 結合の順に良く作用する。多糖の場合に
は、デキストランに最も良く作用し、次いでα−1,3−
多分岐デキストランに良く作用するが、α−1,3−グル
カンであるムタンには殆ど作用しない。
−1,3>α−1,6 結合の順に良く作用する。多糖の場合に
は、デキストランに最も良く作用し、次いでα−1,3−
多分岐デキストランに良く作用するが、α−1,3−グル
カンであるムタンには殆ど作用しない。
【００１５】阻害及び活性化 Hg2+、Cu2+、Ni2+及びFe2+等で90%以上阻害され、Ca2+
で約30%活性化される。 分子量 ゲル濾過法では約9万であり、SDS PAGE法では約8万であ
る。
で約30%活性化される。 分子量 ゲル濾過法では約9万であり、SDS PAGE法では約8万であ
る。
【００１６】作用適温の範囲 45℃付近に適温を有する。 温度等による失活の条件 45℃、15分間の処理で約30％、50℃、15分間の処理でほ
ぼ失活する。
ぼ失活する。
【００１７】以上詳述した如く、本酵素は、公知の多糖
水解酵素であるαーアミラーゼ（EC3.2.1.1）、グルコ
アミラーゼ（EC 3.2.1.3）、デキストラナーゼ（EC 3.
2.1.11）、グルコデキストラナーゼ（EC 3.2.1.70）、
エンドα−1,3−グルカナーゼ（ムタナーゼ）（EC 3.2.
1.59）とはその性質を異にし、これらの酵素が殆ど作用
できないα−1,3−多分岐デキストランから著量のグル
コースを生成する点で全く新しい酵素である。
水解酵素であるαーアミラーゼ（EC3.2.1.1）、グルコ
アミラーゼ（EC 3.2.1.3）、デキストラナーゼ（EC 3.
2.1.11）、グルコデキストラナーゼ（EC 3.2.1.70）、
エンドα−1,3−グルカナーゼ（ムタナーゼ）（EC 3.2.
1.59）とはその性質を異にし、これらの酵素が殆ど作用
できないα−1,3−多分岐デキストランから著量のグル
コースを生成する点で全く新しい酵素である。
【００１８】このα−1,3−多分岐デキストラン水解酵
素を、分岐環状イソマルトオリゴ糖、例えば、グルコー
スが1分子α−1,3−結合で分岐した環状イソマルトオリ
ゴ糖、3−O−α−D−グルコシルサイクロイソマルトヘ
プタオース、3−O−α−D−グルコシルサイクロイソマ
ルトオクタオース、3−O−α−D−グルコシルサイクロ
イソマルトノナオース等に、例えば、温度10〜50℃、好
ましくは、40℃、pH5.5〜8.5、好ましくは、pH7.0で30
分間〜48時間、好ましくは、24時間そのまま若しくは撹
拌しつつ作用させて、前記分岐環状イソマルトオリゴ糖
から環状イソマルトオリゴ糖、例えば、サイクロイソマ
ルトヘプタオース、サイクロイソマルトオクタオース、
サイクロイソマルトノナオース等を製造することができ
る。
素を、分岐環状イソマルトオリゴ糖、例えば、グルコー
スが1分子α−1,3−結合で分岐した環状イソマルトオリ
ゴ糖、3−O−α−D−グルコシルサイクロイソマルトヘ
プタオース、3−O−α−D−グルコシルサイクロイソマ
ルトオクタオース、3−O−α−D−グルコシルサイクロ
イソマルトノナオース等に、例えば、温度10〜50℃、好
ましくは、40℃、pH5.5〜8.5、好ましくは、pH7.0で30
分間〜48時間、好ましくは、24時間そのまま若しくは撹
拌しつつ作用させて、前記分岐環状イソマルトオリゴ糖
から環状イソマルトオリゴ糖、例えば、サイクロイソマ
ルトヘプタオース、サイクロイソマルトオクタオース、
サイクロイソマルトノナオース等を製造することができ
る。
【００１９】環状イソマルトオリゴ糖製造時にこのα−
1,3−多分岐デキストラン水解酵素を用いることによ
り、環状イソマルトオリゴ糖以外に混入している難分解
性の分岐オリゴ糖や分岐環状イソマルトオリゴ糖、特に
分岐環状イソマルトオリゴ糖の分岐鎖を特異的に水解で
き、該環状イソマルトオリゴ糖の精製が更に簡略化でき
且つその純度の向上が可能である。
1,3−多分岐デキストラン水解酵素を用いることによ
り、環状イソマルトオリゴ糖以外に混入している難分解
性の分岐オリゴ糖や分岐環状イソマルトオリゴ糖、特に
分岐環状イソマルトオリゴ糖の分岐鎖を特異的に水解で
き、該環状イソマルトオリゴ糖の精製が更に簡略化でき
且つその純度の向上が可能である。
【００２０】生成する環状イソマルトオリゴ糖は、サイ
クロデキストリンと同様、包接作用を有しており、サイ
クロデキストリンでは包接できなかったような大きさの
物質の安定化、可溶化等に有用である。更に、環状イソ
