JP2797081B2 - アスペルギルスフミガーツス突然変異菌及び当該菌または菌の生産酵素を利用したキトサン−オリゴ糖の製造方法 - Google Patents
アスペルギルスフミガーツス突然変異菌及び当該菌または菌の生産酵素を利用したキトサン−オリゴ糖の製造方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アスペルギルスフ
ミガーツス突然変異菌および当該突然変異菌を用いたキ
トサン−オリゴ糖の製造方法に関し、より詳細には、ア
スペルギルスフミガーツス突然変異菌が生産するキトサ
ン−オリゴ糖分解酵素を用い、天然資源としてカニやエ
ビなどの甲殻類に大量に含まれるキトサンを有効利用す
る、キトサンからキトサン−オリゴ糖（Ｃｈｉｔｏｓａ
ｎ−Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を製造する方法
に関する。
ミガーツス突然変異菌および当該突然変異菌を用いたキ
トサン−オリゴ糖の製造方法に関し、より詳細には、ア
スペルギルスフミガーツス突然変異菌が生産するキトサ
ン−オリゴ糖分解酵素を用い、天然資源としてカニやエ
ビなどの甲殻類に大量に含まれるキトサンを有効利用す
る、キトサンからキトサン−オリゴ糖（Ｃｈｉｔｏｓａ
ｎ−Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を製造する方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】キチン、すなわちβ−１，４−ポリ−Ｎ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン（β−１，４−ｐｏｌｙ
−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）
は、節足動物、菌類等の主要多糖類であり、天然では蛋
白質と結合して糖蛋白の形で存在する。この糖蛋白から
アルカリで蛋白質を除去し、キチンを得ることができ
る。キチンは塩酸で加水分解すれば単糖類であるＤ−グ
ルコサミン塩酸塩となるが、濃アルカリ溶液で加熱し、
脱アセチル化すればキトサンを得ることができる。
−アセチル−Ｄ−グルコサミン（β−１，４−ｐｏｌｙ
−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）
は、節足動物、菌類等の主要多糖類であり、天然では蛋
白質と結合して糖蛋白の形で存在する。この糖蛋白から
アルカリで蛋白質を除去し、キチンを得ることができ
る。キチンは塩酸で加水分解すれば単糖類であるＤ−グ
ルコサミン塩酸塩となるが、濃アルカリ溶液で加熱し、
脱アセチル化すればキトサンを得ることができる。
【０００３】キトサンは、Ｄ−グルコサミン、すなわち
２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースがβ−１，
４結合で縮重合した塩基性多糖類である。カニやエビ等
の甲殻類に含有されるキチンから、濃アルカリ溶液中で
の加熱や脱アセチル化を経て得るため、キトサンの分子
量はキチン分子量よりやや小さくなる。
２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースがβ−１，
４結合で縮重合した塩基性多糖類である。カニやエビ等
の甲殻類に含有されるキチンから、濃アルカリ溶液中で
の加熱や脱アセチル化を経て得るため、キトサンの分子
量はキチン分子量よりやや小さくなる。
【０００４】キトサンは分子内に反応性の遊離アミノ基
を有し、天然高分子凝集剤として廃水処理に利用され、
また、化学的にも高分子材料として興味が持たれ、その
利用研究が活発に行われている。
を有し、天然高分子凝集剤として廃水処理に利用され、
また、化学的にも高分子材料として興味が持たれ、その
利用研究が活発に行われている。
【０００５】ここに、「キトサン−オリゴ糖」とは、Ｄ
−グルコサミンがβ−１，４結合で２乃至１０個結合し
たキトサン由来のオリゴ糖をいう。キチン由来のオリゴ
糖を脱Ｎ−アセチル化して得たキトサンを、部分加水分
解して得ることができる。
−グルコサミンがβ−１，４結合で２乃至１０個結合し
たキトサン由来のオリゴ糖をいう。キチン由来のオリゴ
糖を脱Ｎ−アセチル化して得たキトサンを、部分加水分
解して得ることができる。
【０００６】キトサン−オリゴ糖は、医薬、食品、化粧
品、農業等の分野において、抗腫瘍性や生理活性機能を
有することが知られている。キトサン自体は水に不溶で
あるが、キトサン−オリゴ糖は水に可溶であり、キトサ
ン特有の苦味と渋味がなく、しかも優れた生理活性機能
を有する。
品、農業等の分野において、抗腫瘍性や生理活性機能を
有することが知られている。キトサン自体は水に不溶で
あるが、キトサン−オリゴ糖は水に可溶であり、キトサ
