KR890001287B1 - 발효방법 및 이에 따라 생산된 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 - Google Patents

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Abstract

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Description

발효방법 및 이에 따라 생산된 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드
제1도는 탈아세틸화된 폴리 54 및 잔탄검의 점도 비교 그래프이다.
지난 10년간, C1-화합룰로부터의 단세포 단백질(SCP)의 생산이 학술 및 공업 실험실에서 깊이 연구되었다. 미쓰비시 가스 화학회사, 호에크스트 및 I.C.I.와 같은 기업들은 시험공장 연구소들을 운영해 왔으나 지금은 단지 I.C.I.만이 전규모 SCP공장을 조작하고 있다. “Pruteen”은 I.C.I.제품의 등록 상표이며 결국 분리되고 분말 또는 과립으로 건조된 절대적 메탄산화 세균, 메틸로필러스 메틸로트로푸스(Methylophilus m ethylotrophus)의 발효에 의해 제조된 것이다. 메틸로필러스 메틸로트로푸스는 포롬알데히드 고정의 리불로오스 모노포스페이트 회로(RMP)를 사용 하는 절대적 메탄산화 세균이다. 메틸로필러스 메틸로트로푸스 균주AS-1은 그람 음성이고, 한개의 극성 편모를 갖는 무색 간균이다.
메탄올 및 다른 C1-화합물이 일반적으로 단세포 단백질 생산의 기질로 생각되어지지만, SCP제조에 적합한 C1-화합물은 엑1소폴리사카라이드 같은 축적된 세포의 대사물의 생성을 위한 포텐셜 피이드스톡인 것으로 추천된다. 메탄올을 가치-부여 생성물로 전환시키는 다수의 미생물 공정이 개시되어 왔으나 일반적으로 이들은 아미노산과 같은 저부피/고가 화합물이다.
Proc.Soc.Gen.Microbial, 5, 43(1978)에서 J.볼보트 및 C.안토니는 슈도모나스 (Pseudomonas) AMI의 피루베이트 디하이드로게네스 결합 변종을 메탄올에서 배양할때 알라닌과 발린의 아미노산을 축적할 수 있음을 발견하였다. Agric. Biol .chem .,42,2275 (1978)에서 Y. Tani일행은 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacterg-lobiformis)균주를 사용하여 메탄올로부터 L-세린을 리터당 5.2g까지 생산 하는 겻을 기술했다. 현재까지C1-화합물이 주요 화학공업 주식회사 상품 형태로 생전환되는 보고가 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 성장 탄소원을 세포의 대사물의 축적된 양으로 생전환되는 발효방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 C1-화합물을 엑소폴리사카라이드의 축적양으로 생-산화 (bio-oxidation)하고 엑소폴리사카라이드를 신규한 혜테로폴리사카라이드로 화학적으로 개조 하는 방법을 제공 하는 것이다.
본 발명의 목적은 수성용액에 의가소성 및 요변성을 부여 하는데 적당한 성질을 나타내는 신규한 헤테로폴리사카라이드를 제공 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 설명 및 실시예로 자명해질 것이다.
본 발명의 목적은 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogene)균주를 성장 탄소원(예를들면,C1-화합물 또는 푸릭토오스)을 포함 하는 수성의 영양 배지에서 호기적 으로 배양하여 발효 배지에 세포의 혜테로폴리사카라이드 축적양을 생성하고, 발효 배지로부터 배양 미생물을 분리하여 세포가 없는 헤테로폴리사카라이드 수성용액을 제공하고, 이 수성용액을 알카리성 범위로 pH를 맞추어 혜테로폴리사카라이드를 탈아세틸화 하는 것으로 구성된 발효 방법을 제공함으로 성취할 수 있다.
이 방법의 탈아세틸화된 혜테로플리사카라이드 생성물은 물질의 신규한 조성물이다.
전체 세포를 원심분리, 한외여과 또는 가열 살균과 같은 관래적 수단으로 발효 육즙으로부터 제거하고 세포가 없는 엑소폴리사카라이드 대사물의 수성용액을 탈아세틸화 및 생성물 회수의 계속적인 진행 공정에 놓는다.
