KR100241249B1

KR100241249B1 - 신규한 BACILLUS sp．균주와 그를 이용한 CHITOSANASE의 생산

Info

Publication number: KR100241249B1
Application number: KR1019970054772A
Authority: KR
Inventors: 지연태; 박노동; 조유영
Original assignee: 박노동
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2000-02-01
Also published as: KR19990033423A

Abstract

본 발명은 신규한 Bacillus sp. 균주와 그를 이용한 chitosanase의 생산에 관한 것이다. chitosanase의 생산균주는 키토산을 분해하여 고중합도의 키토산 올리고머를 생산하는 것을 확인하였으며 chitosanase의 최적 생합성조건을 규명하였다.

이밖에 이 균주는 Chitinase와 β-N-Hexosaminidase를 생합성함을 제공한다.

Description

신규한 Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ． 균주와 그를 이용한 ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ의 생산 {Novel Bacillus sp. strain and production of chitosanase the refrom}

본 발명은 신규한 Bacillus sp. 균주와 그를 이용한 chitosanase의 생합성에 관한 것이다.

키틴(chitin)은 지구상에서 섬유소(fiber)다음으로 풍부한 천연고분자물질로서 N-acetyl-D-glucosamine(NAG)의 β-1,4결합을 기본단위로 하는 중합체(polymer)이다. 이 중합체는 갑갑류의 껍질, 곤충의 외골격, 균류의 세포벽의 주성분으로 알려져 있다. 이 중합체의 유도체들의 유용성이 규명되면서 화공, 환경, 의약, 의료, 농업, 식품분야에 신소재로 그 용도를 넓혀가고 있으며 키틴은 무독성이고 다양한 기능성 때문에 젤, 구슬, 섬유, 필름, 콜로이드 등의 조제가 가능하기 때문에 상처치료제, 인공피부, 수술봉합사, 기능성비료나 사료로 이용되고 있으며 항감염효과나 항암효과도 보고 되고 있다.(Amko et al, 1987; kobayash: et al, 1987; Tokora et al., 1988; willis et al., 1988).

한편 키토산은 키틴을 화학적 또는 생물학적 처리로 acetyl기를 떼어내어 형성된 glucosamine의 pyranose단위가 β-1,4결합으로 이루어진 중합체(polymer)이다. 따라서, 키토산의 결정성은 키틴보다 떨어지고 다양한 입체배위를 가지며 키틴과는 달리 묽은 염산, 유기산 수용액에 용해되는 것이 특징이다(Arnako, et al., 1987).

키토산은 chitosnase에 의하여 가수분해되며 chitosanase는 Acinetobacter sp. (shimosaka, et al., 1995; shin et al., 1995), Aeromonas hydrophila (nisutomi et al., 1990), Amycolatopsis sp. (Suzuki et al., 1985), Bacillus sp.(Kim et al., 1996; Lee et al, 1996; Masato et al., 1992; Mitsutomi et al, 1995; Pelletier and Sygush, 1990; Seino et al; 1991, Fominaga and Tsujiska, 1975), Enterobacter sp. (yamasaki et al., 1993), My cobacter sp.(Allan and wolfe, 1974), Nocardia orientalis(Shoji et al., 1994), Pycnoporus cinnabarinus(Murata et al., 1991), Streptomyces sp. (lsabelle et al., 1992; Ohtakara et al., 1990; Ohtakara et al., 1984), Pseudomonas sp.(Kazutoshi et al, 1992, Yoshihara et al., 1992). Penicillium islandicum(Fenton and Eveleigh, 1981)에서 분리되어 왔다. chitosanase를 생산하는 이들 균주들은 유도물질로서 대체로 키토산을 필요로한다. 이들 미생물에 의하여 생산된 대부분의 chitosanase는 다양한 당단위체를 갖는 키토산올리고당을 생산하고 또 어떤 균주는 키틴을 가수분해하는 것도 알려져 있다(Enterobacter sp. G-1, Acinetobacter sp. CHB101). 최근 고조된 관심은 저분자량 키토올리고당의 생산이며 이들은 곰팡이, 세균의 성장저항작용, 항암작용, 면역반응 활성, 고등식물에서 phytoalexin생산에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 키토산의 분해산물인 키토산올리고당은 식품첨가제, 진단시약, 감염억제, 함암제, 식물생리조절제로 사용되어 다양한 신기능적 소재도 기대된다. 따라서 키토산 올리고당의 신기능적 소재 개발성이 커짐에 따라 이 소재의 효율적 제조방법이 중요해 졌다.