ン特有の苦味と渋味がなく、しかも優れた生理活性機能
を有する。
【０００７】例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
が６つ結合したＮ−アセチルキトヘキサオーズ（Ｇｌｃ
ＮＡｃ６）やＤ−グルコサミンが６つ結合したキトヘキ
サオーズ（ＧｌｃＮ６）が、マウスの移植腫瘍に対する
腫瘍転移抑制効果、免疫増強作用及び感染防御作用を有
するとの報告がある（Ｃａｒｂｏ−ｈｙｄ，Ｒｅｓ．，
１５１，４０３（１９８６））。
が６つ結合したＮ−アセチルキトヘキサオーズ（Ｇｌｃ
ＮＡｃ６）やＤ−グルコサミンが６つ結合したキトヘキ
サオーズ（ＧｌｃＮ６）が、マウスの移植腫瘍に対する
腫瘍転移抑制効果、免疫増強作用及び感染防御作用を有
するとの報告がある（Ｃａｒｂｏ−ｈｙｄ，Ｒｅｓ．，
１５１，４０３（１９８６））。
【０００８】また、植物には、病虫害に対する自己防御
能力の復活作用と植物細胞の活性化を誘導し、農業分野
に活用できる。また、植物病原菌の増殖抑制作用があ
り、土壌改良剤あるいは天然性農薬として開発が期待さ
れている（日本化学工業４４．１０．３０〜６３．（１
９９１））。
能力の復活作用と植物細胞の活性化を誘導し、農業分野
に活用できる。また、植物病原菌の増殖抑制作用があ
り、土壌改良剤あるいは天然性農薬として開発が期待さ
れている（日本化学工業４４．１０．３０〜６３．（１
９９１））。
【０００９】さらに、ホットケーキシロップ、ヨーグル
ト、飲料、漬け物食品などの食品保存剤や低カロリー、
低甘味度の新規糖質素材として開発も期待されている
（日本化学工業４４．１０．３０〜６３．（１９９
１））。
ト、飲料、漬け物食品などの食品保存剤や低カロリー、
低甘味度の新規糖質素材として開発も期待されている
（日本化学工業４４．１０．３０〜６３．（１９９
１））。
【００１０】また、酵素に関しては、食品分野では機能
性食品の重要性と共に新規な酵素の市場開発の加速化が
予測されている。実際日本だけでも数百億ウォンの各種
オリゴ糖が既に商業化されている。他の分野でも、例え
ば、アメリカで研究中のコレステロールレダクターゼを
利用した摂取抑制研究で、商業化により年１億ドル以上
の新しい市場が形成される可能性がある（日本化学工業
４４．１０．３０〜６３．（１９９１））。
性食品の重要性と共に新規な酵素の市場開発の加速化が
予測されている。実際日本だけでも数百億ウォンの各種
オリゴ糖が既に商業化されている。他の分野でも、例え
ば、アメリカで研究中のコレステロールレダクターゼを
利用した摂取抑制研究で、商業化により年１億ドル以上
の新しい市場が形成される可能性がある（日本化学工業
４４．１０．３０〜６３．（１９９１））。
【００１１】一方、このように優れた生理活性を有する
キトサンーオリゴ糖の製造方法としては、（１）酸加水
分解法、（２）酵素分解法、（３）糖転移反応利用法等
が知られている。
キトサンーオリゴ糖の製造方法としては、（１）酸加水
分解法、（２）酵素分解法、（３）糖転移反応利用法等
が知られている。
【００１２】（１）酸加水分解法 ラプリ（Ｒｕｐｌｅｙ）が１９６４年度に、酸加水分解
によりキチンを分解し、その生成物を活性炭−ゼオライ
トカラムを利用して単離し、単糖から５糖のＮ−アセチ
ルキトペンタオーズまでを得ている。また、最近ではＨ
ＰＬＣ用カラムを併用してキチン−オリゴ糖が製造され
ている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．
８３，２４５．１９６４））。さらに、特開昭６１−２
１１０２号公報には、酸加水分解の改良法であって、キ
トサンに１０規定以上の濃い塩酸を、キトサン重量の５
乃至３０倍量加えて温度６０乃至１００℃、１乃至４時
間で部分加水分解させて高重合度のオリゴ糖を得たこと
が開示されている。しかし、酸加水分解法は大量の酸
と、加熱を要し製造原価が上昇し、廃液処理も必要とな
り２次的な環境汚染誘発の可能性が生ずる点で問題とな
る。
によりキチンを分解し、その生成物を活性炭−ゼオライ
トカラムを利用して単離し、単糖から５糖のＮ−アセチ
ルキトペンタオーズまでを得ている。また、最近ではＨ
ＰＬＣ用カラムを併用してキチン−オリゴ糖が製造され
ている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．
８３，２４５．１９６４））。さらに、特開昭６１−２
１１０２号公報には、酸加水分解の改良法であって、キ
トサンに１０規定以上の濃い塩酸を、キトサン重量の５
乃至３０倍量加えて温度６０乃至１００℃、１乃至４時
間で部分加水分解させて高重合度のオリゴ糖を得たこと
が開示されている。しかし、酸加水分解法は大量の酸
と、加熱を要し製造原価が上昇し、廃液処理も必要とな
り２次的な環境汚染誘発の可能性が生ずる点で問題とな
る。
【００１３】（２）酵素分解法 海水で分離された中温性細菌ビブリオアングィラルム