여기서 사용된 “C1-화합물”이라는 용어는 어떠한 탄소-탄소 결합도 갖지 않는, 메탄올, 포름알데히드, 포르메이트, 포름아미드, 일산화탄소, 디메틸에테르, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 및 트리메틸아민 N-옥사이드와 같은 유기 화합물을 말한다.
여기서 사용된 “엑소폴리사카라이드”라는 용어는 발효 배지에 세포의 대사물로 축적된, 잔탄검, 폴리사카라이드 5-60(U.S.4,326,752) 및 혜테로폴리사카라이드 폴리 54로 예시되는 폴리사카라이드를 말한다.
여기서 사용된 “혜테로폴리사카라이드”라는 용어는. 적어도 두개의 서로 다른 종류의 단당류 단위체로 구성된, 만노오스 및 갈락토오스 같은 폴리사카라이드를 말한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus visco genes)균주 ATCC 39893 또는 그 변종을 성장 탄소원으로서 메탄올을 포함하는 영양 배지에서 호기적으로 배양하여 발효 배지에 세포의 혜테로폴리사카라이드 폴리 54 축적량을 생성하고, 알카리 조건하에서 혜테로폴리사카라이드 폴리 54를 반응시켜 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54를 생성 하는 것으로 구성되는 발효 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 생성물을 형성 하는 대체적 방법은 세포의 헤테로폴리사카라이드 중간체(예를들면, 혜테로폴리사카라아드 플리 54)를 고형물질로 회수하고 회수된 고형 물질을 알카리 조건하에서 처리하여 개조할 수 있는 수성 배지에 재용해시켜서 소요의 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 생성물을 얻는 것이다.
엑소폴리사카라이드 중간체를 개조 하는 알카리 처리는 엑소폴리사카라이드 중간체 수성용액의 pH를 엑소폴리사카라이드의 가수분해 개조를 수행 하는데 충분한 처리 시간동안 약 20°-100℃의 온도에서 알카리 시약으로 약 7-13으로, 바람직하게는 약 8-12로 조절함으로 성취할 수 있다. 전형적인 반응시간은 약 0.1-2시간이다. 알카리 시약은 암모니아 또는 유기아민 또는 수산화나트륨 같은 염기성 무기 화합물, 탄산칼륨 및 이와 유사한 것이다.
탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54와 같은 본 발명 생성물은 관래적 수단, 수-혼화성 유기 용매로 수성 배치를 희석하여 생성물을 침전시킴으로 수성 배지로부터 고형 생성물로 회수할 수 있다. 적당한 유기 용매 희석제는 메탄올, 에탄을 프로판올, 아세톤, 테트라히드로푸란 및 이와 유사한 것이 있다.
탈아세틸화된 혜테로플리사카라이드는 수성용액을 칼슘염으로 처리하여 침전시킬 수 있다.
탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 생성물은 카르복실산기를 포함하고 금속염 또는 유리산 형태로 존재할수 있다.
다른 구체 예에서, 본 발명은 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus visc ogenes)균주를 성장 탄소원을 포함 하는 수성의 영양 배지에서 호기적으로 배양하여 수성 배지에 세포의 헤테로폴리사카라이드 축적양을 생산하고, 수성 배지를 수-혼화성 유기 용매로 회석하여 헤테로폴리사카라이드를 침전시켜서 수성의 슬러리 배지를 형성하고, 수성의 슬러리 배지를 알카리 시약으로 처리하여 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드의 수성슬러리를 생성 하는 것으로 구성된 발효 방법을 제공한다.
이 구체예 방법은 그 회수된 형태가 색소로 오염되지 않고 순도가 높은 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드를 생산 하는 이점을 가지고 있다.
침전물 형태의 탈아세틸화된 조 헤테로폴리사카라이드를 물에 재용해시키고, 이 수성용액을 투석하고 냉동건조하여 정제된 생성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 생성물을 형성 하는 다른 구체 예에서, 폴리 54와 같은 세포의 혜테로폴리사카라이드 중간체를 고형 물질로 회수하고 그 고형물질을 알카리용액(예를들면, 수성의 알칸올 가성용액)으로 처리하여 상기 고형물질의 탈아세틸화를 수행한다. 비균질 상 탈아세틸화의 이 방법은 조작의 용이성의 이점을 추가하고 혜테로폴리사카라이드 기질의 분해를 유도하지 않는다.
