SU735177A3

SU735177A3 - Способ получени пуллулана

Info

Publication number: SU735177A3
Application number: SU721834802A
Authority: SU
Inventors: Като Косо; Сиесака Макото
Original assignee: Хаясибара Биокемикал Лабораториз Инкорпорейтед (Фирма)
Priority date: 1971-10-11
Filing date: 1972-10-09
Publication date: 1980-05-15
Also published as: JPS4844492A; NO136466C; DK131873B; SE383358B; DK131873C; FR2156220A1; BE789940A; ZA726693B; US3827937A; JPS5136360B2; CA994269A; DE2249836C3; PH9462A; FI50138B; AR194508A1; GB1368903A; CH540975A; NL162137C; NL7213743A; NO136466B

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУЛЛУЛАНА Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а имегАо к получению полисахарида пуллулана путем аэробной микроб ной ферментации. Известен способ получени пуллулана путем выраижвани пуллулан-синтезирутощих микроор ганизмов в аэробныхуслови х в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, небольйше количества необходимых дл роста питательных веществ, с последующим извлечением пуллулана из культуральной жидкости. Однако выход продукта в известном способе довольно низкий. С целью повьпиени выхода продукта предложено в качестве источника углерода примен ть крахмальный гидролизат, имеющий декстр ный эквивалент (ДЭ) 20-70, преимущественно 35-60. В этом случае крахмальный гидролизат состоит в основном из олигосахаридов. Целесообразно концентрацию подцерж1шать гидролизата в питательной среде 5 и 15 вес.%. Рекомендовано примен ть следующие микpoopraiDDMbi: PuMularia fermentans var.fermentans IFO 6401, Pullularia fermentans var. fusca IFO 6402, Pullularia pullulans AHU 9553, PuHularia piilfulans IPO 6353 или Dematiufn pullulans IFO 4464. Дл ферментации пуллулана можно использовать крахмал, полученный из различных источников: кукурузы, пшеницы, картофел и др. Если используемое сырье только частично состоит из крахмала, например рисова мука, рисовые. отруби, овс на крупа, его обрабатывают 0 амилазой при 50-70° С и отфильтровывают полученный водный раствор дл удалени нерастворимого материала. Сироп гидролизованного крахмала, необходимый дл ферментации, можно получить с помощью кислотного или ферментативного гидролиза . Гидролиз необходимо проводить таким образом, чтобы избежать образование продукта, имеющего ДЭ ниже 20, который может содержать непрореагировавший декстрин. Дгг проведени кислотного гидролиза к взвеси крахмала п воде добавл гг щавелевую или сач ную кислоту до pfi 2 или ниже, смесь выдер кивают при 120 С до тех пор, пока не получитс требуемый ДЭ. Полученный раствор .охлаждают до комнатной температуры, нейтралгоуют карбонатом кальци и/или натри , обесцвечивают активированным углем и очищают от посторонних ионов с помощью ионообменной смолы. Обесцвеченную жидкость можно использовать дл приготовлени питательной среды. Крахмальный гидролизат можно также полу чйть I обработкой только о; -амилазой или комби нацией кислотного и ферментативного гидролиза . Кислотный гадролиз и комбинации кислотного и ферментативного гадролиза обеспечивает получение крахмального сиропа, имеющего ДТЭ 50 или выше. ДЭ гидролиза, полученного только обработкой а-амилазы, не бьгоает вьппе 35.- - ,:; .; -,-., ,-.,.:,.:,- - - V Питательна среда должна содержать другие вещества, необходимые дл роста микроорганиз мов, такие как органические шш неорганические источники азота, йеорганйчейкйе соли, например фосфат кали , натрий хлористый, маг кий сернокислый, железо сернокислое и т.д. Начальный рН культзфальной среды должен бьгть 5-7,5, температура ферментации 27-30°С. Сама высока концентраци пуллулана оВьРшо достигаетс через 3-8 сут, когда в среде не остаетс, остаточного,сахара. Степень полимеризации пуллулана имеет тен дендаю к уменьшению с увеличе иёй времени ферментации, поэтому если требуетс продукт о высоким молекул рньш весом, ферментацию тферывают до достижени более высокого выхо да продукта. Аэрирование культуры осуществл ют обычНЬ1М споробом. Услови аэрации не оказьшают осущественнрго вли ни на выход .. После окончани ферментации культуральйую ЖИДКОСТЬ прогревают, чтобы инактнвиро- вать содержащийс в ней фермент. Микробные клетки удал ют цёнтрифугарованием. К жидкости, освобожденной от клеток, до6авл н )Т метанол или другой органический растворитель , хорощо растворимый в воде и не раствор ющий пуллулан, в количестве, доста-точном дл осаждени пуллулана. Осажденный пуллулан извлекают из жидкости и очищают повторным растворением в воде и осаждением органическим pacтвopитeлe. Очищенный пуллулан представл ет собой беловатый порощок, который очень легко раствор етс в воде с образованием в зкого раствора . Средн степень полимеризации пулЛулона, полученного данным способом, приблизительно 1000-3000.. Пример 1. Dematiom pullulans IFO4464 выращивают в среде, содержащей 10% источника углерода, 0,2% пептона, по 0,2% К2НРО4 и NaCI, 0,04% MgS04-7H20 и 0,001% FeSO4-7H20. В качестве источника углерода добавд ют глюкозу , сахарозу, мальтозу (ДЭ 60,5), кислотный гидролизат крахмала (ДЭ 45) и ферментативный гадролизат крахмала с ДЭ 40. Шчальный рН ере:дь17 ,5. Выращивание осуществл ют в колбах емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, на круговой качалке при в течение 7 сут. Пробы отбирают через ЗЗ и 7 сут и центрифугируют. К освобожденной от клеток культуральной жидкости добавл ют 3 объема метанола дл осаждени полисахарида, который очищают дважды растворением в небольщом количестве воды и переосаждением метанолом. Собранные осадки промывают метанолом, высушивают и взвешивают. Осадки идентифицированы как пуллулан гидролизом их пуллуланазой и бумажной хроматографией тидролизатов. Результаты представлены в табл. 1. Таблица I

