KR20020032260A

KR20020032260A - 토양에서 분리한 바실러스속 에이치에스비-21 균주 및키토산아제

Info

Publication number: KR20020032260A
Application number: KR1020000063333A
Authority: KR
Inventors: 최용복; 신중한; 김동성; 김성균
Original assignee: 조 정 래; 주식회사 효성
Priority date: 2000-10-26
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2002-05-03

Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 균주 및 이 균주로부터 생산되는 키토산아제(chitosanase), 그리고 이 키토산아제의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 키토산아제를 생산하는 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 (KFCC-11221)이며, 본 발명의 키토산아제의 제조방법은 하기 공정을 포함한다.

1) 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 (KFCC-11221)를 LB 한천배지에서 배양하고 LB액체배지에 접종한 다음 25-35℃의 온도에서 진탕배양하여 접종용 배양액을 얻는 제 1차 종배양 공정;

2) 전기에서 수득한 접종용 배양액을 LB배지에 접종하고, 100 내지 300 rpm 교반속도, 25-45℃의 온도에서 배양하는 제 2차 종배양 공정;

3) 상기 2차 종배양 공정을 통하여 얻은 접종용 배양액을 0.5 내지 3%의 탄소원, 0.5 내지 4%의 질소원을 함유한 배지에 접종하고 100 내지 300 rpm의 교반속도, 25-45℃의 온도, 초기 pH 6.5 내지 7.5 및 1 vvm의 통기조건에서 본 배양하는 공정.

본 발명의 균주는 키토산아제를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있으며, 이 균주가 생산하는 키토산아제는 생산수율도 높고 농축이 간편하며, 고중합도의 키토산올리고당을 제조할 수 있다.

Description

토양에서 분리한 바실러스속 에이치에스비-21 균주 및 키토산아제{Bacillus HSB-21 and Chitosanase Separated from Soil}

본 발명은 토양에서 분리한 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 균주 및 균주로부터 생산되는 키토산아제(chitosanase), 그리고 이 키토산아제의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 토양으로부터 분리한 신규의 바실러스 속 HSB-21 균주 및 상기 균주로부터 생산되는 키토산아제와 이 키토산아제의 제조방법에 관한 것이다.

키토산은 D-글루코사민이 β-1,4 결합으로 연결된 무색, 무취의 천연고분자 다당체로서, 키틴을 강알칼리나 효소 처리에 의한 방법으로 생산된다. 일반적으로 키토산은 젖산, 구연산, 초산 등의 유기산에 용해되어 천연 다당류 중 유일하게 양전하를 가지며, 항암 효과, 혈중 콜레스테롤치 저하, 혈당 조절, 고혈압 억제, 간기능 향상, 면역 활성, 장기능 활성 등의 기능성을 지니고 있어 산업적으로 많이 이용되고 있다. 그러나 점성이 높고 중성이나 알카리성의 물에 녹지 않는 문제가 있어 산업적인 이용에 많은 제한이 되어왔다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 키토산을 분해하여 수용성의 키토산 올리고당을 제조하는 방법이 많이 시도되었다. 특히, 6 이상의 중합도를 가진 키토산 올리고당의 경우 항암 및 항균작용과 면역증강 등에 큰 효과를 보이는 것으로 밝혀져 높은 중합도를 가진 키토산 올리고당 제조의 필요성이 증가하고 있다.

수용성 키토산 올리고당의 제조방법으로는 산분해법과 효소분해법이 이용되고 있다. 산분해법을 이용한 키토산 올리고당의 제조방법은 간단한 방법이기는 하나, 키토산 분해 결과 낮은 분자량의 단당 및 이당 등 초저분자를 다량 포함하는키토산 올리고당이 제조되어지며, 이러한 초저분자 키토산 올리고당은 인체면역성 강화작용, 항암작용 및 항균작용 등이 미약하다는 문제점이 있었다. 반면에 효소분해법을 이용한 키토산 올리고당의 제조방법은 사용하는 효소에 따라서 다양한 중합도를 갖는 키토산 올리고당을 만들 수 있는 장점이 있으나 분해효소의 개발이 아직 충분하지 않으므로 분해효소의 개발이 시급하다.

