JP2000125857A - α−Ｌ−フコシダーゼ、その製造方法、菌株および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 糖鎖中のα１→２またはα１→３結合してい
るα−Ｌ−フコースを特異的に加水分解し、かつ糖転移
反応を触媒してα１→３結合したα−Ｌ−フコースを含
む三糖以上のオリゴ糖を生成する新規かつ有用なα−Ｌ
−フコシダーゼを提供する。 【解決手段】 アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ
−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株を液体培
地で培養し、培養液からα−Ｌ−フコシダーゼ画分を分
離、精製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規かつ有用なα
−Ｌ−フコシダーゼ、その製造方法、その生産菌である
新規かつ有用なアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ
−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株、前記α
−Ｌ−フコシダーゼを用いたα１→３結合したＬ−フコ
ースを含むオリゴ糖の製造方法、ならびにα１→３結合
したＬ−フコースを含む新規かつ有用なオリゴ糖に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】糖タンパク質や糖脂質中に含まれる複合
糖質の糖鎖の非還元未端あるいは枝分れ部分には、α−
Ｌ−フコシル基を含むものが多く見出されている。例え
ば、植物キシログルカン由来のフコースを含むオリゴサ
ッカライドにエリシター様の活性があることが報告され
ている。また、Ｌ−フコースを含む複合脂質中の糖鎖
は、血液型の型決定基、肝臓への血清糖タンパク質の取
り込み、マクロファージ遊走阻止因子の受容体、細胞−
細胞相互作用など、さまざまな生理活性を有していると
言われている。さらに細胞のガン化に伴い血中のＬ−フ
コース量が増加することが観察されている。

【０００３】α−Ｌ−フコシダーゼは糖鎖中のα−Ｌ−
フコシド結合を加水分解する酵素であり、複合糖質中の
糖鎖の構造解析や、構造と機能との関連あるいは生理活
性などを研究する上で、Ｌ−フコースを特異的にはすず
酵素試薬として重要な意味を持っている。一方、同様の
理由から、α−Ｌ−フコシダーゼのＬ−フコース転移能
を利用して、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を人工的に合
成することが求められている。しかしながら、フコース
を含む糖鎖の合成は一部のものが化学合成法または酵素
法によりなされているにすぎないのが現状である。

【０００４】すなわち、化学合成法においては、水酸基
のうちで反応に関与しない水酸基を保護した受容体の１
位を活性化し、残りの水酸基を保護した供与体を作用さ
せて縮合反応を行い、反応終了後に保護基を脱離させて
目的物を得るという繁雑な工程を必要とする。しかも、
工程の数が多いために必然的に収率は低いものとならざ
るを得ない。

【０００５】一方、酵素を用いてＬ−フコースを含むオ
リゴ糖を合成する試みは数多く行われている。例えば、
スベンソン（Svensson）およびチエム（Thime）は、ブ
タ肝臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、Ｌ−フコ
ースがα１→２またはα１→６結合したＬ−フコシル−
メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを合成している
（Carbohydr. Res., 200, 391-402. 1990）。しかしな
がら、このα−Ｌ−フコシダーゼは酵素活性が低く、ま
たこのα−Ｌ−フコシダーゼを用いてα１→３結合した
Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできな
い。

【０００６】また、微生物由来のα−Ｌ−フコシダーゼ
を用いてＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法と
して、特開平５−１３７５８９号公報には、コリネバク
テリウム属細菌由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、
糖転移反応を行わせることにより、α１→２結合したＬ
−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法が記載されて
いる。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼを用い
て、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製
造することはできない。

【０００７】さらに、特開平８−２４２８７６号公報に
は、アルカリジェネス属に属する細菌の生産するα−Ｌ
−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることに
より、α１→２結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の
製造方法が記載されている。しかしながら、このα−Ｌ
−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコー
スを含むオリゴ糖を製造することはできない。

【０００８】また、α１→３結合したＬ−フコースを含
むオリゴ糖の製造方法として、特開平４−９９４９２号
公報には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応
を行わせることにより、α１→３結合したＬ−フコース
を含むオリゴ糖の製造方法が記載されている。そして実
施例において、受容体としてＤ−グルコースまたはＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンの単糖を用いて糖転移反応
を行うことにより、Ｄ−グルコースまたはＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンにα−Ｌ−フコースがα１→３結合
した二糖類（オリゴ糖）を製造している。

【０００９】しかしながら、上記のα−Ｌ−フコシダー
ゼは、受容体としてＤ−ガラクトースを用いた場合には
糖転移反応は起こらない（Carbohydr. Res., 224, 291-
299(1992)）。またラクトースまたは１−Ｏ−メチルラ
クトース等の二糖類に糖転移反応を行った実施例はな
く、α−Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖以上のオ
リゴ糖を製造することはできない。従って、糖転移反応
受容体についてはスペクトラムが狭く、生体中での糖鎖
の生理活性を明らかにするための試薬としては不向きで
ある。