-i;iii a-.™.i«ji- -y :-: w.Y:------ ---4а 4,80,81,5 5,8 3,2 0,5

4,2 4,20,71,4 5,11,2 0,3

4,2 4,60,97 2,0 6,5 3,1 0,5

21 32 43 30 45 54

32 61

10

4,2 4,4

Ферментативный гвдролизат крахмала (ДЭ 40)

4,2 4,2

Пример 2. Pullularia pullulans дни 9593и ферментативно до ДЭ 46 и крахмал, гилролизовыращивают в услови х, описагагых в гфимере 1,ванный кислотой до ДЭ 43. В табл. 2 приведена средах, содержащих глюкозу, сахарозу, мальтоэ 25нь1 значени остаточного сахара и выходы пулпукрахмал , гидролизованный в два этащ: кислотойлана на разных средах.

Источник углерода в среде

1 лгокоза

Сахароз а

Мальтоза,2,1

Крахмал, гидролизованный в два этапа (ДЭ 46)0,8

Крахмал, гидролизованный кислотой до ДЭ 43

Полученный пуллулан слегка окрашен. Пример 3. Pullularia pullulans ГР06353 выращивают в услови х и на средах, отсайных в примере 1, но длительность ферментащш 5 сут. Выходы 1 ллулана ниже, чем в примере 1, так как продолжительность фермектащш меньше, но на среде с гидролизатом крахмала пуллулана синтезировано на 25-30% больше, чем на среде с сахарозой или глюкозой. Пример 4. PuMularia pullulans var. fusca IFO 6402 выращивают в среде, описанной