키토산을 분해하는 효소인 키토산아제를 생산하는 미생물로는 바실러스 (Bacillus) 7-M(참조 : 일본공개특허공보 昭61-280277호), 바실러스 서큘란스 (Bacilluscirculans) LCC-1(참조 : 일본 공개 특허공보 昭63-94971호), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus) BN-262(참조 : 일본공개특허공보 昭63-63382호), 바실러스 속 (Bacillussp.) No. K-881(참조 : 일본공개특허공보 平2-79972호), 바실러스 속(Bacillussp.) GM44(참조 : 한국공개특허공보 특1999-025566)등이 알려져 있다.

그러나 이러한 미생물을 이용하여 키토산아제를 제조할 경우 제조 수율이 낮아 산업의 이용에 한계가 있었고 또한 이들로부터 생산되는 키토산아제를 이용한 키토산 분해물의 경우 2당 및 3당의 함량은 높은 반면, 5당, 6당 및 그 이상의 올리고당 함량이 낮으며 80% 이상의 탈아세틸화도를 가진 키토산은 잘 분해하는 반면에 그 이하의 탈아세틸화도를 가진 키토산은 분해가 잘 일어나지 않는다는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기한 바와 같은 제반 문제점을 해결하기 위한 것으로, 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 미생물을 분리하여 새로운 키토산아제를 제조하고, 상기 균주로부터 키토산아제를 제조하는 방법을 제공하는데 그 기술적 과제를 두고 있다.

제 1도는 pH 변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 상대활성도를 나타낸 그래프이다.

제 2도는 pH 변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 안정성을 상대활성도로 나타낸 그래프이다.

제 3도는 반응온도의 변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 상대활성도를 나타낸 그래프이다.

제 4도는 반응온도의 변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 안정성을 상대활성도로 나타낸 그래프이다.

제 5도는 본 발명의 키토산아제의 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)한 젤(gel) 및 활성염색한 젤의 사진이다.

제 6도는 반응시간별로 키토산아제의 작용에 의해 제조되는 키토산 올리고당의 조성을 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 갯벌 토양으로부터 분리된 키토산아제를 생산하는 균주인 신균주 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 균주 및 이 균주로부터 생산된 키토산아제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 신균주는 버어지스 매뉴얼(Bergery's Manual of Systermatic Bacteriologg vol. 1) 인덱스에 의거 바실러스 속에 속하는 균주로 동정하였고, 바실러스 HSB-21로 명명하였고, 이 균주는 2000년 10월 16일 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센타에 기탁번호 KFCC-11221로 기탁하였다.

이 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성은 아래의 표1 및 표2와 같다.

본 발명의 미생물을 이용하여 키토산아제를 제조하는 방법은 아래 공정을 포함한다.

2) 전기에서 수득한 접종용 배양액을 LB배지에 접종하고, 100 내지 300 rpm의 교반속도, 25-45℃의 온도에서 배양하는 제 2차 종배양 공정 및;

상기에서, 균체의 배양은 25 내지 45℃에서 가능하였으며, 특히 30℃가 가장 바람직한 온도로 나타났다. 발효기 내의 교반속도는 100 내지 300 rpm이 적절하며, 교반속도가 높을 경우 다량의 거품 발생으로 배양액의 손실이 발생하였다.

본 발명의 실시예는 아래와 같다.

실시예 1

*키토산아제를 생산하는 균주의 분리

미생물 분리를 위해 경기도 지역의 갯벌 토양을 채취하여 사용하였다. 토양 sample 5 g을 0.85% 생리식염수 50 ml에 넣고 진탕한 후 여과한 후 여과액을 적당히 희석하여 LB plate에 도말하여 30℃ 배양기에서 배양하였다. 분리된 미생물을 LB plate에 배양한 후 0.5% 키토산 용액(pH 5.0)을 포함하는 soft agar를 중첩시켜 30℃ 배양기에서 배양하였다. 키토산을 분해하여 투명환을 형성하는 미생물을 키토산 분해 미생물로 1차 분리하여 530종의 미생물을 분리하였으며, 이 중 키토산용액을 중첩하여 투명환을 형성하는 미생물 37종을 분리하였다.

