JP2688782B2 - 糖転移活性の強い耐熱性α―ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、キャンディダ・ギリエルモンディー（Cand
ida guilliermondii）菌による糖転移活性の強い耐熱性
α−ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造法に関す
るものである。

［従来の技術］ α−ガラクトシダーゼは、動物組織、微生物、高等植
物の種子等に広く存在し、α−Ｄ−ガラクトシド結合を
加水分解してＤ−ガラクトースを遊離させる反応を触媒
する酵素である。この酵素は、19世紀末にメリビオース
を加水分解する酵素（メリビアーゼ）として酵母から抽
出されて以来、種々の起源のものが単離され研究されて
きた。特に利用面では、甜菜糖からの蔗糖の分離精製工
程において、蔗糖の結晶化を妨げるラフィノースを、蔗
糖とガラクトースに効率的に加水分解することを目的と
して研究された。しかしながら、α−ガラクトシダーゼ
の糖転移作用については、基質となるα−ガラクトシル
基をもつ化合物の安価な供給源が知られていなかった為
にほとんど研究されていなかった。一方、近年大豆オリ
ゴ糖を中心にα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖がビフ
ィズス因子など新たな機能性をもつものとして注目され
ている。このようなオリゴ糖あるいは配糖体の合成法と
しては、糖転移酵素又は加水分解酵素の糖転移作用を利
用する方法や縮合反応を利用する方法が開発されてい
る。このうち、糖転移作用を利用する方法は、縮合反応
によるオリゴ糖あるいは配糖体の合成とは違い、特定の
結合様式を持ったオリゴ糖あるいは配糖体のみを特異的
に合成できる。例えば、β−フラクトフラノシダーゼに
よるフラクトオリゴ糖、β−ガラクトシダーゼによるβ
−ガラクトオリゴ糖の製造がある。同様に、α−ガラク
トシダーゼの糖転移作用を利用してα−ガラクトシル基
を持ったオリゴ糖や配糖体等の有用化合物を製造する方
法が考えられる。この場合、高い収率を得る為には糖転
移活性の強い酵素が必要である。一方、縮合反応は加水
分解反応の逆反応で、どの加水分解酵素も利用できる。
しかし、高い収率を得る為には糖濃度を上げる必要があ
り、糖濃度を上げる為には溶解度の点から反応温度を高
める必要があることから耐熱性をもつ酵素が望ましい。

糖転移活性の強い微生物起源のα−ガラクトシダーゼ
としては、ピクノポラス・シナバリヌス（Pycnoporus c
innabarinus）由来のものや本発明者らが発見したシュ
ードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluoresc
ens）由来のものが知られているが、前者は高い耐熱性
も合せ持つが基質や反応生成物によって強く阻害を受
け、後者は基質や生成物による阻害を受けないが耐熱性
は低い。そこで、本発明者らは、このα−ガラクトシル
基を含むオリゴ糖の合成とその有効利用を目的として土
壌から糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼを
生産する菌の分離を試みた。

［発明が解決しようとする問題点］ したがって本発明の目的は、糖転移活性が強く且つ耐
熱性に優れたα−ガラクトシダーゼを安価に且つ大量に
生産し得る方法を提供することにある。

［問題点を解決する手段］ 本発明者らは、広く自然界より強いα−ガラクトシル
基の転移作用を持つ耐熱性α−ガラクトシダーゼを生産
する微生物を求めて検索した結果、キャンディダ・ギリ
エルモンディーの一菌株が、糖転移活性の強い耐熱性α
−ガラクトシダーゼおよびその複合物を培養上清中（菌
体外分泌型）あるいは菌体（細胞吸着型）に蓄積する事
実を見出し本発明に到達した。

すなわち、本発明のα−ガラクトシダーゼおよびその
複合物の製造方法は、キャンディダ・ギリエルモンディ
ーを培養することにより、培養物から糖転移活性の強い
耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物を得るこ
とを特徴とするものである。

なお、糖転移活性が強く、耐熱性に優れたα−ガラク
トシダーゼとは、基質としてメリビオースを用いた場
合、基質濃度が1M前後でもほとんど基質阻害を受けず、
生じたガラクトースの80％以上を転移することができる
活性を有すると共に、pH4.5の条件下で60℃にて60分間
以上加熱してもほとんど失活しないα−ガラクトシダー
ゼをいう。