종래 키토산올리고당은 진한 염산으로 가수분해하여 다양한 중합도의 올리고머를 생산 (Horoeitz et al., Masato et al, 1957)하였으나 이는 고중합도의 올리고당수율을 높일수가 없었다. 그러나 고중합도의 수율높은 Chitosanase를 얻는다면 이 효소법은 산가수분해에 비하여 올리고머의 고순도를 유지할 수 있다.

따라서 본 발명의 목적은 고중합도의 수율높은 chitosanase를 생산하는 신균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 이같은 chitosanase를 대량 생산할 수 있는 최적조건을 제공함에 있다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 우리나라 해안 토양으로부터 신규한 chitosanase생산균주를 분리하고 이 균주의 형태적 및 생화학적 특성을 조사하고 분류동정하였다.

또 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 여러 가지 배양조건을 실험하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 본 발명 균주가 생산하는 endochitosanase와 기질을 반응시킨후 반응산물에 대하여 TLC를 수행한 결과를 보인 사진도이다.

도 2는 본 발명 균주가 생산하는 endochitosanase와 기질을 반응시켜 액화능을 실험한 결과를 보인 사진도이다.

도 3은 본 발명 균주의 배양상등액과 키토산을 배양하여 그 상등액에 대하여 HPLC를 수행한 결과 3당 이상의 올리고머가 효소 분해된 것을 보여주는 그림이다.

도 4는 본 발명 균주를 최적배양조건하에서 배양하여 균체 성장과 endochitosanase의 효소활성을 나타낸 그림이다.

도 5는 본 발명 균주가 생산하는 효소추출 프로필을 보인 그림이다.

본 발명은 해안 토양 시료를 분리원으로하여 chitosnase생산균주를 분리 선발한 후 이들 균주를 동정한 다음 그중 가장 우수한 균주가 생산하는 chitosanase의 특성을 조사하고 chitosanase생산에 가장 적절한 배양조건을 찾아내었다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 단계별로 상세히 설명한다.

chitosanase생산균주의 분리 선발.

우리나라 해안의 갯벌토양으로부터 시료 1g씩을 취하여 100㎖ saline buffer(0.85% Nacl)에 주입하여 Vortex mixer로 혼합한 다음 30분간 진탕배양한 후 현탁액 1㎖를 1.2%키토산이 포함된 분리용 액상배지 50㎖가 함유된 삼각 flask에 접종하여 7일간 진탕배양한 후 각 플라스크로부터 배양액 100㎖씩을 취하여 분리용 한천배지에 평판도말하고 37℃에서 5일간 배양하면서 chitosanase에 의해 키토산이 분해되어 투명환(clear zone)이 형성된 균주를 1차 분리하고 다시 분리용 한천배지에서 5일간 배양하여 clear zone이 크고 선명한 colony를 키토산이 포함된 분리용 cultur broth에 접종하여 chitosanase활성이 높은 8주 즉 P3, P4, P5, P6, P8, P13, P16, P27를 선발하였다.

균주의 동정과 균학적 특성

선발된 8주를 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology의 방법에 따라 형태적, 생화학적 특성을 동정하였다. 그 결과는 표 1과 같으며 8주 모두가 그람양성균으로 운동성이 있었으며 전분가수분해성과 Catalase반응과 MRVP시험에서 양성을 나타냈다. 또 이들 균주는 2%이하의 Nacl에서 성장하여, 생육에 적당한 산도는 pH4.5-11.0, 40℃내외이었다.