マルトオリゴ糖はグルコース残基間の結合がα−１，６
−結合で構成されており、生体内中に多量に存在するα
−アミラーゼ等の糖質分解酵素による水解作用を受けに
くい。したがって、この環状イソマルトオリゴ糖はサイ
クロデキストリンよりもはるかに安定であり、該環状オ
リゴ糖を用いた場合、従来のサイクロデキストリンに比
べて、より安定性の高い包接化合物を形成することがで
きるので、該環状オリゴ糖は、きわめて有用性の高い物
質であると言える。
クロデキストリンと同様、包接作用を有しており、サイ
クロデキストリンでは包接できなかったような大きさの
物質の安定化、可溶化等に有用である。更に、環状イソ
マルトオリゴ糖はグルコース残基間の結合がα−１，６
−結合で構成されており、生体内中に多量に存在するα
−アミラーゼ等の糖質分解酵素による水解作用を受けに
くい。したがって、この環状イソマルトオリゴ糖はサイ
クロデキストリンよりもはるかに安定であり、該環状オ
リゴ糖を用いた場合、従来のサイクロデキストリンに比
べて、より安定性の高い包接化合物を形成することがで
きるので、該環状オリゴ糖は、きわめて有用性の高い物
質であると言える。
【００２１】次に、このα−1,3−多分岐デキストラン
水解酵素の製造法について述べる。この酵素の製造法に
おいて使用される微生物としては、例えば本発明者らが
土壌中から取得した野性株のV−54菌株が挙げられる。
以下に、このV−54菌株の菌学的性質を示す。
水解酵素の製造法について述べる。この酵素の製造法に
おいて使用される微生物としては、例えば本発明者らが
土壌中から取得した野性株のV−54菌株が挙げられる。
以下に、このV−54菌株の菌学的性質を示す。
【００２２】 (1)形態 形態 0.5〜1.0μm x 1.5〜2.0μmの桿菌 運動性 なし 胞子 なし 胞子嚢 − 形 − 位置 − グラム染色性 陰性
【００２３】 (2)生育状態 肉汁寒天平板培養 平滑、非水溶性の黄色色素生産 肉汁寒天斜面培養 平滑、非水溶性の黄色色素生産
【００２４】 (3)生理学的性質 (ｉ) 硝酸塩の還元 陽性 (ii) 脱窒反応 陰性 (iii) ＭＲテスト 陰性 (iv) ＶＰテスト 陽性 (ｖ) インドールの生成 陰性 (vi) 硫化水素の生成 陽性 (vii) デンプンの加水分解 陽性 (viii)クエン酸の利用 陰性 (ix) 無機窒素源の利用 硝酸塩 陽性 アンモニウム塩 陽性 (ｘ) ウレアーゼ 陽性 (xi) オキシダーゼ 陽性 (xii) カタラーゼ 陽性 (xiii)生育の範囲 温度8〜40℃、pH5.5〜9.5 (xiv) 酸素に対する態度 好気的 (xv) Ｏ−Ｆテスト 酸化 (xvi) 糖類に対する態度 酸の生成 ガスの生成 (1)L-アラビノース ＋ − (2)D-キシロース ＋ − (3)D-グルコース ＋ − (4)D-マンノース ＋ − (5)D-フラクトース ＋ − (6)D-ガラクトース ＋ − (7)麦芽糖 ＋ − (8)ショ糖 ＋ − (9)トレハロース ＋ − (10)D-ソルビット − − (11)D-マンニット ＋ − (12)グリセリン ＋ − (13)デンプン ＋ −
【００２５】スフィンゴバクテリウム・エスピー．V−5
4菌株は、上記の諸性質さらに、菌体内の脂質としてス
フィンゴリピドを持つこと、主要なキノンがグラム陰性
菌にもかかわらずメナキノンであることよりスフィンゴ
バクテリウム属に属する細菌であると同定した。更に、
種の同定のために、バージェイズ・マニュアル・オブ・
システィマティック・バクテリオロジーに基づき、種々
検討したが、種の確定までには至らなかったため、スフ
ィンゴバクテリウム属に属する1菌株として分類同定し
た。
4菌株は、上記の諸性質さらに、菌体内の脂質としてス
フィンゴリピドを持つこと、主要なキノンがグラム陰性
菌にもかかわらずメナキノンであることよりスフィンゴ
バクテリウム属に属する細菌であると同定した。更に、
種の同定のために、バージェイズ・マニュアル・オブ・
システィマティック・バクテリオロジーに基づき、種々
検討したが、種の確定までには至らなかったため、スフ
ィンゴバクテリウム属に属する1菌株として分類同定し
た。
【００２６】なお、スフィンゴバクテリウム・エスピ
ー．V−54は、平成９年２月18日、工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM P-16086として寄託されている。
この酵素の製造法において使用される微生物としては、