以下に本発明を更に具体的に説明する。

本発明において使用するキャンディダ属菌は酵母に類
似する不完全菌類で、醸造場等糖類の多い場所に混入菌
として見出されるものである。

本発明に用いられるキャンディダ・ギリエルモンディ
ーは、この菌に属するもので、糖転移活性の強い耐熱性
α−ガラクトシダーゼを生産する能力を有する菌株なら
いずれも使用できる。具体的には、その例示菌株として
キャンディダ・ギリエルモンディー（Candida guillier
mondii）Ｈ−404が有効に利用される。キャンディダ・
ギリエルモンディーやそのテレオモルフ（Teleomorph）
であるピヒア・ギリエルモンディー（Pichia guillierm
ondii）起源のα−ガラクトシダーゼが報告されている
が、これは糖転移活性が極めて弱いα−ガラクトシダー
ゼであって、本発明の如く強い糖転移活性を有するもの
については全く報告されていない。また、生産されたα
−ガラクトシダーゼが、本菌によるα−ガラクトシダー
ゼの様に多成分によって構成されるものであることも報
告されていない。

次に、本発明者らの見出した一菌株の菌学的性質を示
すと、下記の通りである。

形態学的性質 （ａ）細胞の形態 液体倍地（48時間） 楕円形で単独とかたまりで存在。

（２−３）×（４−５）μｍ 寒天培地（48時間） 楕円形、長楕円形で単独に存在。

（２−３）×（７−６）μｍ （ｂ）培地での生育 液体培地（21日） 毛房状でない沈殿物を形成。皮膜を形成しないかリン
グ状の皮膜を形成 寒天斜面培地（21日） クリーム色で光沢があり表面は滑らか、偏平状 （ｃ）菌子体の形成 CMA上ではチェリーブラッサムタイプの仮性菌子体が
良く発達した。

PDA上では菌子を生じなかった。

（ｄ）無性胞子の形成 射出胞子、分節胞子、芽胞を形成しない。

（ｅ）有性胞子の形成 有性胞子を形成しない。

（ｆ）生理的性質 各炭素源に対する発酵性 グルコース ＋ ガラクトース − マルトース − シュークロース ＋ ラクトース − メリビオース − ラフィノース −（泡の形成） イヌリン − スターチ − メレジトース − トレハロース − α−メチル−Ｄ−グルコシド − セロビオース − 炭素化合物の同化性 グルコース ＋ ガラクトース ＋ ソルボース ＋ シュークロース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ トレハロース ＋ ラクトース − メリビオース ＋ ラフィノース ＋ メレジトース ＋ イヌリン ＋ 溶性澱粉 ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−アラビノース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ エタノール ＋ グリセロール ＋ エリスリトール − リビトール ＋ ガラクチトール ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−ソルビトール ＋ α−メチルグルコシド ＋ サリシン ＋ 乳酸 − コハク酸 ＋ クエン酸 ＋ イノシトール − グルコノラクトン ＋ グルコサミン ＋ メタノール − キシリトール ＋ 窒素化合物の同化性 硫酸アンモニウム ＋ 塩酸エチルアミン ＋ カダベリン ＋ 硝酸カリウム − リジン ＋ その他の生理的性質 油脂の分解性 − 生酸性 ＋ 37℃での生育 ＋ アルブチンの分解 ＋ ウレアーゼ活性 − 澱粉の生成 − ビタミン無添加培地での生育 − 100ppmシクロヘキシミド添加時の生育 ＋ 1000ppmシクロヘキシミド添加時の生育 ＋ 50％グルコース存在下での生育 − 60％グルコース存在下での生育 − 10％塩化ナトリウム存在下での生育 ＋ １％酢酸存在下での生育 − 以上の諸性状をザ イースト ア タキソノミック
スタディ 第３版（1984）の記載と照合することによ
り、本菌がキャンディダ・ギリエルモンディーであるこ
とを確認し、キャンディダ・ギリエルモンディー（Cand
ida guilliermondii）Ｈ−404と命名した。なお、本菌
は、微工研菌寄第11026号（FERM Ｐ−11026）として、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