이들 분리균주중 P16은 mannitol, glucose, sucrose, citric acid의 이용성이 음성이며 3-ketolactone생산 및 질산환원실험에서도 음성을 보였다. 전자현미경으로 균주를 촬영한 결과 P16의 크기는 0.4-0.6㎛×1.6-2.2㎛의 간상세균임을 알 수 있었다. 항생제의 내성을 실험한 결과는 표 2와 같으며 분리균주 P16은 ampicillin과 novobiocin에 대하여 50ppm 농도에서도 내성을 보였으며 tetracycline과 chlorampenicol에 대하여는 민감한 반응를 보였다.

분리균주가 생산하는 chitosanase효소의 특성

TLC분석

분리된 균주를 각각 0.5% 키토산이 함유된 LB Broth에 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 배양액의 조효소액 0.1㎖와 1% Soluble chitosan 0.9㎖(0.1M sodium acetate buffer, pH5.5)를 혼합하여 37℃에서 10시간 반응시켰다. 반응액을 0.1N NaOH로 반응정지시킨후 원심분리하여 상등액 10㎕를 TLC plate에 점적하고 전개용매에 전개시켰다. 전개용매는 n-propanal: H₂O: Ethylacetate: 암모니아수 6:3:3:1(v/v)혼합용매를 사용하였고 발색시약은 에탄올에 녹인 0.2%닌히드린 시약을 사용하였다. 실험결과 사진도 1에서 보는 바와같이 dimer-pentamer까지 생성되었으나 monomer는 발견되지 않았다.

따라서 본 발명 균주가 생산하는 chitosanase는 지금까지 알려진 Bacillus 균주 예컨대 B. sp. No 7-M(Masato et. al., 1992) 와는 달리 chitosanase의 작용이 exo-splitting 이 아닌 endo-splitting으로 작용하는 것으로 측정되었다.

액화능분석

분리된 균주를 각각 LB Broth에 접종하여 37℃에서 2일간 배양한 후 원심분리하여 얻은 조효소액 1㎖를 취하여 1% soluble chitosan(Sodium acetate buffer, pH5.5)9㎖와 혼합하여 Shaking water bath에서 10시간 반응시킨후 반응액을 1M NaOH 500㎕를 가하여 vortexing하고 탁도를 비교하여 액화능(Liguefaction activity)을 분석하였다. 액화능분석결과는 사진도 2와 같다.

액화능 실험결과 도2에서 보는 바와같이 P4와 P16균주에서 고도의 액화능이 관찰되었으며 특히 P16균주가 가장 높게 나타났다. 따라서 P16균주가 선발된 균주중 키토산을 내부가수분해하는 endochitosanase를 생산하는 강력한 균주로 확정하고 가장 높은 효소활성을 보인 P16을 Bacillus sp. P16으로 명명하여 한국과학기술원 생명공학연구소에 1997년 10월 2일 기탁번호 KCTC 8834P로 기탁하였다.

HPLC분석

분리균주 P16의 배양상등액 0.1㎖와 1% soluble chintosan(0.1M Sodium acetate buffer, pH5.5)1.0㎖를 37℃에서 24시간 배양한 다음 1N NaOH로 반응을 중지시키고 그의 상등액으로 HPLC를 수행하였다. 분리칼럼으로 Carbohydrate column을 검출기로 RI detector를 사용하고 용매는 acetonitrile:water 60:40(v/v)유속 1.0㎖/min로 수행한 결과는 도 3과 같다.

도에서 보는 바와같이 TLC결과와 유사하게 3당 이상의 올리고당이 chitosanase가수분해산물의 주성분인 것을 알 수 있었다.

배양조건

본 발명 신규의 분리균주 P16을 0.5% 미세분말 키토산을 첨가한 LB broth 배지에 접종하고 200rpm조건하에서 적정배양온도를 pH4-pH9까지 96시간 배양하였다. 세포성장은 660mm에서 흡광도를 측정하고, 효소활성은 DNS방법을 이용하여 chitosanase에 의하여 생성된 환원당(reducing sugar)의 양을 측정하였다.