【００１０】またペニシリウム・マルチコラー（Penici
llium multicolor）由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Carb
ohydr. Res., 309, 125-129(1998)）も知られている
が、このα−Ｌ−フコシダーゼの受容体に対する特異性
は、前記特開平４−９９４９２号公報のアスペルギルス
・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−Ｌ−フコシ
ダーゼと同じであり、従って糖転移反応受容体について
はスペクトラムが狭く、生体中での糖鎖の生理活性を明
らかにするための試薬としては不向きである。

【００１１】以上のように、α−Ｌ−フコースがα１→
３結合した三糖以上のオリゴ糖を合成することができる
α−Ｌ−フコシダーゼはこれまで知られておらず、この
ため糖鎖の構造解析や、生体中での糖鎖の生理活性など
を研究する上で必要となるα１→３結合したα−Ｌ−フ
コースを含む三糖以上のオリゴ糖およびこのオリゴ糖を
合成することができるα−Ｌ−フコシダーゼが求められ
ている。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、生体中
の複合糖質中の糖鎖においてＬ−フコースを含むオリゴ
糖は構造上および生理活性上重要な位置を占めており、
特にα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は、
その新たな生理活性に興味が持たれるところである。従
って、糖転移反応受容体の種類や分子量に影響されるこ
となく、Ｌ−フコースを受容体の３位に選択的に糖転移
反応させ、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ
糖の製造方法が求められている。

【００１３】本発明の課題は、天然高分子基質、オリゴ
糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に
加水分解し、しかもα１→３結合したα−Ｌ−フコース
を含む三糖以上のオリゴ糖を合成することができる新規
かつ有用なα−Ｌ−フコシダーゼを提供することであ
る。本発明の他の課題は、上記α−Ｌ−フコシダーゼを
容易に製造することができるα−Ｌ−フコシダーゼの製
造方法を提案することである。本発明の別の課題は、上
記α−Ｌ−フコシダーゼを生産する新規かつ有用なアル
カリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcali
genes sp. KSF-9687）菌株を提供することである。本発
明のさらに別の課題は、上記α−Ｌ−フコシダーゼを用
いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を
効率よく製造することができるオリゴ糖の製造方法を提
案することである。本発明のさらに別の課題は、α１→
３結合したＬ−フコースを含む新規かつ有用なオリゴ糖
を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は次のα−Ｌ−フ
コシダーゼ、その製造方法、その生産菌株および用途で
ある。 （１）次の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコシダー
ゼ。 作用 ・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ
−フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを
遊離する。 ・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容
体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を
行い、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。 加水分解での基質特異性 ・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→
２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解
する。 ・合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピ
ラノシドを加水分解する。 ・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→
４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用し
ない。 糖転移反応での特異性 ・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容
体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を
行い、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を
生成する。 ・α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコ
ースを含むオリゴ糖は生成しない。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 ・至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であり、安定ｐＨ範囲
は、４５℃で１時間の保持条件においてｐＨ６．０〜
９．０である。 至適温度および安定温度範囲 ・至適温度は５５℃であり、ｐＨ７．０で１０分間処理
した時、５０℃まで安定であり、６５℃以上で失活す
る。 阻害剤などの影響 ・酵素活性は銅、水銀またはパラクロルメルクリ安息香
酸により著しく阻害されるが、その他の金属イオン、Ｓ
Ｈ試薬および糖によりほとんど影響を受けない。 分子量 ・ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２，０００で
ある。 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１，０
００である。 （２）アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８
７（Alcaligenes sp.KSF-9687）菌株由来であることを
特徴とする上記（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ。 （３）上記（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を
有することを特徴とするアルカリジェネス・スピーシス
・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌
株。 （４）アルカリジェネス（Alcaligenes）属に属し、菌
体内および菌体外にα−Ｌ−フコシダーゼを生産する能
力を有する微生物を培養し、培養物より上記（１）記載
のα−Ｌ−フコシダーゼを採取することを特徴とするα
−Ｌ−フコシダーゼの製造方法。 （５）微生物がアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ
−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株である上
記（４）記載の製造方法。 （６）Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコースの受容体
とを含む溶液に、上記（１）または（２）記載のα−Ｌ
−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行うことを特徴
とするα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の
製造方法。 （７）Ｌ−フコースの供与体がｐ−ニトロフェニル−α
−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリ
ドである上記（６）記載の製造方法。 （８）Ｌ−フコースの受容体が単糖または二糖以上のオ
リゴ糖である上記（６）または（７）記載の製造方法。 （９）Ｌ−フコースの受容体がＤ−ガラクトース、１−
Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、ラク
トースまたはＮ−アセチルラクトサミンである上記
（６）ないし（８）のいずれかに記載の製造方法。 （１０）下記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース。