（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）Ｅ−３８３
ａをキチンを含有する液体培地（表−１の培地Ａ）で３
５℃、１６日間振盪培養し、Ｎ，Ｎ’−アセチルキトビ
オース（ＧｌｃＮＡｃ２）が得られている（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３．１５３７〜１５４１，
（１９８９））。しかし、当該ビブリオアングィラルム
Ｅ−３８３ａを利用する方法は、加水分解率が５３％と
低く、１６日間という長時間の培養を要する点で問題が
ある。
（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）Ｅ−３８３
ａをキチンを含有する液体培地（表−１の培地Ａ）で３
５℃、１６日間振盪培養し、Ｎ，Ｎ’−アセチルキトビ
オース（ＧｌｃＮＡｃ２）が得られている（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３．１５３７〜１５４１，
（１９８９））。しかし、当該ビブリオアングィラルム
Ｅ−３８３ａを利用する方法は、加水分解率が５３％と
低く、１６日間という長時間の培養を要する点で問題が
ある。
【００１４】温泉で分離した好熱性細菌であるバシラス
リケニホルミスＸ−７ｕを利用し、液体培地（表−１の
培地Ｂ）で５０℃で３．５日間の回転振盪培養により、
Ｎ，Ｎ’−アセチルキトトリオース（ＧｌｃＮＡｃ３）
が得られている（日本農芸化学会誌６３，７，１１９９
〜１２０５，１９８９）。しかし、当該バシラスリケニ
ホルミスＸ−７ｕを利用する方法は、加水分解率が７２
％と比較的高く、得られたキチン−オリゴ糖も３糖であ
るが、３．５日間も回転振盪しなければならない点で問
題がある。
リケニホルミスＸ−７ｕを利用し、液体培地（表−１の
培地Ｂ）で５０℃で３．５日間の回転振盪培養により、
Ｎ，Ｎ’−アセチルキトトリオース（ＧｌｃＮＡｃ３）
が得られている（日本農芸化学会誌６３，７，１１９９
〜１２０５，１９８９）。しかし、当該バシラスリケニ
ホルミスＸ−７ｕを利用する方法は、加水分解率が７２
％と比較的高く、得られたキチン−オリゴ糖も３糖であ
るが、３．５日間も回転振盪しなければならない点で問
題がある。
【００１５】また、バシラス属Ｎｏ．７−Ｍに由来する
キトサン分解酵素であるキトサナーゼを利用し、２糖か
ら５糖までのキトサン−オリゴ糖が得られている（Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１．（１９８９））。
しかし、そのほとんどは単糖である。
キトサン分解酵素であるキトサナーゼを利用し、２糖か
ら５糖までのキトサン−オリゴ糖が得られている（Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１．（１９８９））。
しかし、そのほとんどは単糖である。
【００１６】また、土壌で分離されたキトサン分解菌シ
ュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）
を培地（表−１の培地Ｃ）中で、温度２５℃で３乃至１
０日間培養し、種子菌を接種し２６乃至２８℃で培養し
たところ、その二日後から培地内にキトサナーゼを分泌
し、培地内酵素量のピークは４日目であったと報告され
ている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４．１
２，３３４１〜３３４３，１９９０）。しかし、土壌で
分離された当該シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐｐ．）を利用する方法では、加水分解率と生
産物が不明である。
ュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）
を培地（表−１の培地Ｃ）中で、温度２５℃で３乃至１
０日間培養し、種子菌を接種し２６乃至２８℃で培養し
たところ、その二日後から培地内にキトサナーゼを分泌
し、培地内酵素量のピークは４日目であったと報告され
ている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４．１
２，３３４１〜３３４３，１９９０）。しかし、土壌で
分離された当該シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐｐ．）を利用する方法では、加水分解率と生
産物が不明である。
【００１７】（３）糖転移反応利用法 ノカディア・オリエンタルリス（Ｎｏｃａｒｄａ ｏｒ
ｉｅｎｔａｌｉｓ）またはトリコドマ・レーシ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉ）由来のキチナーゼを利
用し、硝酸緩衝液中でＮ−アセチルキトテトラオーズ