本発明のキャンディダ・ギリエルモンディーにより糖
転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼ（本酵素）
を生産するためには、通常、メリビオース、ラフィノー
ス、スタキオース、ガラクトマンナンやその分解物単
独、あるいは、蔗糖、粉飴、ラクトース、澱粉に誘導物
質としてメリビオース、ラフィノース、スタキオース、
ガラクトマンナンやその分解物を添加したものを炭素源
として用い、全脂あるいは脱脂大豆、コーンスティープ
リカー、ポリペプトン、ソイトン、あるいは、酵母エキ
スのような有機または無機の窒素源を含む液体培地を用
いて、20〜40℃で、２〜14日間程度、好気的に培養すれ
ばよい。

本発明で得られる糖転移活性の強い耐熱性α−ガラク
トシダーゼ複合物とは、後述するα−ガラクトシダーゼ
ＩとIIの２つの成分から構成されるものであるが、菌体
外と菌体の両方に生産される酵素である為、液体培地の
場合、培養後濾過、あるいは、遠心分離によって得た培
養上清を粗酵素液としてそのまま利用できると共に、菌
体そのものを酵素剤として利用できる。培養上清から得
た粗酵素液は、そのまま使用できるが、例えば硫安沈殿
法や溶媒沈殿法並びに限外濾過法等の公知の方法によ
り、粗酵素濃縮液を得ることができる。細胞吸着型の酵
素も、溶剤や界面活性剤処理のような公知の方法により
流離の酵素とすることもできる。なお、この細胞吸着型
酵素は、菌体に吸着されているものと菌体内に保持され
ているものとがある。

このようにして得られた本発明のα−ガラクトシダー
ゼ複合物（本酵素複合物）は、以下に示すような諸性質
を有する。

（１）糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシダーゼの
多成分性 本酵素複合物は、イオン交換クロマトグラフィー（東
ソー（株）製、DEAE−トヨパール650M）によって２つの
成分に分離され、それぞれ等電点によって区別された。

α−ガラクトシダーゼＩは等電点6.16、α−ガラクト
シダーゼIIは等電点6.21であった。また、両酵素のゲル
濾過クロマトグラフィー（東ソー（株）製、トヨパール
HW−55F）を用いたゲル濾過法による分子量はほぼ同じ
で2.7×10⁵に相当した。

（２）作用 本酵素複合物は、終濃度4.4mMのα−ガラクトシル基
を持つ化合物にオルトニトロフェニル−α−ガラクトシ
ド＞パラニトロフェニル−α−ガラクトシド＞メリビオ
ース＞スタキオース＞ラフィノースの順でよく作用し
た。

（３）最適作用pH 本酵素複合物の最適作用pH範囲は、pH4〜５に認めら
れた。

（４）安定pH範囲 グリシン−HCl緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液の下で40℃１時間
放置した場合の本酵素複合物の安定pH範囲は、pH3.0〜
9.5であった。

（５）最適作用温度囲 本酵素複合物の最適作用温度は、約75℃であった。

（６）熱安定性 本酵素複合物を0.02M酢酸緩衝液（pH4.5）の下で60℃
で60分間加熱処理した結果、ほぼ100％の活性を維持し
た。

（７）糖転移活性 α−ガラクトシル基の供与体としては、本酵素が基質
となるα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖
体全てが利用できる。ここでは、基質としてメリビオー
スを用いて本酵素の糖転移活性を測定した。各種の濃度
のメリビオースに本酵素複合物を作用させ、反応によっ
て生じた遊離のグルコースとガラクトースをベーリンガ
ー・マンハイム社（西ドイツ）のＦキット（商品名）を
用いて定量した。その結果、第１図に示すように本酵素
複合物は、基質濃度が50mM前後から基質の切断によって
生じたガラクトースを転移反応に利用し始め、1M前後で
もほとんど基質阻害を受けず生じたガラクトースの80％
以上を転移するという強い転移活性を有していた。本酵
素複合物の代りに菌体そのものを酵素剤として用いて同
様の実験を行なった結果を第２図に示す。なお、第１図
および第２図において横軸は基質濃度を、縦軸は生成物
の量を示し、＋はメリビオースの分解によって生じたグ
ルコース量を、□はガラクトース量を示す。すなわち、
両者の差が糖転移作用に使われたガラクトース量を示し
ている。