【化７】 （１１）下記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３）−Ｄ−マンノース。

【化８】 （１２）下記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース。

【化９】 （１３）下記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３’）−ラクトース。

【化１０】 （１４）下記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトース。

【化１１】 （１５）下記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミン。

【化１２】 （式中、Ａｃはアセチル基である。）

【００１５】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼはアルカリ
ジェネス（Alcaligenes）属に属する菌株から得ること
ができる。アルカリジェネス属に属する菌株としては、
α−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有するものであればいか
なる菌株でも使用することができ、これらの菌株の変異
株でも使用することができる。アルカリジェネス属に属
するα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する菌株の具体例
としては、例えばアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳ
Ｆ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株があげ
られる。この菌株の菌学的性質は次の通りである。

【００１６】《形態的所見》 （１）細胞の形態、大きさ：桿菌、０．７〜０．８×
１．５〜２．５μｍ （２）多形性：なし （３）運動性：あり （４）胞子：なし （５）べん毛：周ベん毛 （６）グラム染色性：陰性

【００１７】《生育状態》 （１）肉汁寒天平板培養 集落の形状は円形であり、周縁は平滑で、表面隆起は扁
平状である。また、集落の色調は半透明である。 （２）肉汁液体培養 生育し混濁する。 （３）ゼラチン穿刺培養 液化しない。

【００１８】 《生理学的性質》 （１）硝酸塩の還元 ：陽性 （２）色素の生成 ：陰性 （３）インドールの生成：陰性 （４）デンプンの分解 ：陰性 （６）クエン酸の利用 ：陽性 （８）カタラーゼ ：陽性 （９）オキシダーゼ ：陽性 （１０）ＭＲテスト ：陰性 （１１）ＶＰテスト ：陰性 （１２）エスクリンの加水分解：陰性 （１３）脱窒反応 ：陽性 （１４）ポリヒドロキシ酪酸の蓄積：陽性 （１５）栄養要求性：陰性 （１６）リジンデカルボキシラーゼ：陽性 （１７）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 （１８）オルニチンデカルボキシラーゼ：陽性 （１９）生育温度 ：１５〜４２℃ 至適温度 ：３０〜３７℃ （２０）生育ｐＨ ：６．０〜９．０ 至適ｐＨ ：７．０〜８．０ （２１）酸素に対する態度：好気性 （２２）糖鎖からの酸およびガスの生成（＋：生成、−：生成せず） 酸 ガス Ｄ−グルコース − − Ｄ−フルクトース − − Ｄ−ガラクトース − − Ｄ−キシロース − − 麦芽糖 − − 乳糖 − − ショ糖 − − Ｄ−マンニトール − −

【００１９】《その他》後述する酵素学的および理化学
的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを菌体内および菌
体外に産出する。

【００２０】以上の性質から、Bergey's Manual of Sys
tematic Bacteriologyを参照し、この菌株をアルカリジ
ェネスに属する菌株と同定し、アルカリジェネス・スピ
ーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-968
7）と命名した。最も類似した性質を示すものとしてア
ルカリジェネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes de
nitrificans）があげられる。本菌株は、工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６９４４の受
託番号で寄託されている。

【００２１】次に、上記アルカリジェネス・スピーシス
・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenessp. KSF-9687）菌株
により生産される本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの酵素
学的および理化学的性質について説明する。 （１）酵素の作用 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリ
ゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的
に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。またα−Ｌ−
フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単
糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、Ｌ−
フコースを含む二糖または三糖以上のオリゴ糖を生成す
る。

【００２２】（２）加水分解での基質特異性 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリ
ゴ糖または合成基質中のα１→２またはα１→３結合し
ているＬ−フコースを加水分解する。また合成基質であ
るｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド（ｐ−
ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド）を加水分解する。
しかし、天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中の
α１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには
作用しない。

【００２３】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの種々のα
−Ｌ−フコシド結合含有基質に対する酵素活性を表１に
示した。表１から明らかなように、本発明のα−Ｌ−フ
コシダーゼはｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドの
ような合成基質、ならびにα−Ｌ−フコピラノシル−
（１→２’）−ラクトース（２′−フコシルラクトー
ス）、α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクト
ース（３′−フコシルラクトース）などのオリゴ糖およ
びムチン等の天然基質に作用することが分かる。すなわ
ち、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは、合成基質中のα
−Ｌ−フコシド結合を加水分解し、またオリゴ糖鎖中の
α１→２またはα１→３結合しているフコースを加水分
解することが分かる。一方、オリゴ糖鎖中および天然高
分子基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−
フコースには作用しないことが分かる。なお、表１中の
相対活性は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドに
対する活性を１００として表示した。