（４糖）（５乃至１０重量％）を基質として糖転移反応
により６糖の白色沈澱を得、一方、５糖を基質として上
記と同様に操作して７糖を得ている。しかし、当該方法
は基質濃度、反応温度及びｐＨの影響を強く受けるが加
水分解率は低く３４％である。このため、既存のキチン
−オリゴ糖の４糖と２糖とを要し、また、加水分解率も
低いという欠点がある。
ｉｅｎｔａｌｉｓ）またはトリコドマ・レーシ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉ）由来のキチナーゼを利
用し、硝酸緩衝液中でＮ−アセチルキトテトラオーズ
（４糖）（５乃至１０重量％）を基質として糖転移反応
により６糖の白色沈澱を得、一方、５糖を基質として上
記と同様に操作して７糖を得ている。しかし、当該方法
は基質濃度、反応温度及びｐＨの影響を強く受けるが加
水分解率は低く３４％である。このため、既存のキチン
−オリゴ糖の４糖と２糖とを要し、また、加水分解率も
低いという欠点がある。
【００１８】上記問題を解決すべく、効率が高く、所望
の重合度を有するキトサン−オリゴ糖の製造方法の開発
が熱望されている。
の重合度を有するキトサン−オリゴ糖の製造方法の開発
が熱望されている。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記従来
技術の問題点を解決するため鋭意研究した結果、アスペ
ルギルスフミガーツス突然変異菌が生産するキトサンを
分解する酵素または前記アスペルギルスフミガーツス突
然変異菌自体を利用することにより、加水分解率が高
く、経済的かつ環境汚染を起こさずキトサン−オリゴ糖
を製造できることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
技術の問題点を解決するため鋭意研究した結果、アスペ
ルギルスフミガーツス突然変異菌が生産するキトサンを
分解する酵素または前記アスペルギルスフミガーツス突
然変異菌自体を利用することにより、加水分解率が高
く、経済的かつ環境汚染を起こさずキトサン−オリゴ糖
を製造できることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
【００２０】すなわち本発明は、キトサンをキトサン−
オリゴ糖に分解する性質を持つ韓国科学技術院遺伝工学
研究所に受託番号ＫＣＴＣ０１３９ＢＰ号で寄託された
アスペルギルスフミガーツス突然変異菌を提供するもの
である。また、前記アスペルギルスフミガーツス突然変
異菌を培養して菌糸体を収穫し、得られた菌糸体をキト
サンと反応させることを特徴とするキトサン−オリゴ糖
の製造方法を提供するものである。以下、本発明を詳細
に説明する。
オリゴ糖に分解する性質を持つ韓国科学技術院遺伝工学
研究所に受託番号ＫＣＴＣ０１３９ＢＰ号で寄託された
アスペルギルスフミガーツス突然変異菌を提供するもの
である。また、前記アスペルギルスフミガーツス突然変
異菌を培養して菌糸体を収穫し、得られた菌糸体をキト
サンと反応させることを特徴とするキトサン−オリゴ糖
の製造方法を提供するものである。以下、本発明を詳細
に説明する。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明は、アスペルギルスフミガ
ーツス突然変異菌を培養し、培養により生産された菌糸
体を回収し、その菌糸体をキトサンと５０乃至６０℃、
特に好ましくは６０℃で、１０乃至６０分、特に好まし
くは３０分間反応させることによりキトサン−オリゴ糖
を製造する。このため酸加水分解法のように、塩酸の使
用や加熱が不要である。また、このように培養された菌
糸体を使用するため、酵素を用いる過程で、塩析等の操
作が不要となり、かつ簡単で短い時間に高い加水分解率
でキトサン−オリゴ糖の製造ができる。
ーツス突然変異菌を培養し、培養により生産された菌糸
体を回収し、その菌糸体をキトサンと５０乃至６０℃、
特に好ましくは６０℃で、１０乃至６０分、特に好まし
くは３０分間反応させることによりキトサン−オリゴ糖
を製造する。このため酸加水分解法のように、塩酸の使
用や加熱が不要である。また、このように培養された菌
糸体を使用するため、酵素を用いる過程で、塩析等の操
作が不要となり、かつ簡単で短い時間に高い加水分解率
でキトサン−オリゴ糖の製造ができる。
【００２２】本発明の、キトサン−オリゴ糖の製造方法
において、アスペルギルスフミガーツス突然変異菌の培
養のための培地は、蒸留水１リットルに対し、キトサン
５乃至１５ｇ、酵母エキス０．２５乃至１．０ｇ、硝酸
アンモニウム０．５乃至２．０ｇ、塩化ナトリウム０．
２５乃至１．５ｇ、リン酸第２カリウム０．５乃至２．
０ｇ、リン酸第２ナトリウム２．０乃至５ｇ、硫酸マグ
ネシウム０．２５乃至１．０ｇ、塩化カルシウム０．０
２乃至０．１ｇ、寒天１０乃至２０ｇ、硝酸１０ｍｌか