본 발명은 신규한 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54는 약 800,000 -1,500,000의 평균 분자량을갖는다.
탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54는 명목상으로 25℃에서 부룩필드 스핀들 4호로 측정하여, 50RPM에서 적어도 약 1000cps 예를들면 50RPM에서 약 1050cps의 0.5%점도를 나타낸다. 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54의 수성용액은 무색 투명하고 의가소성 및 요변성 점도 특성을 나타낸다. 수성용액점도 특성은 130℃까지의 온도 및 약 12까지의 pH값에서 적당하다.
저 전단율 조건하에서, 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54는 상업적 잔탄검의 약 10-30배의 겉보기 점도를 나타낸다. 전단 조건하에서의 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54 및 상업적 잔탄(켈잔)검의 점도 특성 비교는 제1도에 나타냈다.
탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54의 다른 물리화학적 및 구조적 특징은 다음과 같다.
A. 구성당(몰%)
글루코오스 50 만노오스 10
갈락토오스 30 글루쿠로닌산 10
탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54는 피루베이트 또는 단백질을 포함하지 않고, 4개의 단당류 단위당 약 하나 이상하의 아세틸기를 포함한다. 아칼리 처리는 항상 헤테로폴리사카라이드 폴리 54에 원래 존재 하는 아세틸기 모두를 제거한다.
부분적으로 아세틸화된 폴리 54도 생산할 수 있다.
B . 원소분석 (%)*
C 38.22 O47.41
H 5.57 N 1.58
* 회분 보정함
C. 용융점
분명한 용융점이 없고 약 150℃ 이상의 온도에서 붇해된다.
D. 적외선 스펙트럼
지방족 에스테르기를 나타내는 1740cm-1에서 밴드가 나타나고 아미드기를 나타내는 1650cm-1및 1540m-1에서 밴드가 나타난다.
E. 자외선 흡수 스펙트럼
254mu에서 넓은 최대의 퍼이크를 나타낸다.
F. 용해성
물에 용해되나 모든 보통의 유기 용매에는 용해되지 않는다.
G. 특이적 회전
특이적 회전이 측정되지 않는다.
조건적 메탄산화 세균의 신규종
본 발명의 구체예는
(a) 호기성, 그람-음성, 막대형, 운동성 및 극성 편모세포 ;
(b) 리불로오스 모노포스페이트 통로를 거쳐 메탄올을 동화시킬 수 있는 메탄산화체 ;
(c)푸럭토오스상에서 성장가능 :
(d) 35°-40℃의 배양 온도에서 최적의 성장속도를 나타냄.
으로 구성된 확인 특성을 갖는 세균의 신규종을 이용하여 성취할 수 있다.
특정 구체 예에서 본 발명은 균주 ATCC 39893의 확인 특성을 갖는 세균 배양을 사용하고 상기 배양은 메탄올 또는 다른 C2-화합물을 혜테로폴리사카라이드의 세포의 축적으로 생전환시킬 수 있다.
기탁번호 ATCC 39893 균주의 부배양기는 매이랜드 20852, 록크빌래, 파크로운 드라이브, 12301 미국형 배양 수집소의 영구적 미생물 수집에 요청하여 얻을 수 있다.
균주 ATCC 39893의 확인 특성을 갖는 세균 균주는 메틸로필러스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus)와 같은 공지의 메탄산화 중의 어떤 일원도 아니다. 분류학적 확인을 위해서 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes)는 균주 ATCC 39893의 확인 특성을 갖는 세균 균주를 포함 하는 새로은 조건적 메탄산화종으로 지정한다.
여기서 사용된 “메탄산화체”라는 용어는 탄소-탄소 결합을 갖지 않고 하나 또는 그 이상의 탄소원자를 갖는 탄소 화합물상에서 비-독립영양 체적으로 성장할 수 있는 미생물을 말한다.
“독립영양적”은 이산화탄소 기질상에서 성장 하는 것을 말한다.
여기서 사용된 “조건적 메탄산화제”라는 용어는 하나 또는 그 이상의 이종성 기질, 예를들면 푸럭토오스상에서 성장할 수 있는 메탄산화체를 말한다.
여기서 사용된 “리불로오스 모노포스페이트 통로”(RMP)라는 용어는 포름알데히드 3분자가 축합되어 피루베이트 1분자 또는 디히드록시아세톤 포스페이트 1분자를 생산 하는 생화학적 회로를 말한다.
