DE2249836A1

DE2249836A1 - Verfahren zur herstellung von pullulan

Info

Publication number: DE2249836A1
Application number: DE2249836A
Authority: DE
Inventors: Koso Kato; Makoto Shiosaka
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1971-10-11
Filing date: 1972-10-11
Publication date: 1973-04-19
Also published as: JPS4844492A; NO136466C; DK131873B; SE383358B; DK131873C; FR2156220A1; BE789940A; ZA726693B; US3827937A; JPS5136360B2; CA994269A; DE2249836C3; PH9462A; FI50138B; AR194508A1; GB1368903A; CH540975A; NL162137C; NL7213743A; NO136466B

Description

~. DITTMANN
K. L. SCPIIFF
ηπ. A. v. FÜNER 2249836

DIPL. INQ. P. STREjHIj *

dr. TJ. SCHÜBEL-HOPF

DIPL. ING. D. EBBINGIIATJS '■ ' _D_g MÜNCHEN QO

MARIAHILFPLATZ 2 & 3 PATENTANWÄLTE * - . TELEFON (O811) 45 83 54 D-8 MÖNCHEN Θ0 POSTFACH Θ5 01Θ0 „ TELEGR. AUROMARCPAT MÜNCHEN

TELEX 5-23 5QS

HAYASHIBARA BIOCHEMICAL LABORATORIES, INCORPORATED No. 2-3, 1-chome, Shinioishii, Okayama-shi, Okayama-ken, Japan

11. Oktober 1972 DA-10 088

Verfahren zum Herstellen von Pullulan

> ■

Priorität: 11. Oktober 1971, Japan, Nr. 79413/1971

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Pullulan durch Züchten von geeigneten Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das als Hauptkohlenstoffquelle ein Saccharid enthält.

Pullulan ist ein Polysaccharid, in welchem Maltotrioseeinheiteh durch oC-1,6-Bindungen verbunden sind. Es löst sich in" Wasser unter Bildung von viskosen Lösungen ohne weiteres auf. Die wasserlöslichen Filme sind als Packmaterialien geeignet und sie können aus den Lösungen in bekannter Weise hergestellt werden. Pullulan kann weiterhin als Aritikoagulans für Blut in der Art und Weise wie Dextran verwendet werden.

Von R. Bauer xvnrde 1938 die mikrobielle Herstellung unter Verwendung von Pullularia pullulans entdeckt. Die Struktur wurde von H. Bender et al aufgeklärt (Biochim. Biophys. Acta $6, 1959,. 309).

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Bei der Herstellung von Pullulan durch mikrobielle Züchtung wurde bislang als vorteilhafteste Kohlenstoffquelle meistens Rohrzucker bzw. Saccharose verwendet. Die Verwendung von Monosaccharide^ (Glucose, Fructose, Mannose) und von anderen Disacchariden als Saccharose (Maltose) wurde zwar untersucht, doch hat man festgestellt, daß diese Kohlenstoffquellen im allgemeinen bei technischen Bedingungen weniger Pullulan bildeten als die Saccharose. Selbst Saccharose konnte aber gewöhnlich nicht mit einer besseren Ausbeute als 12 bis 28$ in Pullulan umgewandelt werden, wobei die Herstellungskosten des auf diese Weise erhaltenen Pullulans nicht sehr attraktiv waren.

Es wurde nun gefunden, daß teilweise hydrolysierte Stärke nicht nur eine billigere Kohlenstoffquelle als Saccharose und andere bislang verwendete Zucker darstellt, sondern daß sie auch mehr Pullulan liefert. Die als hauptsächliche oder einzige signifikante Kohlenstoffquelle in Kulturmedien gemäß der Erfindung verwendete Stärke hat ein Dextroseäquivalent (D.Ä.) von 20 bis 70, vorzugsweise von 35 bis 60. Sie wird ohne weiteres erhalten, indem man Stärke in Gegenwart von Säuren oder Enzymen hydrolysiert. Sie wird durch Pullulan produzierende Mikroorganismen in Ausbeuten von 75/S oder sogar- mehr in Pullulan umgewandelt. Die teilweise hydrolysierte Stärke besteht hauptsächlich oder ganz aus Dextrinen oder Oligosacchariden.

Die Pullulan bildenden Mikroorganismen, die für die Züchtung auf Medien geeignet sind, welche teilweise hydrolysierte Stärke als Kohlenstoffquelle enthalten, sind verschiedene Stämme von Pullularia, beispielsweise P. fermentans var fermentans IFO 64C1, P. fermentans var fusca IFO 6402, P. pullulans AHU 9553, P. pullulans IFO 6353 und Dematium pullulans IFO 4464, sowie andere, die ohne weiteres ausgewählt

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werden können, wenn man ihre TJmwandlungsfähigkeit von teilweise liydrolysierter Stärke mit einem D.Ä." von 20 bis 70 zu Pullulan mit einem für den beabsichtigten Zweck geeigneten Polymerisationsgrad in Betracht zieht. Wenn ein farbloses Produkt gewünscht wird, dann sollte der verwendete mikrobiologische Stamm entsprechend ausgewählt werden, da die Natur des Mikroorganismus das mittlere Molekulargewicht des erhaltenen Ptillulans und den Grad, zu welchem das Produkt mit färbenden Stoffen verunreinigt ist, beeinflußt.