（８）受容体特異性 基質として１％パラニトロフェニル−α−ガラクトシ
ド、受容体として４％のガラクトース、グルコース、マ
ンノース、キシロース、フラクトース、シュークロー
ス、グリセリンに本酵素複合物を作用させ反応生成物を
薄層クロマトグラフィーにより確認した。その結果、こ
の受容体の全ての場合に転移生成物が確認され、本酵素
は広い受容体特異性を持つことが確認された。

（９）精製法 遠心分離により得た培養上清を２倍量のエタノールを
用いて溶媒沈殿した。その沈澱を緩衝液に溶解した溶液
をイオン交換クロマトグラフィー（東ソー（株）製、DE
AE−トヨパール650M）に供し二つの活性画分に分離し
た。そこで、その活性画分をα−ガラクトシダーゼＩと
IIと名付け別々に精製した。まず、0.4飽和硫安存在下
で疎水クロマトグラフィー（東ソー（株）製、ブチルト
ヨパール650M）、続いてゲルクロマトグラフィー（東ソ
ー（株）製、トヨパールHW−55F）を行ない各々の精製
酵素標品を得た。この酵素標品はディスクゲル電気泳動
的に均一であった。

（10）α−ガラクトシダーゼの活性測定法 10mMパラニトロフェニル−α−ガラクトシド0.2mlと4
0mM酢酸緩衝液（pH4.5）0.2mlにα−ガラクトシダーゼ
溶液0.05mlを加えて40℃10分間反応させた。反応後、0.
2M炭酸ナトリウム0.5mlを加えて反応を止め、遊離した
パラニトロフェニール量を分光光度計にて400nmの吸光
度を計ることにより測定した。酵素活性１単位は、この
条件下で１分間に１μmoleのパラニトロフェノールを生
成する酵素量の定義した。

［発明の効果］ 以上のとおり、本発明の糖転移活性の強い耐熱性α−
ガラクトシダーゼ複合物は基質濃度が1M前後でもほとん
ど基質阻害を受けず、生じたガラクトースの80％以上を
転移するという強い糖転移活性をもっていた。また、受
容体特異性もガラクトース、グルコース、マンノース、
キシロース、フラクトース、シュークロース、グリセリ
ンと非常に広く、その酵素的性質がこれまで知られてい
る酵素に較べて優れていた。また、本酵素複合物は60℃
60分間の加熱処理においてもほとんど失活しないという
高い耐熱性をしていた。さらに、本酵素の生産菌体は菌
体そのものを酵素剤として利用可能であった。また、本
酵素複合物は前述のようにα−ガラクトシダーゼＩとII
とから構成されているが、これらの各成分を単独で使用
しても同様な効果が得ることができた。このような本酵
素の特徴は、α−ガラクトシダーゼの糖転移作用や縮合
反応を利用したα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖ある
いは配糖体の合成において著しい技術進歩をもたらした
ものである。

［実施例］ 次に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。

実施例１ １％ メリビオース、３％ ポリペプトン、0.5％
酵母エキス、0.05％ K₂HPO₄、0.01％ MgSO₄・7H₂O、
0.01％ KClを含む液体培地（pH7.0）60mlを500ml坂口
フラスコに入れ、常法によりオートクレーブにより殺菌
後キャンディダ・ギリエルモンディー（Candida guilli
ermondii）Ｈ−404を接種し、30℃で４日間振盪培養し
た。培養後、遠心分離により除菌し、得られた培養上清
についてα−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結
果、培養上清中の酵素活性は培養液1ml当り0.8単位であ
った。また、細胞吸着型の酵素活性は湿菌体1g当り約35
単位であった。

実施例２ 実施例１において、メリビオースに代えて、１％溶性
澱粉に0.1％メリビオースを誘導源として添加した培地
にキャンディダ・ギリエルモンディー（Candida guilli
ermondii）Ｈ−404を植菌し、30℃で４日間振盪培養し
た。培養後遠心分離によって得た培養上清についてα−
ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果、培養上清
中の酵素活性は培養液1ml当り0.6単位であった。また、
細胞吸着型の酵素活性は湿菌体1g当り約30単位であっ
た。