상기, 37종의 미생물을 LB 액체배지에 접종하고 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 18시간동안 배양한 다음 상등액을 회수하여 키토산아제 활성을 측정하였다. 키토산아제의 활성은 키토산 용액으로부터 생성되는 환원당의 양을 ferricyanide용액을 사용한 Schales법에 따라 측정하였으며, 키토산아제 활성단위(U)는 1분당 1μ mole의 D-글루코사민을 생산하는 효소의 양으로 결정하였다. 측정 결과 다른 균주에 비해 4종의 균주에서 높은 활성이 나타났으며, HSB-21 균주의 효소 활성이 가장 높았다.

실시예 2

* 균주의 동정

실시예 1에서 얻어진 균주를 동정하기 위하여 Bergey's manual에 따라 수행하고, 분리균주의 형태학적, 생리학적, 및 생화학적 특성을 상기 표 1과 표 2에 나타내었다. 이 결과에 따르면, 본 발명의 균주는 바실러스 속(Bacillussp.)에 속하는 것으로 밝혀져 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21로 명명하였다.

실시예 3

* 균주 배양 및 키토산아제 분리/농축

LB 고체배지에서 배양한 콜로니를 5 ml LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 18시간을 배양하여 1차 종배양액으로 사용하였으며, 2차 종배양배지로는 배플이 있는 500 ml 삼각플라스크에 LB 액체배지 100 ml를 넣고 가압멸균하여 사용하였다. 2차 종배양배지에 1차 종배양액을 1%(v/v) 접종하고 30℃, 200 rpm 조건하에서 12시간 배양하여 2차 종배양액을 준비하였다. 75 L 교반식 발효조에 50 L의 LB 액체배지를 넣고 가압멸균한 다음, 2차 종배양액을 2%(v/v) 접종하고 1vvm으로 통기하면서, 30℃에서 150 rpm으로 배양하였다. 배양 시작 후 18시간째에서 약 22 U/ml의 효소를 생산할 수 있었다.

상기 배양한 배양액을 Pellicon membrane(0.22㎛)을 이용하여 균체를 제거하고 33 L의 배양상등액을 회수하였다. 키토산아제의 활성을 측정한 결과 19 U/ml이었으며, 총 활성은 617,100U였다. 배양상등액을 Pellicon membrane(분자량 cut-off 100,000)을 통과시킨 후 다시 Pellicon membrane(분자량 cut-off 10,000)을 이용하여 5 L까지 농축하였다. 이 농축액의 키토산아제 활성을 측정한 결과 85 U/ml이었으며, 총 키토산아제 활성은 422,500 U였다.

실시예 4

* 균주 배양조건 중의 탄소원의 영향

LB 고체배지에서 배양한 콜로니를 5 ml LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 18시간을 배양한 다음, 배플이 있는 500 ml 삼각플라스크에 하기 [표 3]의 조성을 가지는 배지를 넣고 가압멸균한 후 접종하였다. 하기 [표 4]에서 보듯이 가용성 전분을 이용할 경우 가장 높은 활성의 효소가 생산되었다.