리불로오스 모노포스페이트 통로 및 그 변경의 설명에 관한 생화학적 문헌에는 스트롬 일행의 생화학. J.144,465(1974) ; C. 안토니의 Sci.Prog.,62,167(1975) ; 및 콜비 일행의 생화학J.148,513(1975)이 있다.
리불로오스 모노포스 페이트 통로는 G-포스포글루코네이트 디히드라제/포스 포-2-케토-3-디글루코네이트 알도라제 ; 푸럭토오스 디포스페이트 알도라제 ; 글루코오스-6-포스페이트 디히드로 게나제 ; 3-헥술로스 포스페이트 신타제 ; 포스포푸럭토키나제 ; 포스포글루코아이소머라제 ; 포스포-3-헥술로스 아이소머라제 ; 포스포리보아이소머라제 ; 리불로스-5-포스페이트 3-에피머라제 ; 트랜스알도라제 : 트랜스케토라제 ; 세도헵툴로스 디포스페이트 알도라제 ; 및 세도헵툴로스-1,7-디포스파타제를 포함 하는 효소들을 함유한다.
RPM 회로는 효과적으로는 포름알데히드 3몰과 리불로오스5-포스페이트 3몰을 축합시켜서 푸럭토오스 6-포스페이트 3몰을 형성하고 이것은 다시 회로를 경유하여 디히드록시아세톤 포스페이트 또는 피루브산 1몰을 생산하면서 리불로오스 5-포스페이트 3몰을 재생산한다. 이들 대사물들을 세포적 생합성의 기질로 작용한다.
이 회로의 두개의 주요 효소는 헥술로오스 포스페이트 신타제 및 첵술로오스 또는 포스페이트 아이소머라제이고 이들은 포름알데히드 및 리불로오스 5-포스페이트를 축합하고 생성물을 푸럭토오스 6-포스페이트로 전환시키는 효소들이다. RPM 회로의 알려진 두 변경, 즉, 디히드록시아세톤 포스페이트를 생산 하는 푸럭토오스 비포스페이트 변경 및 피루브산을 생산 하는 엔트너-도우도로프 변경이 있다.
메틸로필러스 비스코게네스(Methylop hilus viscogenes)종 텍사스 비숍의 메탄을 제조 공장의 작업지 부근에서 유래된 토양 및 물의 표본상에서 일련의 분리를 수행한다. 표본에서, 메탄올-이용 미생물의 존재를 선별한다.
각 표본 일부분을 메탄올(0.5% v/v) 및 적당한 영양배지, 예를들면 표 I에 나타난 것과 같은 무기염(MS)배지, +염화암모늄을 리터당 1g 포함 하는 250m1들이 얼렌미어 플래스크에 주입한다. 플래스크는 30°-55℃범위의 여러가지 온도에서 항온처리한다. 발생한 성장을 표시 하는 탁도를 검출한후, 표본 2ml를 제거하여 유사한 배지의 살균 플라스크에 주입한다. 다수의 연속적 부배양기들을 각각의 원 표본에서 취하고 배양기를 한천 평판 배지상에 도달하여 메탄올-동화 미생물의 순수 배양을 얻을 수 있는 단일 미생물-유도 집락을 얻는다. 이러한 방식으로 균주 ATCC 39893을 분리하고 생물학적으로 순수한 배양물로 얻는다.
메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscog enes)균주는 다른 메탄산화 세균으로부터 구별되는 성질의 신극한 조합을 나타낸다. 균주 ATCC 39893과 같은 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscog enes) 세균은 C2동화의 리불로오스 모노포스페이트 통로를 이용하고, 35°-40℃에서 1-3시간의 배가시간을 나타내는 성장속도를 갖는 조건적 메탄산화체이다.
균주 ATCC 39893은 메탄올, 푸럭토오스 및 글루코오스상에서 성장한다. 첨가로 이것은 포르메이트 또는 메탄을 형태의 외부 에너지 공급이 존재할때 넓고 다양한 이종성 기질(예를들면 석시네이트 및 피루베이트)상에서 성장한다. 이것은 임의의 공지 미생물에는 없었던 성질이다. 확인을 위해서, 이 세균 명백화 현상을 “잠재 조건적 메탄산화체”로 정의한다.