らなることが好ましく、前記アスペルギルスフミガーツ
ス突然変異菌の培養は、液体培地で温度２０乃至３０
℃、７０乃至１５０ｒｐｍで３乃至６日間の振盪培養で
あることが好ましい。
において、アスペルギルスフミガーツス突然変異菌の培
養のための培地は、蒸留水１リットルに対し、キトサン
５乃至１５ｇ、酵母エキス０．２５乃至１．０ｇ、硝酸
アンモニウム０．５乃至２．０ｇ、塩化ナトリウム０．
２５乃至１．５ｇ、リン酸第２カリウム０．５乃至２．
０ｇ、リン酸第２ナトリウム２．０乃至５ｇ、硫酸マグ
ネシウム０．２５乃至１．０ｇ、塩化カルシウム０．０
２乃至０．１ｇ、寒天１０乃至２０ｇ、硝酸１０ｍｌか
らなることが好ましく、前記アスペルギルスフミガーツ
ス突然変異菌の培養は、液体培地で温度２０乃至３０
℃、７０乃至１５０ｒｐｍで３乃至６日間の振盪培養で
あることが好ましい。
【００２３】前記菌糸体とキトサンとの反応は、温度範
囲５０乃至６０℃、ｐＨ４．０乃至５．０、反応時間１
０乃至６０分間で行ない、キトサンの濃度は、１乃至５
重量％であることが好ましい。
囲５０乃至６０℃、ｐＨ４．０乃至５．０、反応時間１
０乃至６０分間で行ない、キトサンの濃度は、１乃至５
重量％であることが好ましい。
【００２４】本発明のアスペルギルスフミガーツス突然
変異菌の培養は、表−１に示す培地Ｄを用いることが好
ましい。
変異菌の培養は、表−１に示す培地Ｄを用いることが好
ましい。
【００２５】（酵素生産菌の分離）本発明による酵素生
産菌は、キトサンを含有する培地（表−１の培地Ｄ）で
キトサン分解機能を調べ、キトサン加水分解率が最も高
い菌株を選別した。選別された菌の特徴を表−２に示
す。
産菌は、キトサンを含有する培地（表−１の培地Ｄ）で
キトサン分解機能を調べ、キトサン加水分解率が最も高
い菌株を選別した。選別された菌の特徴を表−２に示
す。
【００２６】（菌学的性質）選別された菌をスライド培
養し、光学顕微鏡で形態的性質を観察した。菌糸の太さ
は４〜６μｍであり、その一部が肥大する。分生胞子柄
の太さは６〜９μｍ、長さは３００〜５００μｍであ
り、菌糸から垂直に分枝する。分生子表面は滑らかであ
る。ツァペック寒天平板培地での集落の色は、初期は黄
褐色であったが、培養期間の経過と共にだんだん褐色に
変わった。Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ（Ａｉ−ｎｓｗｏｒｔ
ｈ， Ｇ．Ｃ．Ｓｐｒｒｗ， Ｆ．Ｋ． ａｎｄ Ｓｕ
ｓｓｍａｎ Ａ．Ｓ．：Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ， Ｖｏｌ
４Ａ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， ｐｐ ４５〜６８（１９７３））及びＴｈ
ｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ｐａｐｅ
ｒ， Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆｅｎｎｅｌｌ， Ｄ．Ｉ．：
Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ， Ｒｏ
ｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｒｉｅｇｅ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｈｕｎｔ
ｉｎｇｔ−ｏｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ １３〜
５７７（１９７３））等の分類書及びユビキノンシステ
ムの結果から、アスペルギルスフミガーツスと確認し、
アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１と命名した。
養し、光学顕微鏡で形態的性質を観察した。菌糸の太さ
は４〜６μｍであり、その一部が肥大する。分生胞子柄
の太さは６〜９μｍ、長さは３００〜５００μｍであ
り、菌糸から垂直に分枝する。分生子表面は滑らかであ
る。ツァペック寒天平板培地での集落の色は、初期は黄
褐色であったが、培養期間の経過と共にだんだん褐色に
変わった。Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ（Ａｉ−ｎｓｗｏｒｔ
ｈ， Ｇ．Ｃ．Ｓｐｒｒｗ， Ｆ．Ｋ． ａｎｄ Ｓｕ
ｓｓｍａｎ Ａ．Ｓ．：Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ， Ｖｏｌ
４Ａ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， ｐｐ ４５〜６８（１９７３））及びＴｈ
ｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ｐａｐｅ