上記菌株のほかスフィンゴバクテリウム(Sphingobacter
ium)属に属し、α−1,3−の多分岐デキストランから著
量のグルコースを生成するものであれば、如何なるもの
でもよい。
ー．V−54は、平成９年２月18日、工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM P-16086として寄託されている。
この酵素の製造法において使用される微生物としては、
上記菌株のほかスフィンゴバクテリウム(Sphingobacter
ium)属に属し、α−1,3−の多分岐デキストランから著
量のグルコースを生成するものであれば、如何なるもの
でもよい。
【００２７】本発明方法における菌株の培養は、原則的
には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じで
あるが、通常は、液体培地による振盪培養法または通気
撹拌培養法等が用いられる。
には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じで
あるが、通常は、液体培地による振盪培養法または通気
撹拌培養法等が用いられる。
【００２８】培地としては、適当な窒素源（例えば、ペ
プトン、ポリペプトン、バクトトリプトン等のカゼイン
分解物あるいはソイトン等の大豆蛋白質分解物等）、炭
素源（例えばグルコース、グリセリン等の糖質類）、そ
して必要により、酵母エキス、リボフラビン等のビタミ
ン類及びリン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、
微量金属等のミネラル類、そして本酵素の誘導基質とな
るデキストラン等を含有したものが用いられる。pHは、
本菌が成育するpH域ならばいずれでもよく、通常は、6
〜8の範囲が好ましい。
プトン、ポリペプトン、バクトトリプトン等のカゼイン
分解物あるいはソイトン等の大豆蛋白質分解物等）、炭
素源（例えばグルコース、グリセリン等の糖質類）、そ
して必要により、酵母エキス、リボフラビン等のビタミ
ン類及びリン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、
微量金属等のミネラル類、そして本酵素の誘導基質とな
るデキストラン等を含有したものが用いられる。pHは、
本菌が成育するpH域ならばいずれでもよく、通常は、6
〜8の範囲が好ましい。
【００２９】培養条件は、例えば、通常20〜40℃で、16
時間〜4日間振盪培養または通気撹拌培養を行なう。以
上の如くして得た培養物を用いて例えば、以下に示す酵
素精製工程により該多分岐デキストラン水解酵素を得
る。
時間〜4日間振盪培養または通気撹拌培養を行なう。以
上の如くして得た培養物を用いて例えば、以下に示す酵
素精製工程により該多分岐デキストラン水解酵素を得
る。
【００３０】上記培養物から該酵素を得るには、遠心分
離、膜濃縮等により集菌した菌体を更に超音波処理ある
いは界面活性剤処理して溶菌し、遠心分離して細胞残渣
を除去する。さらに、必要により、通常用いられる酵素
の精製法により上記粗酵素液から精製標品を得る。
離、膜濃縮等により集菌した菌体を更に超音波処理ある
いは界面活性剤処理して溶菌し、遠心分離して細胞残渣
を除去する。さらに、必要により、通常用いられる酵素
の精製法により上記粗酵素液から精製標品を得る。
【００３１】本酵素の精製法は、通常の酵素分離方法で
あれば如何なる方法でもよいが、本製造法の場合、菌体
を超音波処理あるいは界面活性剤処理して溶菌し、遠心
分離して細胞残渣を除去した上清液を実施例に示した精
製方法に従って処理することにより、高純度の多分岐デ
キストラン水解酵素標品を得ることが出来る。尚、本製
造法は、これらの精製法に限定されるものではない。さ
らに、本酵素を環状イソマルトオリゴ糖生成反応液に作
用させ、反応液中に存在する、分岐オリゴ糖特に分岐環
状オリゴ糖をグルコースと環状イソマルトオリゴ糖に水
解した後に環状オリゴ糖を分離精製する。尚、本製造法
の場合、精製酵素を用いずに、先に述べた細胞残渣を除
去した上清液を用いても精製酵素と同等の効率で分岐環
状イソマルトオリゴ糖を水解することができる。反応液
より該オリゴ糖を分離精製する手段としては、オリゴ糖
精製法であれば如何なる方法でもよい。例えば、冷却処
理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、あるいは特異的に
環状オリゴ糖を吸着するカラムクロマトグラフィー、活