【００２４】

【表１】 ＊１ Ｆｕｃ：Ｌ−フコース ＰＮＰ：ｐ−ニトロフェニル Ｌａｃ：ラクトース ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース

【００２５】（３）糖転移反応での基質特異性 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応に
おいて、Ｌ−フコースの供与体となる化合物は、α−Ｌ
−フコシド結合しているＬ−フコースを有する化合物で
ある。供与体の具体的なものとしては、ｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−
α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシル
フルオリドなどがあげられる。本発明のα−Ｌ−フコシ
ダーゼが触媒する糖転移反応において、Ｌ−フコースの
受容体となる化合物は、Ｄ−ガラクトース、１−Ｏ−メ
チル−Ｄ−ガラクトースおよびＤ−マンノースなどの単
糖；ラクトースおよびＮ−アセチルラクトサミンなどの
二糖以上のオリゴ糖等である。

【００２６】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する
糖転移反応では、α１→３結合したＬ−フコースを含む
オリゴ糖が選択的に生成し、α１→２、α１→４または
α１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成し
ない。すなわち、上記受容体の３位にＬ−フコースがα
１→３フコシド結合したオリゴ糖だけが生成する。糖転
移反応により生成するオリゴ糖は、二糖以上のオリゴ糖
である。例えば、受容体として単糖を用いた場合には、
この受容体にＬ−フコースがα１→３結合した二糖のオ
リゴ糖が生成し、受容体として二糖を用いた場合には、
この受容体にＬ−フコースがα１→３結合した三糖のオ
リゴ糖が生成する。

【００２７】（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 加水分解および糖転移反応の至適ｐＨはｐＨ７．０〜
８．０である。安定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間の処理
条件の場合、ｐＨ６．０〜９．０である。

【００２８】（５）力価の測定法 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの加水分解活性の測定
は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質とし
て、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、５０℃で反
応を行い、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
を加えて反応を停止させた後、遊離したｐ−ニトロフェ
ノールの量を４１０ｎｍ吸光度を測定することにより行
うことができる。酵素の単位は１分間に１μｍｏｌのｐ
−ニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニットとし
た。その他の基質については、ｐＨ７．０のリン酸カリ
ウム緩衝液中、５０℃で３０分間反応を行った後、沸騰
浴中３分間加熱して反応を停止し、次に遠心分離し、そ
の上清中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来の
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを用いて測定することに
より行うことができる。あるいは、ピリジルアミノ化に
より蛍光ラベルした基質および生成物を高速液体クロマ
トグラフィーで分析することにより測定することもでき
る。

【００２９】また糖転移反応の活性の測定方法は次のよ
うにして行うことができる。すなわち、Ｌ−フコース供
与体と、受容体となるオリゴ糖とを緩衝液などに溶解
し、この溶液に本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを添加
し、３７℃付近で反応を行う。反応後、薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）などを用いて、反応生成物を確認する。

【００３０】（６）至適温度および安定温度 加水分解および糖転移反応の至適温度は５５℃である。
安定温度範囲は、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液中
に各温度で１０分間保温して残存活性を測定した時、５
０℃まで安定であり、５５℃で約６０％残存活性を示
す。

【００３１】（７）ｐＨ、温度による失活の条件 ６５℃で１０分間の処理により完全に失活する。またｐ
Ｈ１１以上において４５℃で６０分間の処理によって完
全に失活する。

【００３２】（８）阻害剤等の影響 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼに対する種々の添加物質
の影響について検討したところ、加水分解および糖転移
反応において、銅（０．１ｍＭ）、水銀（０．１ｍＭ）
またはパラクロルメルクリ安息香酸（０．５ｍＭ）によ
り著しく阻害されたが、その他の金属イオン（１ｍＭ）
およびＳＨ試薬（１ｍＭ）によりほとんど影響を受けな
い。また加水分解反応は、生成物であるＬ−フコース
（１ｍＭ）によりほとんど影響を受けない。

【００３３】（９）精製方法 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの精製は、既知の精製法
が単独または併用して利用され得る。本発明のα−Ｌ−
フコシダーゼは菌体内および菌体外に生産されるが、酵
素の精製には菌体外酵素を用いる方が望ましい。例え
ば、培養液を濾過または遠心分離にかけ菌体を除去し、
次いで塩析法、各種クロマトグラフ法等を適宜に組み合
せて行うことができる。精製法の一例を次に示す。