5Д

13 0,1

38

75

67

1,8 5,1 2,0 0,335 65

72

Таблица2

Т

I Остаточный сахар

Выход пуллулаш. I г/100 мл

1,7

35

51

1,1

62

63

65

0,5 в примере I, содержащей 15% кислотного гидролизата крахмала с ДЭ 35. в качестве единственного источника углерода. После ферментации в течение 8 сут на хачалке при 27°С, когда в .среде не содержагтось остаточных Сахаров, фермент инактивируют прогреванием . Клетки удал ют, пуллулан осаждают из бесллеточной жидкости добавлением грех объемов метанола. Осадок отдел ют и очищают повторным растворением в воде и перёосаждегшем метано пом. 10%-ный водный раствор очищенного пуллулана обрабатывают пуллуланазой, выделенной из культуральной жидкости Aerobacter, затем обесцвечивают активированным углем, очищают от -ионов ионообменной смолой и частично упариваю до получени бесцветного сигропа. По результатам хроматографичсского анализа и определени восстановительной способности продукт содержит чистую мальтотриозу. Выход мальтотриозы 95%. 30%-ный водный раствор мальтотриозы поме 1дают в автоклав с 0,30% карбоната кальци и 10% никел Рене , осажденного на твердых частицах, присутствующих в растворе. Мальтотриозу подвергают гидрированию при 100°С и давлении водорода 100 кг/см. Прогидрированную смесь профильтровьшают дл удалени катализатора, фильтрат обесцвечивают и очищают от примесных ионов, как описано вьппе. Бесцветна жидкость не обладает восстанови тельной способностью и при гидролизе дает глюкозу и сорбит в мол рном соотношении 2:1. . Таким образом, продукт пвдрировани мальтотрш ол . Получен из мальтотриозь с выхо дом 96%. Ь5иже приведена характеристика штаммов. Pullularia fermentans var.fermentans IFO 6401. Бластоспоры 3-4 на 7-10 мкм, хламидоспоры 13-15 мкм, артросноры 5-7 на 10-15 мкм, кладоспорные образовани 9-17 мкм. Черные колонии с белым поверхностным миц лием на кукурузном агаре и агаре Сабурода. Пигмент образует только в аэробнь1Х услови периодически на среде Литтмана и не образует на питательном агаре. Воздушный мицелий образует периодически При 37° С не растет. Сбраживает глюкозу, маннозу, фруктозу, мал тозу, сахарозу и рафинозу. Pullularia ftrmentans var. fusca IFO 6402. Бластоспоры 3-4 на .11-13 мкм, хламидосшры 13-16 мкм, артроспоры 3-6 на 8-12 мкм, кладоспорные образовани 4-6 на 14 мкм. Черные мукоидные колонии с черным поверхностным мицелием на кукурузном агаре, а ре Сабурода и Литтмана. Пигмент периодический в аназробных услови х , та питательном агаре отсутствует. Воздущный мицелий не образует. При 37t растет. Сбраживает гликсзу, мзннозу, фруктозу мальтозу, сахарозу, рафинозу и ксилозу. Кольц пслликлов были найдены в растворе. Pultularia pullulans АНИ 9593. Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, к;|адоспорные образовани 3-5 на 12-14 мкм. Маленькие черные колонии с зеленоваточерной поверхностью и воздушный мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана . Пигмент образует только в анаэробных услови х. Растет при. 37С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком. Углеводы не сбраживает. Pullularia pullulans IFO 6353. Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образовани 3-5 на 12-14 мкм. Маленькие черные колонии с зеленоваточерной поверхностью и воздушный мшделий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана. Пигмент образует только в аназробных услови х . Растет при 37°С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком. Углеводы не сбраживает. Dematium pullulans IFO 04464. Бластосноры 3-4 на 8-12 мкм, хламидоспоры 8-10 на 14-18 мкм, артроспоры 2-3 на 3-5 мкм. Маленькие черные колонии с зеленовато-черной поверхностью и воздущньш мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана. Пигмент образует только в аназробных услови х . Растет при 37°С. Углеводы не сбраживает.

Claims

Формула изобретени 1.Способ получени пуллулана путем выращивани пуллулан-синтезирующих микроорганизмов в азробных УСЛОВИЯХ в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим извлечением пуллулана из культуральной жидкости, отличающийс тем, что, с целью повыщени выхода 1ч одукта, в качестве источника углерода примен ют крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент 20-70, преимущественно 35-60.
2.Способ по П.1,отличающийс тем, что примен ют крахмальный гидролизат, в основном состо щий из олигосахаридов.
3.Способ по П.1,отличающийс тем,что концентращию крахмального гидролизата в гштательной среде поддерживают в диапазоне 5-15 вес.%. .
4.Способ но Ш1.1 -3, о т л и ч а ю щ и йс тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма примен ют итгамм PuHularia fermentans var. fermentans IFO 6401.

9735177JO
5.Способ по пп. 1-3, о т л и ч a ю щ и й-7. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю ш и jiс тем, что в качестве пуЛлулан-синтезирующе-с тем, что в качестве пуллулан-синтезируюго микроорганизма примен ют штамм Pullula-щего микооорганизма примен ют штамм Pulluria fermentans var. fusca IFO 6402.lane pulfulans IFO 6353.
6.Способ no пп.ЬЗ, отличающий- 8. Способ по пп. 1-3, о т л и ч a ю щ и и с тем, что в качестве пуллулан-синтезирую-с тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма примен ют штамм Pull и-щего микроорганизма примен ют штамм Demalaria pullulans АНИ 9593.tiim pullulans IFO 4464.