균주 ATCC 39893의 것들로 구성된 특성을 갖는 세균은 고체 배지상에 연한 오렌지색 집락의 비-점액성 성장으로 확인된다. 메탄산화 세균의 균주 ATCC 39893형의 다른 확인 성격은 단백질 mg당 분당 형성된 적어도 약 400나노몰의 NADH의 헥술로오스 포스페이트 신타제/헥살로스 포스페이트 아이소머제 활성이다.
조건적 메탄산화체의 균주 ATCC 39893형의 중요한 성질은 메탄을 기질을 수성용액에 의가소성 및 요변성을 부여 하는 엑소폴리사카라이드의 축적양으로 생전환시키는 능력이다. 균주 ATCC 39893세균은 다양한 배양 조건하에서 세포 성장의 부재 또는 존재시 배양 배지내에 다량의 축적된 엑소폴리사카라이드를 생산 하는 능력에 있어서 특히 유일하다. 균주 ATCC 39893 세균은 유용한 탄소원 다량을 엑소폴리사카라이드 생합성으로 돌리는 고유의 능력을 가진다.
세균의 균주 ATCC 39893형의 다른 특성은 대수 성장기에 맞서는 성장의 대수적 패턴이다. 균주 ATCC 39893 배양기는 비제한 성장을 방지 하는 자연대사 장애를 나타낸다. 발효 배지에 비타민, 아미노산 또는 효모 추출액과 같은 여러가지 성장인자를 보충해줄때, 대수 성장에 영향을 미치지 않는다.
메틸로필러스 비스코게네스(Methylo philus viscogenes) 균주는 탄소원, 질소원, 염 및 여러가지 성장 촉진제로 구성된 영양 배지에서 호기적으로 배양할 수 있다.
적당한 질소원에는 황산암모늄, 염화암모늄, 암모니아, 인산디암모늠, 질산암모늄, 질산나트륨, 우레아, 옥수수담금액, 카제인, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물 및 이와 유사한 것이 있다.
적당한 무기염에는 칼슘염, 마그내슘염, 칼륨염, 인산염, 철염. 망간염, 아연염, 구리염 및 이와 우사한 것이 있다.
세균 성장 촉진제는 대두단백질 가수분해물, 효모 추출물, 비타민 및 아미노산이 있다.
영양 배지내에서의 미생물와 배양은 전형적으로 배양기를 흔들거나 담금으로서 약 6.7-7.1의 pH 및 35°-40℃의 온도에서 호기적으로 수행한다.
상기한 배양 조건을 사용하여, 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes)균주는 높은 속도로 탄소원을 이용하면서 엑소폴리사카라이드를 고농도로 생산하고 축적한다.
균주 ATCC 39893은 메탄올이 성장 탄소원으로 사용될때 배양 배지를 기준으로 리터당 약 1.5g까지의 양으로 엑소폴리사카라이드를 생산할 수 있다. 엑소폴리사카라이드의 수율은 전형적으로 사용죈 메탄올의 양을 기준으로 약 30-50% 범위이다.
신규종 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes)의 상세한 기술은 1985년 2월 11일에 출원된 동시계류중인 특허출원 일련번호 제700,562호에 개시되어 있고 참고로 여기에 포함시킨다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
성분 및 특정 함유성분은 전형적으로 존재하며 여러가지 개조가 본 발명의 범위내에서 하기 기술내용에서 유도될 수 있다.
메탄올-동화 세균의 성장을 위해, 무기염 배지(MS)(표 I)를 사용한다. 배지에 1g/L 질산칼륨을 보충하여 질산 무기염 배지(NMS)를 형성하거나 1g/L염화암모늄을 보충하여 암모늄 무기염 배지(AMS)를 형성한다. 탄소원, 메탄올은 바람직하게는 0.2-0.5%(v/v)의 농도로 존처한다.
고형배지에서 살균에 앞서 디프코 박토-한천 17g/L을 염기성 무기염 배지(인산염 제외)에 첨가한다. 냉각시에 살균한 인산염 용액을 살균한 무기염 배지에 무균적으로 첨가한다.
발효공정은 B. 브라운 기구 바이오스택(biostac) S 발효조(6l)에서 수행한다. 작업부피를 3l이용하고 메탄올을 발효조 살균후에 무균적으로 첨가한다.