実施例３ 実施例１により得られた培養液から遠心分離により得
た培養上清を、まず、２倍量のエタノールを用いて溶媒
沈殿した。その沈澱を緩衝液に溶解した溶液をイオン交
換クロマトグラフィー（東ソー（株）製、DEAE−トヨパ
ール650M）に供し二つの活性画分に分離した。そこで、
その活性画分をα−ガラクトシダーゼＩとIIと名付け別
々に精製した。まず、0.4飽和硫安存在下で疎水クロマ
トグラフィー（東ソー（株）製、ブチルトヨパール650
M）、続いてゲルクロマトグラフィー（東ソー（株）
製、トヨパールHW−55F）を行ない各々の精製酵素標品
を得た。この精製法によりα−ガラクトシダーゼＩの比
活性は培養上清の約6700倍上昇し、この収率は約42％で
あった。また、α−ガラクトシダーゼIIは比活性が培養
上清の約5400倍上昇し、その収率は約26％であった。

実施例４ 1gのメリビオースと1gのシュークロースを含むpH4.5
の酢酸緩衝液5mlに実施例３によって得られたα−ガラ
クトシダーゼＩ精製酵素標品５単位を添加し、60℃で20
時間反応させた。反応液を10分間煮沸加熱し酵素を失活
させた後、反応液１μを濾紙にスポットしｎ−ブタノ
ール：ピリジン：水＝6:4:3の組成の溶媒系で４重展開
後、フロログルシン法によるケトース呈色を行なうと、
ラフィノースに相当する位置にスポットが検出された。
この反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーにかけ、
オリゴ糖類を吸着させた後、エチルアルコールの濃度勾
配により溶出させた。この３量体画分を集め、濃縮し凍
結乾燥標品1.1gを得た。本標品は、（ａ）α−ガラクト
シダーゼで加水分解するとガラクトースとシュークロー
スを等モル生成すること、（ｂ）β−フラクトシダーゼ
で加水分解すると、等モルのメリビオースとフラクトー
スを生成すること、（ｃ）α−ガラクトシダーゼとβ−
フラクトシダーゼとで加水分解するとガラクトース、グ
ルコース、フラクトースを１モルずつ生成すること、
（ｄ）ペーパークロマトグラフィーの移動度がラフィノ
ースと一致すること、以上のことからラフィノースであ
ると同定した。

実施例５ ガラクトース70gを含むpH4.5の酢酸緩衝液100mlに実
施例２によって得られた菌体（細胞吸着型酵素20単位）
を加え、60℃にて48時間反応させた。反応液を活性炭カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、オリゴ糖類を吸着させ
た後、エチルアルコール０％〜20％の濃度勾配により溶
出させた。溶出液を濃縮乾燥して脱水縮合生成物20gを
得た。この化合物は、酸で加水分解するとガラクトース
のみを生成し、ペーパークロマトグラフィーの移動度か
らガラクトビオースと同定した。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は基質のメリビオースに対する本酵
素複合物の糖転移作用を示すグラフで、第１図は酵素に
培養上清の酵素複合物を使用し、第２図は酵素に菌体そ
のものを用いたときの結果を示す。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】キャンディダ・ギリエルモンディー（Cand
   ida guilliermondii）に属する菌で糖転移活性の強い耐
   熱性α−ガラクトシダーゼを生産する能力を有する菌を
   培養することからなる糖転移活性の強い耐熱性α−ガラ
   クトシダーゼおよびその複合物の製造法。
2. 【請求項２】耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複
   合物がキャンディダ・ギリエルモンディーの菌体外分泌
   型酵素である請求項第（１）項記載の糖転移活性の強い
   耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造
   法。
3. 【請求項３】耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複
   合物がキャンディダ・ギリエルモンディーの細胞吸着型
   酵素である請求項第（１）項記載の糖転移活性の強い耐
   熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複合物の製造法。
4. 【請求項４】耐熱性α−ガラクトシダーゼおよびその複
   合物がキャンディダ・ギリエルモンディーの細胞吸着型
   酵素と菌体外分泌型酵素との混合物である請求項第
   （１）項記載の糖転移活性の強い耐熱性α−ガラクトシ
   ダーゼおよびその複合物の製造法。
5. 【請求項５】キャンディダ・ギリエルモンディーの菌株
   がキャンディダ・ギリエルモンディーＨ−404株である
   請求項第（１）項ないし第（４）項のいづれか１項記載
   の糖転移活性の強いα−ガラクトシダーゼおよびその複
   合物の製造法。