性炭カラムクロマトグラフィー等の公知方法を単独もし
くは適宜組合わせて分離精製することができる。
あれば如何なる方法でもよいが、本製造法の場合、菌体
を超音波処理あるいは界面活性剤処理して溶菌し、遠心
分離して細胞残渣を除去した上清液を実施例に示した精
製方法に従って処理することにより、高純度の多分岐デ
キストラン水解酵素標品を得ることが出来る。尚、本製
造法は、これらの精製法に限定されるものではない。さ
らに、本酵素を環状イソマルトオリゴ糖生成反応液に作
用させ、反応液中に存在する、分岐オリゴ糖特に分岐環
状オリゴ糖をグルコースと環状イソマルトオリゴ糖に水
解した後に環状オリゴ糖を分離精製する。尚、本製造法
の場合、精製酵素を用いずに、先に述べた細胞残渣を除
去した上清液を用いても精製酵素と同等の効率で分岐環
状イソマルトオリゴ糖を水解することができる。反応液
より該オリゴ糖を分離精製する手段としては、オリゴ糖
精製法であれば如何なる方法でもよい。例えば、冷却処
理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、あるいは特異的に
環状オリゴ糖を吸着するカラムクロマトグラフィー、活
性炭カラムクロマトグラフィー等の公知方法を単独もし
くは適宜組合わせて分離精製することができる。
【００３２】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。
に説明する。
【００３３】〔実施例１〕1%デキストラン40（名糖産業
社製）、1%ペプトン（極東製薬工業社製）、0.5%NaCl及
び0.1%イーストエキス（ディフコ社製）からなる液体培
地（水道水使用、pH 7.0）100mlを500ml容坂口フラスコ
に入れ、120℃で20分間、殺菌処理を行なった。これ
に、スフィンゴバクテリウム・エスピー．V−54菌株（F
ERM P- 16086）保存スラントより1白金耳接種し、30℃
で1日間振盪培養した。本培養液を10mlずつ上記と同様
の培地組成と殺滅菌条件により調製した2Lの培地を含有
する3L容ミニジャーファーメンター8基に接種し、30
℃、0.5vvm、300rpmの条件で３日間通気撹拌培養を行な
い、培養終了後、培養液16Lを遠心分離処理により集菌
し、得られた約600mlの菌体懸濁液を200mlずつ超音波処
理により破砕し、遠心分離して細胞残渣を除去した。得
られた上清液約600mlを粗酵素液として用いて、多分岐
デキストラン水解酵素の精製を行なった。
社製）、1%ペプトン（極東製薬工業社製）、0.5%NaCl及
び0.1%イーストエキス（ディフコ社製）からなる液体培
地（水道水使用、pH 7.0）100mlを500ml容坂口フラスコ
に入れ、120℃で20分間、殺菌処理を行なった。これ
に、スフィンゴバクテリウム・エスピー．V−54菌株（F
ERM P- 16086）保存スラントより1白金耳接種し、30℃
で1日間振盪培養した。本培養液を10mlずつ上記と同様
の培地組成と殺滅菌条件により調製した2Lの培地を含有
する3L容ミニジャーファーメンター8基に接種し、30
℃、0.5vvm、300rpmの条件で３日間通気撹拌培養を行な
い、培養終了後、培養液16Lを遠心分離処理により集菌
し、得られた約600mlの菌体懸濁液を200mlずつ超音波処
理により破砕し、遠心分離して細胞残渣を除去した。得
られた上清液約600mlを粗酵素液として用いて、多分岐
デキストラン水解酵素の精製を行なった。
【００３４】先ず、本酵素液に対して、終濃度1.0Mにな
るように硫安を加え、遠心分離により不溶物を除去し
た。上澄液を以下の操作による分取用HPLCで精製した。
上澄液を100mlずつ1.0M硫安含有の100mMリン酸緩衝液(p
H7.0)で平衡化したTSKgel Phenyl5PWカラムにアプライ
し、同緩衝液で洗浄後、1.0〜0Mの硫安濃度勾配により
吸着蛋白質を溶出した。6回の操作により集めた活性画
分約500mlを限外濾過で約20mlに濃縮した後、10mMリン
酸緩衝液(pH7.0)約500mlを加えて塩濃度を稀釈した。再
度同希釈液を、限外濾過で約100mlに濃縮した。濃縮液
を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel DEAE5P
Wカラムにアプライし、同緩衝液で非吸着蛋白質を洗浄
した。本条件で、該酵素は全て非吸着画分に溶出してい
たので、非吸着画分約200mlを約20mlにまで濃縮後、10m