【００３４】培養終了後、ストリームライン−ディアエ
（ファルマシア製）に菌体を含む培養物を通し、吸着し
た酵素を溶出する。活性画分を最終濃度１Ｍになるよう
硫酸アンモニウムを加え、ブチルトヨパール６５０Ｍカ
ラムに通し、活性画分を溶出する。活性画分を集め、フ
コース−セルロファインカラムに通し、吸着した酵素を
溶出する。活性画分を、一晩透析を行い、ＦＰＬＣ−Ｍ
ｏｎｏ Ｑカラムに通し、活性画分を溶出する。溶出さ
れた活性画分はこの時点で電気泳動的に単一バンドを示
すが、ポリッシングのためセファクリルＳ−３００ＨＲ
カラムを用いてゲル濾過を行うこともできる。

【００３５】（１０）分子量 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの分子量は、ＰＡＧＥ
（ポリアクリルアミドゲル電気電気泳動）法により約１
０２，０００と測定された。

【００３６】（１１）ポリアクリルアミド電気泳動 精製されたα−Ｌ−フコシダーゼは、ＰＡＧＥおよびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において単一のバンドを示し
た。また、この時の分子量はそれぞれ１０２，０００、
５１，０００と測定された。

【００３７】以上のような本発明のα−Ｌ−フコシダー
ゼは菌体内および菌体外に生産されるため、菌から酵素
を得る際には菌体外に生産された酵素を分離するだけで
容易に得ることができる。例えば、菌の培養液からα−
Ｌ−フコシダーゼを分離するだけで容易に得ることがで
きる。このため、菌体を破砕して活性画分を抽出する操
作を必要としないので、工業的生産に適している。また
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは中性付近に至適ｐＨを
有し、しかも熱に安定であるので、糖鎖の構造解析や機
能の研究に好適に利用することができる。

【００３８】上記性質をもつ新規なα−Ｌ−フコシダー
ゼを用いることによって、α１→３結合したＬ−フコー
スを含むオリゴ糖の製造方法を確立した。本発明による
Ｌ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法を以下に詳細に
記述する。本発明のオリゴ糖の製造方法は、Ｌ−フコー
スの供与体と、Ｌ−フコースの受容体とを含む溶液に、
前記本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反
応を行って、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリ
ゴ糖を製造する方法である。

【００３９】上記Ｌ−フコースの供与体としては、ｐ−
ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロ
フェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコ
ピラノシルフルオリドなどがあげられる。これらの供与
体は精製品はもちろん、これらの化合物を含む化合物な
どを用いることもできる。上記Ｌ−フコースの受容体と
しては、Ｄ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−マンノースなどの単糖；ラクトースまた
はＮ−アセチルラクトサミンなどの二糖以上のオリゴ糖
等があげられる。これらの受容体は精製品はもちろん、
これらの糖を含む糖などを用いることもできる。

【００４０】本発明のオリゴ糖の製造方法では、前記本
発明のα−Ｌ−フコシダーゼを用いているので、α１→
３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を選択的に製造
することができる。すなわち、本発明のオリゴ糖の製造
方法では、α１→２、α１→４またはα１→６結合した
Ｌ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。本発明のオ
リゴ糖の製造方法で選択的に得られるオリゴ糖は、前記
受容体の３位にＬ−フコースがα１→３フコシド結合し
たオリゴ糖、すなわちα−Ｌ−フコピラノシル（１→
３）基を含むオリゴ糖である。

【００４１】本発明のオリゴ糖の製造方法では、受容体
を選択することにより、二糖または三糖以上のオリゴ糖
を製造することができる。例えば受容体として単糖を用
いることにより、Ｌ−フコースがα１→３結合した二糖
のオリゴ糖を製造することができる。また、受容体とし
て二糖を用いることにより、Ｌ−フコースがα１→３結
合した三糖のオリゴ糖を製造することができる。

【００４２】本発明のオリゴ糖の製造方法の好ましい方
法として、次の方法が例示できる。まず、リン酸カリウ
ム緩衝液と、ジメチルスルフォキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドおよびアセトニトリル等の水溶性有機溶
媒からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒と
の混合溶液を調製する。この混合溶液に前記受容体およ
び供与体を添加し、２７℃〜６０℃、好ましくは３５℃
〜５５℃の間で６時間〜７２時間、好ましくは１８時間
〜４８時間反応させる。このときの受容体および供与体
の濃度は０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．
１重量％〜１０重量％とするのが望ましい。また受容体
と供与体との混合比は、重量比で１：１〜２０：１、好
ましくは２：１〜１０：１とするのが望ましい。反応温
度は２７℃〜６０℃、好ましくは３５℃〜５５℃とする
のが望ましい。反応ｐＨは６〜９、好ましくはｐＨ７〜
８とするのが望ましい。使用するα−Ｌ−フコシダーゼ
は精製したほうが好ましいが、粗精製の酵素を使用する
こともできる。