500rpm의 교반속도를 460m1s m-1의 공기 유속과 함께 보통 사용한다. 발효조건에는 pH 및 용해산소 조절장치가 되어 있다.
헥술로오스 포스페이트 신타지 활성의 생성물인 헥술로오스 6-포스페이트에 대한 분석이 없기 때문에 헥술로오스 포스페이트 신타제/헥술로오스 포스페이트 아이소머라제를 동시에 분석한다. 헥술로오스 포스폐이트 아이소머라제는 헥술로오스 6-포스페이트를 글루코오스-6-포스페이트로 전환시키고 이는 글루코오스6-포스페이트 디히드로게나제에 의해 사용하되 이어서 340nm에서 NADP+환원을 수반한다. 효소 분석 용액은 최종 농도로 인산염 완층액 pH 7.2 50mM ; 염화마그네슘 2.5mM ; 글루코오스 6-포스폐이트 디히드로게나제 0.7단위 ; 포스포글루코아이소머라제 0.75단위 ; 포스포리보스 아이소머라제. 1.75단위 ; 리보스 5-포스웨인트 5mM ; NADP+ 0.25mM ; 및 포름알데히드 5mM을 포함한다.
히드록시피루베이트 리덕타제의 존재는 미생물의 포름알데히드 동화의 세린 통로를 나타낸다. 이것은 최종 농도로 인산칼륨 pH 6.3 1M ; 히드록시 피루배이트 리튬 0.1M : 및 NADH 2mM을 포함 하는 효소분석용액으로 결정한다.
글리세를 및 디히드록시아세톤 판단은 글리세롤 디히드로게나제/디히드록시아세톤 리덕타제(글리세롤 :NAD+ 2-옥시도리덕타제, EC 1.1.1.6)로 성취할 수 있다. 효소는 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)로부터 유도되고 시그마 바이오케미칼사로부터 구입할 수 있다.
글리세롤 판단을 위해서는 반응 혼합물(1.0ml틴)은 TRIS-HCL완충에 pH 9.7(시그마 바이오케미칼) 50몰, 효소 1단위 및 글리세롤(또는 시험용액/발효육즙 20-5Ol) 15몰을 포함한다. 분석은 기질을 첨가함으로 시작하고 이어서 벡크만 모델 25uv 분광광도계로 340nm에서의 흡광도 증가를 감시한다. 디히드록시아세톤 판단을 위해서는 반응 혼합물(0.1ml)은 인산염 완충제 pH 6.0 50몰 ; NADH 0.5몰 ;효소 1단위 ; 디히드록시아세톤(또는 시험용액/발효육즙, 20-50ml) 15몰을 포함한다. 분석은 기질을 첨가함으로 시작하고 이어서 340nm에서의 흡광도 감소를 감시한다.
엑소폴리사카라이드(예를들면, 헤테로폴리사카라이드 폴리 54)는 메틸로트로푸스 비스코게네스(Methylotrophus viscogenes) 균주 배양 작업 완료후 회수한다.
육즙을 발효조로부터 회수하고 전 세포를 원심분리(13,000×g에서 10분간)하여 제거한다. 엑소폴리사카라이드를 침전시켜 분리하고, 생성물을 알카리 처리하여 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드를 생성한다.
헤테로폴리사카라이드를 탈아세틸화하는 대체적 방법은 아래에 기술한다.
폴리사카라이드 수성 용액상에서의 유동학적 측정은 웰스/부룩필드 콘/플래이트 디지탈 점성도계 또는 동축 실린더 감지계를 갖춘 레오매트 30점성도 계상에서 행한다.
비교 점도 측정에 사용된 잔탄검은 캘리포니아, 샌디에고, 캠코사의 시판 제품인 켈잔이다.
엑소폴리사카라이드의 단당류 함량 분석은 가수분해-기체 액체 크로마토그라피법으로 수행한다.
[실시예 1]
이 실시예는 메틸로트로푸스 비스코게네스(Methylotrophus viscogenes)균주를 배양하여 엑소폴리사카라이드 대사물 축적량을 형성하고 계속적으로 알카리 처리하여 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드를 형성하는 것을 나타낸다.