Mリン酸緩衝液(pH7.5)を180ml加えることにより、pHを
7.0から7.5に変更した。
るように硫安を加え、遠心分離により不溶物を除去し
た。上澄液を以下の操作による分取用HPLCで精製した。
上澄液を100mlずつ1.0M硫安含有の100mMリン酸緩衝液(p
H7.0)で平衡化したTSKgel Phenyl5PWカラムにアプライ
し、同緩衝液で洗浄後、1.0〜0Mの硫安濃度勾配により
吸着蛋白質を溶出した。6回の操作により集めた活性画
分約500mlを限外濾過で約20mlに濃縮した後、10mMリン
酸緩衝液(pH7.0)約500mlを加えて塩濃度を稀釈した。再
度同希釈液を、限外濾過で約100mlに濃縮した。濃縮液
を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel DEAE5P
Wカラムにアプライし、同緩衝液で非吸着蛋白質を洗浄
した。本条件で、該酵素は全て非吸着画分に溶出してい
たので、非吸着画分約200mlを約20mlにまで濃縮後、10m
Mリン酸緩衝液(pH7.5)を180ml加えることにより、pHを
7.0から7.5に変更した。
【００３５】本酵素液を再度、約100mlにまで限外濃縮
した後、濃縮液を10mMリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化し
たTSKgel DEAE5PWカラムに再度アプライした。同緩衝液
で非吸着蛋白質を洗浄した後、0〜0.5MのNaCl濃度勾配
により吸着蛋白質を溶出した。
した後、濃縮液を10mMリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化し
たTSKgel DEAE5PWカラムに再度アプライした。同緩衝液
で非吸着蛋白質を洗浄した後、0〜0.5MのNaCl濃度勾配
により吸着蛋白質を溶出した。
【００３６】活性は吸着溶出画分に認められたので、活
性画分40mlを集め、更に本酵素液を1.5mlまで限外濃縮
した。200mM NaCl含有の100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平
衡化したTSKgel G3000SWカラムに、0.3mlずつ酵素溶液
をアプライし、同緩衝液により溶出した。本操作を残り
1.2mlについて同様に行なった(0.3mlずつ4回)。得られ
た活性画分を集めてSDS PAGEに供したところ、シングル
バンドを示したことから、他の夾雑蛋白質は除去された
と判断し精製を終了した。本精製酵素をα−1,3−多分
岐デキストランとインキュベーションしたところ、多分
岐デキストランから著量のグルコースの生成が確認され
た。
性画分40mlを集め、更に本酵素液を1.5mlまで限外濃縮
した。200mM NaCl含有の100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平
衡化したTSKgel G3000SWカラムに、0.3mlずつ酵素溶液
をアプライし、同緩衝液により溶出した。本操作を残り
1.2mlについて同様に行なった(0.3mlずつ4回)。得られ
た活性画分を集めてSDS PAGEに供したところ、シングル
バンドを示したことから、他の夾雑蛋白質は除去された
と判断し精製を終了した。本精製酵素をα−1,3−多分
岐デキストランとインキュベーションしたところ、多分
岐デキストランから著量のグルコースの生成が確認され
た。
【００３７】〔実施例２〕バチルス・エスピー(Bacillu
s sp.)T−3040株(FERM BP-4132)の培養液300Lをマイク
ローザを用いた膜処理により除菌し、得られた除菌液を
更に分子量6000カットのフォロファイバーにより6.3Lに
まで濃縮した後、濃縮液を900mlずつ-20℃に凍結保存し
た。濃縮液の一部を、デキストラン（名糖産業社製）10
0gを10mMリン酸緩衝液(pH6.5)10Lに溶解した水溶液と混
合し、40℃で48時間インキュベーションを行なった。活
性炭を加えて煮沸することにより反応を停止させ、かつ
未反応のデキストランを吸着させた。活性炭を除去した
上清液を脱イオン水で平衡化した活性炭カラムにアプラ
イし、脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾配により
吸着したオリゴ糖を溶出した。環状オリゴ糖画分を集
め、濃縮した後、脱イオン水で平衡化したODSカラムに