【００４３】上記のような方法によりＬ−フコースの糖
転移反応を行うことにより、α１→３結合したＬ−フコ
ースを含むオリゴ糖を選択的に容易に製造することがで
きる。このような方法により製造することができるオリ
ゴ糖の具体的なものとしては、前記式（１）で表される
α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトー
ス、前記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−
（１→３）−Ｄ−マンノース、前記式（３）で表される
α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル
−Ｄ−ガラクトース、前記式（４）で表されるα−Ｌ−
フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース、前記式
（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→
３’）−１−Ｏ−メチルラクトース、前記式（６）で表
されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−ア
セチルラクトサミンなどがあげられる。これらはいずれ
も新規な化合物であり、糖鎖の構造解析、糖の機能の研
究および糖の代謝の研究などに有用であるほか、生理活
性が期待される。

【００４４】

【発明の効果】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは新規か
つ有用である。本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高
分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシ
ド結合を特異的に加水分解し、しかもα１→３結合した
α−Ｌ−フコースを含む三糖以上のオリゴ糖を合成する
ことができるので、糖鎖の構造解析や機能の研究に有用
である。

【００４５】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法
は、アルカリジェネスに属する微生物の培養物からα−
Ｌ−フコシダーゼを採取しているので、上記α−Ｌ−フ
コシダーゼを容易に製造することができる。

【００４６】本発明のアルカリジェネス・スピーシス・
ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株は
新規かつ有用である。この菌株は上記α−Ｌ−フコシダ
ーゼ生産能を有しており、しかも菌体外にこの酵素を生
産するので、この菌株を用いることにより、α−Ｌ−フ
コシダーゼを容易に製造、精製することができる。

【００４７】本発明のＬ−フコースを含むオリゴ糖の製
造方法は、上記α−Ｌ−フコシダーゼを用いて糖転移反
応を行っているので、α１→３結合したＬ−フコースを
含むオリゴ糖を容易に製造することができる。

【００４８】本発明のα１→３結合したＬ−フコースを
含むオリゴ糖は新規な化合物であり、糖鎖の構造解析、
糖の機能の研究および糖の代謝の研究などに有用であ
る。

【００４９】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００５０】実施例１ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド０．０５重量
％、グルコース１重量％、ペプトン０．５重量％、カザ
ミノ酸０．２５重量％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１重量％、Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２重量％および寒天２重量％
を含む培地をｐＨ９．０に調整した。また静岡県掛川市
より採取した土壌を滅菌水により希釈し、土壌懸濁液と
した。この土壌懸濁液を上記培地からなる平板培地上に
広げ、３７℃で２日間培養を行った。培養後、培地中の
黄色く発色しているコロニーを分離した。このようにし
てアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７
（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株をスクリーニングし
た。

【００５１】実施例２ 《α−Ｌ−フコシダーゼの製造》ペプトン０．５重量
％、酵母エキス０．２５重量％、塩化ナトリウム０．５
重量％（ｐＨ７．２）を含む培地５００ｍｌにアルカリ
ジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligene
s sp. KSF-9687）菌株を植菌し、容振とう培養して種培
養液とした。次いで種培養と同組成の培地３ literを５
liter容ジャーファーメンター３基に入れ、１２１℃で
２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液を接種し、
３７℃で２日間、毎分３ literの通気量と毎分３００回
転の攪拌速度の条件で培養した。

【００５２】培養終了後、予め１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したストリ
ームライン−ディアエカラム（ファルマシア製、５．０
×１７ｃｍ）に菌体を含む培養物を通し、吸着した酵素
を０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液
で溶出した。活性画分を集め、最終濃度１Ｍになるよう
に硫酸アンモニウムを溶解した。１Ｍ硫酸アンモニウム
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したブチルヨ
パール６５０Ｍカラム（東ソー製、２．６×３０ｃｍ）
に通し、１Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。溶
出された活性画分を集めて予め１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したフコースセルロファインカ
ラム（１．６×７．５ｃｍ）に通し、吸着した酵素を５
０ｍＭ Ｌ−フコースを含む同緩衝液で溶出した。活性
画分を一晩１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透
析を行った。次に同緩衝液にて平衡化したＦＰＬＣ−Ｍ
ｏｎｏ Ｑ（ファルマシア製）に通し、吸着した酵素を
０Ｍ〜０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。

【００５３】この時点で当酵素は電気泳動的に単一バン
ドを与えるが、ポリッシングのため活性画分を濃縮後セ
ファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア製、１．６×
６０ｃｍ）を行い、α−Ｌ−フコシダーゼの精製標品７
４μｇ（比活性１２６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、収率２０重量
％）を得た。