ｒ， Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆｅｎｎｅｌｌ， Ｄ．Ｉ．：
Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ， Ｒｏ
ｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｒｉｅｇｅ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｈｕｎｔ
ｉｎｇｔ−ｏｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ １３〜
５７７（１９７３））等の分類書及びユビキノンシステ
ムの結果から、アスペルギルスフミガーツスと確認し、
アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１と命名した。
【００２７】（寄託）本発明者は、本発明のアスペルギ
ルスフミガーツスＫＢ−１を１９９４年１２月１５日付
けで韓国科学技術院遺伝工学研究所に寄託し、受託番号
は第ＫＣＴＣ０１３９ＢＰである。
ルスフミガーツスＫＢ−１を１９９４年１２月１５日付
けで韓国科学技術院遺伝工学研究所に寄託し、受託番号
は第ＫＣＴＣ０１３９ＢＰである。
【００２８】アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１を保
管する場合は、ポテトデキストロース液体培地（ｐｏｔ
ａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）１００ｍｌに
アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１を接種し２５℃、
１２０ｒｐｍで５日間振盪培養し、得た菌浮遊液を無菌
的に６枚のチーズクロースで濾して菌糸を除去し、次い
で１，５００ｒｐｍで遠心分離し分生胞子を得、これを
保管する。
管する場合は、ポテトデキストロース液体培地（ｐｏｔ
ａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）１００ｍｌに
アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１を接種し２５℃、
１２０ｒｐｍで５日間振盪培養し、得た菌浮遊液を無菌
的に６枚のチーズクロースで濾して菌糸を除去し、次い
で１，５００ｒｐｍで遠心分離し分生胞子を得、これを
保管する。
【００２９】アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１の上
記分生胞子を使用する場合は、滅菌蒸留水で洗滌し分生
胞子浮遊液とし、その培養は、表−１の培地Ｄの組成の
内、寒天を除去した液体培地で２５℃、１２０ｒｐｍ、
５日間振盪培養したものを使用する。
記分生胞子を使用する場合は、滅菌蒸留水で洗滌し分生
胞子浮遊液とし、その培養は、表−１の培地Ｄの組成の
内、寒天を除去した液体培地で２５℃、１２０ｒｐｍ、
５日間振盪培養したものを使用する。
【００３０】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。な
お、濃度に関する％は、重量％を示す。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。な
お、濃度に関する％は、重量％を示す。
【００３１】（実施例１：酵素活性に及ぼす温度の影
響）アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１の菌糸体とキ
トサンとを添加した後、３０乃至８０℃まで１０℃間隔
ごとに、各温度の酵素活性を測定した。その結果を図２
に示す。最適温度は６０℃であり、５０℃で８７％程酵
素活性を見せたが４０℃以下、または７０乃至８０℃で
は酵素活性が急激に減少した。
響）アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１の菌糸体とキ
トサンとを添加した後、３０乃至８０℃まで１０℃間隔
ごとに、各温度の酵素活性を測定した。その結果を図２
に示す。最適温度は６０℃であり、５０℃で８７％程酵
素活性を見せたが４０℃以下、または７０乃至８０℃で
は酵素活性が急激に減少した。
【００３２】（実施例２：酵素活性に及ぼすｐＨの影
響）反応溶液のｐＨを０．５ずつ変化させ、各ｐＨごと
の酵素活性を調べた。結果を図３に示す。アスペルギル
スフミガーツスＫＢ−１が生産する酵素の最適ｐＨは
４．０乃至５．０であり、ｐＨ３．５以下またはｐＨ
６．５以上では酵素活性が殆どなかった。
響）反応溶液のｐＨを０．５ずつ変化させ、各ｐＨごと
の酵素活性を調べた。結果を図３に示す。アスペルギル