アプライした。脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾
配によりオリゴ糖を溶出し、各環状イソマルトオリゴ糖
画分を集め、凍結乾燥した。サイクロイソマルトノナオ
ースの画分に、分岐環状イソマルトオリゴ糖が約5%程度
混入していた。
s sp.)T−3040株(FERM BP-4132)の培養液300Lをマイク
ローザを用いた膜処理により除菌し、得られた除菌液を
更に分子量6000カットのフォロファイバーにより6.3Lに
まで濃縮した後、濃縮液を900mlずつ-20℃に凍結保存し
た。濃縮液の一部を、デキストラン（名糖産業社製）10
0gを10mMリン酸緩衝液(pH6.5)10Lに溶解した水溶液と混
合し、40℃で48時間インキュベーションを行なった。活
性炭を加えて煮沸することにより反応を停止させ、かつ
未反応のデキストランを吸着させた。活性炭を除去した
上清液を脱イオン水で平衡化した活性炭カラムにアプラ
イし、脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾配により
吸着したオリゴ糖を溶出した。環状オリゴ糖画分を集
め、濃縮した後、脱イオン水で平衡化したODSカラムに
アプライした。脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾
配によりオリゴ糖を溶出し、各環状イソマルトオリゴ糖
画分を集め、凍結乾燥した。サイクロイソマルトノナオ
ースの画分に、分岐環状イソマルトオリゴ糖が約5%程度
混入していた。
【００３８】〔実施例３〕実施例２で得られた分岐環状
オリゴ糖の混入したサイクロイソマルトノナオース標品
の4%水溶液を調製し、この水溶液0.5mlを、実施例１の
菌体の超音波処理破砕液より調製した粗酵素液0.1ml、10
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）0.4mlと混和し、40℃で24時
間インキュベーションを行なった。本処理により、通常
のエキソ型酵素であるグルコアミラーゼ、グルコデキス
トラナーゼでは殆ど水解できなかった分岐環状オリゴ糖
をグルコースと環状オリゴ糖に水解できた。
オリゴ糖の混入したサイクロイソマルトノナオース標品
の4%水溶液を調製し、この水溶液0.5mlを、実施例１の
菌体の超音波処理破砕液より調製した粗酵素液0.1ml、10
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）0.4mlと混和し、40℃で24時
間インキュベーションを行なった。本処理により、通常
のエキソ型酵素であるグルコアミラーゼ、グルコデキス
トラナーゼでは殆ど水解できなかった分岐環状オリゴ糖
をグルコースと環状オリゴ糖に水解できた。
【００３９】
【発明の効果】本発明により、新規なα−1,3−多分岐
デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルト
オリゴ糖の製造法を提供した。本酵素は、環状イソマル
トオリゴ糖の分離精製時に混入している既存のエキソ型
グルコアミラーゼ、グルコデキストラナーゼ等では殆ど
水解されない分岐環状イソマルトオリゴ糖の分岐鎖を特
異的に水解でき、該環状オリゴ糖の精製を更に簡略化で
き且つ環状イソマルトオリゴ糖の純度の向上に寄与する
ことができた。従って、本発明は、産業上極めて有意義
である。
デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルト
オリゴ糖の製造法を提供した。本酵素は、環状イソマル
トオリゴ糖の分離精製時に混入している既存のエキソ型
グルコアミラーゼ、グルコデキストラナーゼ等では殆ど
水解されない分岐環状イソマルトオリゴ糖の分岐鎖を特
異的に水解でき、該環状オリゴ糖の精製を更に簡略化で
き且つ環状イソマルトオリゴ糖の純度の向上に寄与する
ことができた。従って、本発明は、産業上極めて有意義
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (3)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するα−1,3−
多分岐デキストラン水解酵素。 作用 α−1,3−結合の分岐を有する多分岐デキストランに作
用し、グルコースを生成する。 至適pH及び安定pH範囲 至適pHは、7.0付近であり、安定pH範囲は、5.5〜8.0で
ある。 基質特異性 グルコ2糖を基質とした場合には、α−1,2>α−1,4>α