배양온도

P16균주를 배양온도 20℃, 24℃, 28℃, 32℃, 37℃, 40℃ 42℃로 변경하여 배양한 결과 세포성장과 효소활성이 가장 높은 온도는 37℃였다.

초기 pH

P16균주를 1% Tryptone, 0.5% soluble chitosan, 1% NaCl을 함유한 배지의 초기 pH를 4.0에서 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0으로 변경하여 실험한 결과 세포성장과 효소활성이 가장 높은 초기 산도는 pH7.0으로 나타났다.

탄소원과 질소원의 종류와 농도

P16균주를 1% tryptone, 0.5% yeaset extract, 1% NaCl 및 다양한 탄소원을 함유한 배지에 다양한 농도에서 접종하여 200rpm, 37℃, pH7.0 조건하에서 60시간 배양하여 세포성장과 효소활성을 측정한 결과 효소활성을 lnsoluble chitosan에서 가장 높았으며(표 3) 농도 범위는 0.5-1.0%가 최적조건으로 나타났다. P16균주를 0.5% insolble chitosan을 함유한 배지에 다양한 질소원을 함유한 배지에 다양한 농도에서 접종하여 상기 조건으로 배양하여 세포성장과 효소활성을 측정한 결과(표 4) tryptone과 peptone배지에서 가장 높았으며 tryptone의 최적농도는 1.0%로 나타났다.

이상과 같이 본 발명의 Bacillus sp. P16(KCTC 8834P)균주에 의해 생산되는 chitosanase효소의 N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다.

1 5 10 15

(N-말단) A-C-K-E-M-K-P-F-F-Q-Q-V-N-Y-A

실시예1

P16균주를 1% NaCl, 0.5% insoluble chitosan과 1% tryptone기초 배지(pH7.0)에 접종하여 200rpm, 37℃에서 96시간 배양하여 세포성장과 chitosanase효소활성에 대한 경시적 변화를 실험한 결과는 도 4와 같다. 본 발명 Bacillus sp. P16균주의 최적 배양조건하에서 세포성장과 효소활성은 24시간 이후가 가장 좋은 것으로 나타났다.

실시예 2

P16균주를 0.5%분말키토산을 포함하는 LB broth에서 200rpm, 37℃에서 72시간 진탕배양하여 얻은 조효소액을 농축한 다음 Sephadex G-150칼럼에 걸어 chromatography를 수행한 실험결과는 도 5와 같다. 실험결과 본 발명균주는 chitosanase외에도 chitinase 및 β-N-Hexosaminidase를 생산함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이상 단계별 실험결과와 실시예에서 확인되는 바와같이 고중합도 키토산올리고당을 효소적으로 생산하기 위한 균주를 제공하는 효과가 있으며 더욱이 이 균주에 의한 고중합도 키토산올리고당을 생산하는 endochitosanase를 제공하는 효과가 있다. 이 밖에도 고중합도 키토산올리고당을 대량 생산하기 위한 B. sp. P16균주와 eodochitosanase의 최적 생산조건을 제공하고 기타 chitinase와 β-N-Hexosaminidase를 생산함으로서 발효산업 및 키토산 올리고당산업에 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

고중합도 키토산올리고당을 생산하는 해안 토양 유래의 신규한 endochitosanase생산균주 Bacillus sp. P16 (KCTC 8834P)
Bacillus sp. P16(KCTC 8834P)균주에 의해 생산되는 서열목록1에 기재된 N-말단 아미노산 서열을 갖는 chitosanase효소.
Bacillus sp. P16 (KCTC 8834P)를 insoluble chitosan, tryptone 기초배지(pH7.0)에서 37℃에서 호기적으로 24시간이상 발효함을 특징으로 하는 chitosanase의 생산방법.