【００５４】実施例３ 実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼの種々の基質
に対する加水分解活性を次のようにして測定した。ｐ−
ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質とした場合
は、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１
００μｌの酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃
で１５分間反応を行った後、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１０．０）を加えて反応を停止させた。次に、遊
離したｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍ吸光度を
測定することにより定量した。その他の基質については
ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１００
μｌの酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃で３
０分間反応を行った後、沸騰浴中で３分間加熱して反応
を停止し、次に遠心分離し、上清中の遊離Ｌ−フコース
量をシュードモナス由来のＬ−フコースデヒドロゲナー
ゼを用いて定量した。結果は表１に示した通りである。

【００５５】実施例４ 《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクト
ースの合成》Ｌ−フコースの受容体としての単糖のＤ−
ガラクトース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体
としてのｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド
（５０ｍｇ）とを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、１０ｍｌ）とジメチルスルフォキシド（１０
００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、
実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７
℃で４８時間糖転移反応を行った。

【００５６】得られた反応物を活性炭素カラムクロマト
グラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール
水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二
糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒
を蒸留で留去したところ、非晶性固体を２０．５ｍｇ得
た。このときの回収率は１８重量％であった。

【００５７】この非晶性固体の分子量を測定したところ
３２６であった。また¹Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られた
スペクトルを解析した。得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペク
トラムを図１に示す。これらの結果から、得られた非晶
性固体は前記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース（３−フコピラノシ
ル−Ｄ−ガラクトース）であることが判明した。

【００５８】実施例５ 《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノー
スの合成》Ｌ−フコースの受容体としての単糖のＤ−マ
ンノース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体とし
てのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（１０
０ｍｇ）とを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０、１０ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（１０
００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、
実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７
℃で４８時間糖転移反応を行った。

【００５９】得られた反応物を活性炭素カラムクロマト
グラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール
水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二
糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒
を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０．３ｍｇ得
た。このときの回収率は９重量％であった。

【００６０】この非晶性固体の分子量を測定したところ
３２６であった。また¹Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られた
スペクトルを解析した。得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペク
トラムを図２に示す。これらの結果から、得られた非晶
性固体は前記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３）−Ｄ−マンノース（３−フコピラノシル
−Ｄ−マンノース）であることが判明した。

【００６１】実施例６ 《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチ
ル−Ｄ−ガラクトースの合成》Ｌ−フコースの受容体と
しての単糖の１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（３０
０ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロ
フェニルα−Ｌ−フコピラノシド（２４ｍｇ）とを、１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍ
ｌ）とディメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混
合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られ
たα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転
移反応を行った。

【００６２】得られた反応物を活性炭素カラムクロマト
グラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール
水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二
糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒
を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０ｍｇ得た。
このときの回収率は２３重量％であった。

【００６３】この非晶性固体の分子量を測定したところ
３４０であった。また¹Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られた
スペクトルを解析した。得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペク
トラムを図３に示す。これらの結果から、得られた非晶
性固体は前記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース
（３−フコピラノシル−１−Ｏ−メチルガラクトース）
であることが判明した。

【００６４】実施例７ 《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース
の合成》Ｌ−フコースの受容体としての二糖のラクトー
ス（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ
−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（５０ｍｇ）
とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、
４．２ｍｌ）とジメチルスルフォキシド（４２０μｌ）
との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で
得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時
間糖転移反応を行った。

【００６５】得られた反応物を活性炭素カラムクロマト
グラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール
水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、三
糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒
を蒸留で留去したところ、非晶性固体を２０．５ｍｇ得
た。このときの回収率は２３重量％であった。

【００６６】この非晶性固体の分子量を測定したところ
４８８であった。また¹Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られた
スペクトルを解析した。得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペク
トラムを図４に示す。これらの結果から、得られた非晶
性固体は前記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３’）−ラクトース（３′−フコピラノシル
−ラクトース）であることが判明した。

【００６７】実施例８ 《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メ
チルラクトースの合成》Ｌ−フコースの受容体としての
二糖の１−Ｏ−メチルラクトース（３００ｍｇ）と、Ｌ
−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ
−フコピラノシド（２４ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とディメチル
スルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解し
た。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコ
シダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行っ
た。

【００６８】得られた反応物を活性炭素カラムクロマト
グラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール
水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二
糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒
を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０ｍｇ得た。
このときの回収率は２３重量％であった。

【００６９】この非晶性固体の分子量を測定したところ
５０２であった。また¹Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られた
スペクトルを解析した。得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペク
トラムを図５に示す。これらの結果から、得られた非晶
性固体は前記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトース（３′−
フコピラノシル−１−Ｏ−メチルラクトース）であるこ
とが判明した。

【００７０】実施例９ 《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチ
ルラクトサミンの合成》Ｌ−フコースの受容体としての
二糖のＮ−アセチルラクトサミン（５００ｍｇ）と、Ｌ
−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ
−フコピラノシド（３０ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０、５．０ｍｌ）とディメチル
スルフォキシド（５００μｌ）との混合溶液に溶解し
た。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコ
シダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行っ
た。