−1,3>α−1,6 結合の順に良く作用する。多糖の場合に
は、デキストランに最も良く作用し、次いでα−1,3−
多分岐デキストランに良く作用するが、α−1,3−グル
カンであるムタンには殆ど作用しない。 阻害及び活性化 Hg2+、Cu2+、Ni2+及びFe2+等で90%以上阻害され、Ca2+
で約30%活性化される。 分子量 ゲル濾過法では約9万であり、SDS PAGE法では約8万であ
る。 作用適温の範囲 45℃付近に適温を有する。 温度等による失活の条件 45℃、15分間の処理で約30％、50℃、15分間の処理でほ
ぼ失活する。 - 【請求項２】 スフィンゴバクテリウム属に属し、α−
1,3−多分岐デキストラン水解酵素生産能を有する微生
物を、デキストランを含有する培地で培養し、培養物よ
り該酵素を採取することを特徴とするα−1,3−多分岐
デキストラン水解酵素の製造法。 - 【請求項３】 分岐環状イソマルトオリゴ糖に、α−1,
3−多分岐デキストラン水解酵素を作用させて環状イソ
マルトオリゴ糖を製造することを特徴とする環状イソマ
ルトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03769197A JP3607789B2 (ja) | 1997-02-21 | 1997-02-21 | α−１，３−多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03769197A JP3607789B2 (ja) | 1997-02-21 | 1997-02-21 | α−１，３−多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10229876A true JPH10229876A (ja) | 1998-09-02 |
| JP3607789B2 JP3607789B2 (ja) | 2005-01-05 |
Family
ID=12504594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03769197A Expired - Fee Related JP3607789B2 (ja) | 1997-02-21 | 1997-02-21 | α−１，３−多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3607789B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100363373C (zh) * | 2005-01-14 | 2008-01-23 | 庄茅 | 异麦芽低聚糖硫酸酯（imos）的制备方法 |
| JP2012140521A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Osaka Prefecture Univ | α−１，３−分枝シクロデキストランの使用方法 |
| CN112458130A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-09 | 陕西省微生物研究所 | 一种右旋糖酐发酵液直接酶解制备右旋糖酐40的方法 |
-
1997
- 1997-02-21 JP JP03769197A patent/JP3607789B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100363373C (zh) * | 2005-01-14 | 2008-01-23 | 庄茅 | 异麦芽低聚糖硫酸酯（imos）的制备方法 |
| JP2012140521A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Osaka Prefecture Univ | α−１，３−分枝シクロデキストランの使用方法 |
| CN112458130A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-09 | 陕西省微生物研究所 | 一种右旋糖酐发酵液直接酶解制备右旋糖酐40的方法 |
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| JP3607789B2 (ja) | 2005-01-05 |
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