スフミガーツスＫＢ−１が生産する酵素の最適ｐＨは
４．０乃至５．０であり、ｐＨ３．５以下またはｐＨ
６．５以上では酵素活性が殆どなかった。
【００３３】（実施例３：キトサン濃度のキトサン−オ
リゴ糖製造への影響）キトサンの濃度を１乃至８％まで
１％ずつ変化させたキトサン溶液をキトサンを１％硝酸
で溶解して作製した。キトサンが５乃至８％の場合は、
温度６０℃で溶解させた。各キトサン溶液５０ｍｌに、
予め培養したアスペルギルスフミガーツスＫＢ−１の菌
糸体を混合し、６０℃水浴槽で３０分間ゆっくりと振盪
し反応させた。酵素と反応せずに残存するキトサンは、
同量のエタノールを添加し遠心分離により沈澱を除去し
た。この上清をキトサン−オリゴ糖に換算した。結果を
図４に示す。キトサンの濃度が、１乃至３％の範囲で
は、９５％以上がキトサン−オリゴ糖に分解され、キト
サン濃度が５％でも７４％が分解された。しかしそれ以
上のキトサン濃度では、キトサン−オリゴ糖の生産が大
きく減少した。
リゴ糖製造への影響）キトサンの濃度を１乃至８％まで
１％ずつ変化させたキトサン溶液をキトサンを１％硝酸
で溶解して作製した。キトサンが５乃至８％の場合は、
温度６０℃で溶解させた。各キトサン溶液５０ｍｌに、
予め培養したアスペルギルスフミガーツスＫＢ−１の菌
糸体を混合し、６０℃水浴槽で３０分間ゆっくりと振盪
し反応させた。酵素と反応せずに残存するキトサンは、
同量のエタノールを添加し遠心分離により沈澱を除去し
た。この上清をキトサン−オリゴ糖に換算した。結果を
図４に示す。キトサンの濃度が、１乃至３％の範囲で
は、９５％以上がキトサン−オリゴ糖に分解され、キト
サン濃度が５％でも７４％が分解された。しかしそれ以
上のキトサン濃度では、キトサン−オリゴ糖の生産が大
きく減少した。
【００３４】実施例３で生産されたキトサン−オリゴ糖
を、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。結果
を図５に示す。キトサン濃度が１％の場合、生産される
キトサン−オリゴ糖は２糖以下が４３％、３糖以上が５
７％であった（図５Ｂ）。キトサン濃度が３％またはそ
れ以上の場合には、２糖が２２％、３糖が３４％、４糖
が４４％であった（図５Ｃ）。本発明に使用したアスペ
ルギルスフミガーツスＫＢ−１菌の菌糸体を利用して生
産するキトサン−オリゴ糖は、酸加水分解に比べて単糖
の生産が殆どなく、キトサン濃度が３％では、７８％が
３糖乃至６糖のキトサン−オリゴ糖であった。
を、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。結果
を図５に示す。キトサン濃度が１％の場合、生産される
キトサン−オリゴ糖は２糖以下が４３％、３糖以上が５
７％であった（図５Ｂ）。キトサン濃度が３％またはそ
れ以上の場合には、２糖が２２％、３糖が３４％、４糖
が４４％であった（図５Ｃ）。本発明に使用したアスペ
ルギルスフミガーツスＫＢ−１菌の菌糸体を利用して生
産するキトサン−オリゴ糖は、酸加水分解に比べて単糖
の生産が殆どなく、キトサン濃度が３％では、７８％が
３糖乃至６糖のキトサン−オリゴ糖であった。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
【発明の効果】本発明のアスペルギルスフミガーツス突
然変異菌は、キトサンのキトサン−オリゴ糖への分解に
優れる酵素を生産し、当該菌の菌糸体を使用し、キトサ
ンを分解すればキトサン−オリゴ糖の加水分解率が高
く、３乃至５％の高基質濃度でも大部分が３糖以上であ
った。本発明により、工程が簡単で経済的かつ環境汚染
問題を起こさずにキトサンからキトサン−オリゴ糖を製
造する方法が提供される。
然変異菌は、キトサンのキトサン−オリゴ糖への分解に
優れる酵素を生産し、当該菌の菌糸体を使用し、キトサ
ンを分解すればキトサン−オリゴ糖の加水分解率が高
く、３乃至５％の高基質濃度でも大部分が３糖以上であ
った。本発明により、工程が簡単で経済的かつ環境汚染
問題を起こさずにキトサンからキトサン−オリゴ糖を製
造する方法が提供される。
【図１】図１は、アスペルギルスフミガーツスＫＢ−１
のユビキノンシステムの薄層クロマトグラムを示す写真
である。
のユビキノンシステムの薄層クロマトグラムを示す写真
である。
【図２】図２は、酵素活性と温度（横軸）との関係を示
す。
す。
【図３】図３は、酵素活性とｐＨ（横軸）との関係を示
す。
す。
【図４】図４は、キトサン濃度（横軸）とキトサン−オ
リゴ糖の生産との関係を示す。
リゴ糖の生産との関係を示す。
【図５】図５Ａは、（Ｇｌｃ１）、（Ｇｌｃ２）、（Ｇ
ｌｃ３）、（Ｇｌｃ４）、（Ｇｌｃ５）、（Ｇｌｃ６）
のＨＰＬＣのスタンダードを示す。図５Ｂは、キトサン
濃度１％のときの生産されたキトサンーオリゴ糖のＨＰ
ＬＣを示す。図５Ｃは、キトサン濃度３％のときの生産
されたキトサンーオリゴ糖のＨＰＬＣを示す。