실시예 5

* 균주 배양조건 중의 질소원의 영향

1% 가용성 전분을 이용한 [표 3]의 액체배지에 효모추출물, 박토-펩톤, 박토-트립톤, 옥수수추출물, 비프추출물, 폴리펩톤 군으로부터 선택된 1종의 질소원을 0.5% 첨가하여 키토산아제의 활성을 측정하였다. [표 5]에서 보듯이 효모추출물을 사용하는 경우 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 6

* 키토산아제의 최적 pH와 pH 안정성

키토산아제를 50℃에서 5분간 반응시키는 경우 반응액의 pH에 따른 키토산아제 상대활성도를 도1에 나타내었다. 본 발명의 효소는 pH 4 ∼ 7에서 작용하고, 최적 pH는 5.5이었다. 또한 30℃에서 1시간동안 반응시킬 때 pH가 효소 안정성에 미치는 영향을 도2에 나타냈으며, pH 3 ∼ 8사이에서 비교적 안정하였다.

실시예 7

*키토산아제의 최적 온도와 온도 안정성

반응온도에 따른 키토산아제의 상대활성도를 도3에 나타내었으며, 본 효소의최적 반응온도는 50℃였다. pH 5.0에서 온도안정성은 도4에 나타내었으며, 40℃에서는 24시간 후에도 비교적 안정하였으나, 50℃ 이상에서는 급격히 실활되었다.

실시예 8

*키토산아제의 분자량

소디움도데실설페이트 폴리아그릴아마이드 겔 전기영동(Sodium-dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)방법으로 분석한 키토산아제의 분자량은 약 21,000 달톤이었다. 상기 젤과 활성염색을 실시한 젤을 도5에 나타냈다.

실시예 9

*키토산아제 반응산물

키토산아제는 키토비오즈(chitobiose)와 키토트리오즈(chitotriose)를 분해하지 못하였다. 키토테트라오즈(chitotetraose)로부터는 2당이 생산되었으며, 키토펜토즈(Chitopentose)로부터는 2당 및 3당이 생산되었다. 키토헥사오즈 (Chitohexaose)로부터는 1당을 전혀 생산하지 않았으며, 2, 3, 4당이 주로 생산되었다. 키토산으로부터는 최종반응산물로 2당에서 8당의 키토산올리고당을 생산하였다.

실시예 10

* 키토산올리고당의 생산

22.5 g의 키토산을 1.7% 빙초산이 포함된 탈이온수 500 ml에 넣고 완전히 녹여 키토산용액을 만들고, 80 U의 키토산아제를 첨가하여 45℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 반응시켰다. 반응액을 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 키토산올리고당 조성을 확인한 결과 1당은 생성되지 않았으며, 최종 반응산물로 2당∼8당의 키토산올리고당이 주로 생산되었다.

이상의 실시예를 통하여 확인되는 바와 같이, 본 발명의 균주는 키토산아제를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있으며, 이 균주가 생산하는 키토산아제는 생산수율도 높고 농축이 간편하며, 고중합도의 키토산올리고당을 제조할 수 있다.

Claims

키토산아제를 생산하는 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 (KFCC-11221).
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법.

1) 바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 (KFCC-11221)를 LB 한천배지에서 배양하고 LB액체배지에 접종한 다음 25-35℃의 온도에서 진탕배양하여 접종용 배양액을 얻는 제 1차 종배양 공정;

2) 전기에서 수득한 접종용 배양액을 LB배지에 접종하고, 100 내지 300 rpm의 교반속도, 25-45℃의 온도에서 배양하는 제 2차 종배양 공정;

3) 상기 2차 종배양 공정을 통하여 얻은 접종용 배양액을 0.5 내지 3%의 탄소원, 0.5 내지 4%의 질소원을 함유한 배지에 접종하고 100 내지 300 rpm의 교반속도, 25-45℃의 온도, 초기 pH 6.5 내지 7.5 및 1 vvm의 통기조건에서 본 배양하는 공정.
제2항에 있어서, 탄소원은 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 수크로스, 트레할로스, 리보오스, 덱스트린, 가용성 전분, 키토산 및 키틴으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법
제2항에 있어서, 질소원은 NH₄Cl, NH₄NO₃, (NH₄)₂SO₄, KNO₃, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 옥수수침전물, 비프추출물 및 폴리펩톤으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법.
바실러스 속(Bacillussp.) HSB-21 균주(KFCC-11221)로부터 생산되는 키토산아제.