【００７１】得られた反応物を活性炭素カラムクロマト
グラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール
水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二
糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒
を蒸留で留去したところ、非晶性固体を８．４ｍｇ得
た。このときの回収率は１５重量％であった。

【００７２】この非晶性固体の分子量を測定したところ
５２９であった。また¹Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られた
スペクトルを解析した。得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペク
トラムを図６に示す。これらの結果から、得られた非晶
性固体は前記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシ
ル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミン（３′−
フコピラノシル−Ｎ−アセチルラクトサミン）であるこ
とが判明した。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトラ
ムである。

【図２】実施例５で得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトラ
ムである。

【図３】実施例６で得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトラ
ムである。

【図４】実施例７で得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトラ
ムである。

【図５】実施例８で得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトラ
ムである。

【図６】実施例９で得られた¹Ｈ−ＮＭＲのスペクトラ
ムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｐ 19/18 //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:05） (72)発明者 中山 礎 静岡県藤枝市前島二丁目１番33−401号 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF05E FF09E FF11E FF12E FF14E LL03 LL05 4B064 AF02 AF03 AF04 CA21 CB07 CB30 CC01 CD09 CD30 CE06 CE10 CE11 DA13 4B065 AA12X AC12 AC14 AC15 BA23 BB01 BB03 BB23 BB29 BC01 BC03 BC05 BC09 BD14 BD17 CA29 CA31 CA46 CA60 4C057 AA02 AA03 BB02 BB03 BB04 CC01 CC04

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコ
   シダーゼ。 作用 ・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ
   −フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを
   遊離する。 ・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容
   体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を
   行い、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。 加水分解での基質特異性 ・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→
   ２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解
   する。 ・合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピ
   ラノシドを加水分解する。 ・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→
   ４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用し
   ない。 糖転移反応での特異性 ・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容
   体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を
   行い、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を
   生成する。 ・α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコ
   ースを含むオリゴ糖は生成しない。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 ・至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であり、安定ｐＨ範囲
   は、４５℃で１時間の保持条件においてｐＨ６．０〜
   ９．０である。 至適温度および安定温度範囲 ・至適温度は５５℃であり、ｐＨ７．０で１０分間処理
   した時、５０℃まで安定であり、６５℃以上で失活す
   る。 阻害剤などの影響 ・酵素活性は銅、水銀またはパラクロルメルクリ安息香
   酸により著しく阻害されるが、その他の金属イオン、Ｓ
   Ｈ試薬および糖によりほとんど影響を受けない。 分子量 ・ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２，０００で
   ある。 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１，０
   ００である。
2. 【請求項２】 アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ
   −９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株由来であ
   ることを特徴とする請求項１記載のα−Ｌ−フコシダー
   ゼ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のα−Ｌ−フコシダーゼ生
   産能を有することを特徴とするアルカリジェネス・スピ
   ーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-968
   7）菌株。
4. 【請求項４】 アルカリジェネス（Alcaligenes）属に
   属し、菌体内および菌体外にα−Ｌ−フコシダーゼを生
   産する能力を有する微生物を培養し、培養物より請求項
   １記載のα−Ｌ−フコシダーゼを採取することを特徴と
   するα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法。
5. 【請求項５】 微生物がアルカリジェネス・スピーシス
   ・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株
   である請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコース
   の受容体とを含む溶液に、請求項１または２記載のα−
   Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行うことを特
   徴とするα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖
   の製造方法。
7. 【請求項７】 Ｌ−フコースの供与体がｐ−ニトロフェ
   ニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−
   α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシル
   フルオリドである請求項６記載の製造方法。
8. 【請求項８】 Ｌ−フコースの受容体が単糖または二糖
   以上のオリゴ糖である請求項６または７記載の製造方
   法。
9. 【請求項９】 Ｌ−フコースの受容体がＤ−ガラクトー
   ス、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノー
   ス、ラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンである
   請求項６ないし８のいずれかに記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 下記式（１）で表されるα−Ｌ−フコ
    ピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース。 【化１】
11. 【請求項１１】 下記式（２）で表されるα−Ｌ−フコ
    ピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノース。 【化２】
12. 【請求項１２】 下記式（３）で表されるα−Ｌ−フコ
    ピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラク
    トース。 【化３】
13. 【請求項１３】 下記式（４）で表されるα−Ｌ−フコ
    ピラノシル−（１→３’）−ラクトース。 【化４】
14. 【請求項１４】 下記式（５）で表されるα−Ｌ−フコ
    ピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトー
    ス。 【化５】
15. 【請求項１５】 下記式（６）で表されるα−Ｌ−フコ
    ピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミ
    ン。 【化６】 （式中、Ａｃはアセチル基である。）