ｌｃ３）、（Ｇｌｃ４）、（Ｇｌｃ５）、（Ｇｌｃ６）
のＨＰＬＣのスタンダードを示す。図５Ｂは、キトサン
濃度１％のときの生産されたキトサンーオリゴ糖のＨＰ
ＬＣを示す。図５Ｃは、キトサン濃度３％のときの生産
されたキトサンーオリゴ糖のＨＰＬＣを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:68）
Claims (8)
- 【請求項１】 キトサンをキトサン−オリゴ糖に分解す
る性質を持つ韓国科学技術院遺伝工学研究所において受
託番号ＫＣＴＣ０１３９ＢＰ号で寄託されたアスペルギ
ルスフミガーツス突然変異菌。 - 【請求項２】 請求項１記載のアスペルギルスフミガー
ツス突然変異菌を培養して菌糸体を収穫し、得られた菌
糸体をキトサンと反応させることを特徴とするキトサン
−オリゴ糖の製造方法。 - 【請求項３】 アスペルギルスフミガーツス突然変異菌
の培養が、蒸留水１リットルに対し、キトサン５乃至１
５ｇ、酵母エキス０．２５乃至１．０ｇ、硝酸アンモニ
ウム０．５乃至２．０ｇ、塩化ナトリウム０．２５乃至
１．５ｇ、リン酸第２カリウム０．５乃至２．０ｇ、リ
ン酸第２ナトリウム２．０乃至５ｇ、硫酸マグネシウム
０．２５乃至１．０ｇ、塩化カルシウム０．０２乃至
０．１ｇ、寒天１０乃至２０ｇ、硝酸１０ｍｌからなる
培地で行われることを特徴とする請求項２記載のキトサ
ン−オリゴ糖の製造方法。 - 【請求項４】 アスペルギルスフミガーツス突然変異菌
の培養が液体培地で、温度２０乃至３０℃、７０乃至１
５０ｒｐｍで３乃至６日間の振盪培養であることを特徴
とする請求項２または３記載のキトサン−オリゴ糖の製
造方法。 - 【請求項５】 菌糸体とキトサンとの反応が、温度５０
乃至６０℃で行われることを特徴とする請求項２乃至４
記載のキトサン−オリゴ糖の製造方法。 - 【請求項６】 菌糸体とキトサンとの反応が、ｐＨ４．
０乃至５．０で行われることを特徴とする請求項２乃至
５記載のキトサン−オリゴ糖の製造方法。 - 【請求項７】 菌糸体とキトサンとの反応時間が、１０
乃至６０分間であることを特徴とする請求項２乃至６記
載のキトサン−オリゴ糖の製造方法。 - 【請求項８】 菌糸体とキトサンとの反応において、キ
トサンの濃度が、１乃至５重量％であることを特徴とす
る請求項２乃至７記載のキトサン−オリゴ糖の製造方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1995/P/3713 | 1995-02-24 | ||
| KR1019950003713A KR0140430B1 (ko) | 1995-02-24 | 1995-02-24 | 아스퍼질러스 푸미가투스 돌연변이 균주와 생산효고 및 이를 이용한 키토산-올리고당의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322554A JPH08322554A (ja) | 1996-12-10 |
| JP2797081B2 true JP2797081B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=19408765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8061793A Expired - Fee Related JP2797081B2 (ja) | 1995-02-24 | 1996-02-23 | アスペルギルスフミガーツス突然変異菌及び当該菌または菌の生産酵素を利用したキトサン−オリゴ糖の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2797081B2 (ja) |
| KR (1) | KR0140430B1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107063A (zh) * | 2021-08-26 | 2022-03-01 | 中国烟草总公司贵州省公司 | 一种烟曲霉菌菌株及其用途 |
-
1995
- 1995-02-24 KR KR1019950003713A patent/KR0140430B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-02-23 JP JP8061793A patent/JP2797081B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR0140430B1 (ko) | 1998-07-01 |
| KR960031592A (ko) | 1996-09-17 |
| JPH08322554A (ja) | 1996-12-10 |
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