균주 ATCC 39893 500ml 주입물을 MS 매체, 1당 염화암모늄 1g, 및 성장 탄소원으로서 0.5%(v/v) 메탄올을 사용하여 배양한다. 플래스크를 37℃에서 2일간 항온 처리한단. MS배지 l0ℓ, 1당 염화암모늄 1g및 메탄을 0.5%(v/v)를 포함하는 14l들이 뉴브룬스윅 마이크로페름 발효조에 상시 배양물을 주입한다.
초기 발효 조건은 다음과 같다 :
37℃, 200rpm으로 진탕, 공기 유동 2l/분, 및 pH 7.0.pH는 발효시 약 7.0으로 조절한다. 메탄올은 발효배지에 탄소가 고갈될때마다 간헐적으로 첨가하여 0.5%(v/v)의 농도를 제공한다. 메탄올의 농도는 기체-액체 크로마토그라피로 결정한다. 24-36시간의 발효후, 진탕속도를 400rpm까지 증가시킨다.
배양물이 메탄올을 더 이상 사용할 수 없을때(보통 5-7일)발효가 종결된다. 높은 점성의 발효 육즙을 이소프로판올로 희석하여(알코을 ; 육즙, 2:1)엑소폴리사카라이드의 침전을 용이하게 한다. 결과 형성된 슬러리를 질소 분위기로 블랭킷한다.
슬러리의 pH를 수산화나트륨 pH 12로 맞추어 탈아세틸화 반응을 수행한다. 필요하면 NaOH를 더 첨가함으로 pH를 유지시키면서 2시간의 반응 기간후, 수성배지를 염산으로 pH 7로 중화시키고, 탈아세틸화된엑소폴리사카라이드(즉, 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드)침전물을 여과하여 수집한다. 침전물을 이소프로판올 약 1부피로 씻고, 공기 건조하거나 강화 공기 오븐내 55℃에서 건조시킨다. 건조된 고형물을 윌리분쇄기 또는 햄머 분쇄기에서 분말로 분쇄한다. 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 생성물의 물리화학적 성질은 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 에 대해 상기한 것과 같다.
상기한 배양 공정을 반복하여 용액내에 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 축적양을 포함하는 발효 육즙을 제공한다. 수성발효 배지의 pH를 수산화나트륨으로 pH 12로 맞추고 두시간후 pH 12에서 발효배지를 염산으로 중화한다. 탈아세틸화된 혜테로플리사카라이드 폴리 54 생성물을 침전시키고 상기한 공정에 따라 회수한다.
[표 1]
MS 배지
MgSO41g
CaCl20.2g
Na2HPO40.33g
KH2PO40.26g
FeEDTA 5.0mg
CuC12·H2O 2.0mg
Na2MoO4·2H2O 2.0mg
FeSO4·7H2O 500g
ZnSO4· 7H2O 400g
MnC12· 4H2O 20g
H3BO415g
CoCl2·6H2O 50g
NiC12·6H2O 10g
EDTA 250g
H2O 1l pH 6.8
[실시 예 2]
이 실시예는 본 발명에 의한 방법의 구체예를 나타낸다.
실시예 1의 일반 공정을 따라 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 생산하고 고형 생성물로 최수한다.
폴리 54 0.5g을 물 50ml에 용해시킨다.
수산화칼륨 수성 용액을 폴리 54 용액에 첨가하여 pH를 12로 맞추고 폴리 54 용액에 질소를 주입하여 거품을 낸다.
용액 점도를 부드러운 겔의 점성까지 증가시킨다.
염산 수성용액을 겔화된 용액에 첨가하여, 알카리성을 PH 6.8-7까지 중화시킨다. 중화된 용액을 수성의 이소프로판올(1 : 1)에 붓고 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 침전시킨다. 침전물을 여과하여 수집하고, 70% 이소프로판올로 씻고, 55℃오븐에서 건조시킨다.
건조 생성물을 분쇄기에서 미세 분말로 분쇄한다.
탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54 분말을 탈이온수 및 1% 염화나트륨 용액에 재용해시켜서, 각각 0.25% 용액을 형성한다. 유사한 방식으로, 헤테로폴리사카라이드 폴리 54의 0.25% 용액을 제조한다.
PRM속도 범위 이상에서 부룩필드 PVT, 스핀들 4를 사용하여 용액의 점도를 측정한다. 비교점도 측정의 결과를 표 II에 요약해 놓았다.
점도 자료는 본 발명에 따라 생산된 탈아세틸화된 혜테로폴리사카라이드 폴리 54는 관련 수성 용액에서 아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54보다 더 큰 증점력을 나타냄을 보인다.
탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54는 수성 용액에 의가소성 및 요변성을 부여한다.
제1도는 탈아세틸화된 폴리 54, 잔탄검, 및 탈아세틸화된 잔탄검의 0.25% 용액에 대해 스핀들 4를 사용한 비교 점도 자료의 그래프이다. 이 자료는 수성 용액에서의 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54의 예외적 점도-증진성을 설명한다.

Claims (24)

  1. 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes)균주를 성장 탄소원을 포함하는 수성 영양 배지에서 호기적으로 배양하여 발효 배지내에 세포의 헤테로폴리사카라이드 축적양을 생산하고, 발효 배지로부터 배양 미생물을 분리하여 세포가 없는 헤테로폴리사카라이드 수성 용액을 제공하고, 수성 용액의 pH를 알카리 범위로 맞추어서 헤테로폴리사카라이드를 탈아세틸화하는 것으로 구성된 발효 방법.
  2. 제1항에 있어서, 성장 탄소원이 C1-화합물인 발효 방법.
  3. 제1항에 있어서, 성장 탄소원이 메탄올인 발효 방법.
  4. 제1항에 있어서, 성장 탄소원이 푸럭토오스인 발효 방법.
  5. 제1항에 있어서, 균주가 ATCC 39893인 발효 방법.
  6. 제1항의 발효 방법에 따라 생산된 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드.
  7. 제5항의 발효 방법에 따라 생산된 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
  8. 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes)균주 ATCC 39893 또는 그 변종을 성장 탄소원으로 메탄올을 포함하는 영양 배지에서 호기적으로 배양하여 발효 배지내에 세포의 헤테로폴리사카라이드폴리 54 축적양을 생산하고, 알카리 조건하에서 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 반응시켜 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 생산하는 것으로 구성된 발효 방법.
  9. 제8항에 있어서, 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 고형 생성물로서 수성의 배지로부터 회수하는 발효 방법.
  10. 제8항의 방법에 따라 생산된 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
  11. 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 알카리성 pH조건하의 수성 배지에서 가수분해하여 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 생산하는 것으로 구성된 방법.
  12. 제11항에 있어서, 알카리 처리를 약 8-12의 pH 및 25°-100℃의 반응 온도의 용액에서 수행하는 방법.
  13. 메틸로필러스 비스코게네스(Methylophilus viscogenes)균주를 성장 탄소원을 포함하는 수성의 영양배지에서 호기적으로 배양하여 수성배지에 세포의 헤테로폴리사카라이드 축적양을 생산하고, 수성 배지를 수-혼화성 유기 용매로 희석하여 헤테로폴리사카라이드를 침전시켜 수성의 슬러리 배지를 형성하고, 수성의 슬러리 배지를 알카리 시약으로 처리하여 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드의 수성 슬러리를 생성하는 것으로 구성되는 발효 방법.
  14. 제13항에 있어서, 성장 탄소원이 C1-화합물인 발효 방법.
  15. 제13항에 있어서, 성장 탄소원이 메탄올인 발효 방법.
  16. 제13항에 있어서, 성장 탄소원이 푸럭토오스인 발효 방법.
  17. 제13항에 있어서, 균주가 ATCC 39893인 발효 방법.
  18. 제13항의 발효 방법에 따라 생산된 탈아센틸화된 헤테로폴리사카라이드.
  19. 제17항의 발효 방법에 따라 생산된 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
  20. 고형의 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 알카리성 용액과 접촉시켜 고형으로 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54를 생성하는 방법.
  21. 25℃에서 부룩필드 스핀들 제4호로 측정하여 50RPM에서 적어도 약 1000cps의 0.5% 점도를 나타내는 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
  22. 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드.
  23. 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
  24. 25℃에서 부룩필드 스핀들 제 4호로 측정하여 50RPM에서 적어도 약 1000cps의 0.5% 점도를 냐타내는 탈아세틸화된 헤테로폴리사카라이드 폴리 54.
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