Die als Ausgangsmaterial für die teilweise Hydrolyse verwendete Stärke kann frei ausgewählt werden. Gute Ergebnisse sind mit Getreidestärken, beispielsweise von Mais, wachsigem Mais oder von Weizen, erhalten worden, aber auch mit Stärken, die von Wurzelfrüchten oder Knollengewächsen herrühren. Beispiele für letztere sind Kartoffeln, Süßkartoffeln und Tapioca. Wenn das Ausgangsmaterial nur teilweise aus Stärke besteht, wie bei Reismehl, Reiskleie, Getreideschnitzeln und dergleichen, dann wird es bevorzugt, den Stärkegehalt solcher Materialien durch Verwendung" von oü -Amylase bei der niedrigst möglichen Temperatur (50 bis 70⁰C) zu verflüssigen und die so erhaltene wäßrige Lösung zur Entfernung von unlöslichem Material zu filtrieren.

Ein Sirup aus hydrolysierter Stärke, welcher für die erfindungsgeoäße Fermentierung geeignet ist, kann auf bekannte Weise durch Verwendung einer Säure oder eines Enzyms hergestellt werden. Die Hydrolyse muß in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Bildung eines Produkts vermieden wird, welches einen D.Ä. von weniger als 20 besitzt, da dieses nicht-umgesetztes Dextrin enthalten könnte.

In typischer Weise wird eine Aufschlämmung von Stärke in Wasser nit genügend Oxal- und/oder Salzsäure vermischt, um

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den pH-Wert auf 2,0 oder darunter zu erniedrigen. Dieses Gemisch wird auf 120 C oder eine höhere Temperatur erhitzt, bis der gewünschte D.Ä. erhalten wird. Die resultierende Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Calciumcarbonat und/oder Natriumcarbonat neutralisiert, mit Aktivkohle entfärbt und unter Verwendung eines herkömmlichen Ioneraus-tauscherharzes entionisiert. Die farblose Flüssigkeit kann als Grundlage für ein Kulturmedium verwendet v/erden. Der Wassergehalt kann erforderlichenfalls durch Eindampfen oder Verdünnen eingestellt werden.

Alternativ kann die Säurehydrolyse auch nur bis zur Verflüssigung der Stärke durchgeführt v/erden, wobei die Stärke durch o6-Amylase bei 60 bis 70 C weiter verzuckert wird. Es ist auch möglich, eine Stärke zu verwenden, die nur durch oO-Amylase hydrolysiert worden ist. Die Säurehydrolyse oder eine Kombination von Säure- und Enzymhydrolyse gestattet die Herstellung von Stärkesirupen mit D.Ä.-Werten von 50 oder mehr, während ein D.Ä.-Wert von nicht mehr als 35 die Grenze ist, die durch pC -Amylse allein erhalten werden kann. Ein Hydrolysat mit einem D.Ä. von bis zu etwa 50 kann hergestellt werden, indem Stärke durch Säure oder oO-Amylase verflüssigt wird und indem das erhaltene Produkt mit MaIzamylase weiterbehandelt wird. Ein solche Maltose enthaltender Stärkesirup kann durch gleichzeitige Verwendung von Isoamylase und Malzamylase und durch nachfolgende Reinigung des Hydrolysate, wie oben beschrieben, hergestellt werden.

Die Konzentration der teilweise hydrolysierten Stärke in dem Kulturmedium sollte 3 bis 30?j, vorzugsweise 5 bis 15/ό, betragen, um beste Pullulanausbeuten zu erhalten. In der vorliegenden Beschreibung sind sämtliche Angaben auf das Gewicht bezogen, wem nichts anderes angegeben ist. Bei Konzo^.tratio.icr von mehr als 1 ^r3?< wird die notwendige Inl:u-

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bierungszeit verlängert lind der Gehalt an Restzucker wird erhöht. Bei Konzentrationen unterhalb 5% erfordert die Wiedergewinnung des Pullulans die /Verdünnung des Kulturmediums mit einer überschüssigen Menge eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, in welchem Pullulan unlöslich ist. Die Pullulan-Ausbeute, bezogen auf das Gewicht des Saccharids in dem Medium, nimmt mit der Zuckerkonzentration ab, steigt aber an, wenn man auf das Volumen des Mediums bezieht.

Das Kulturmedium muß andere Nährstoffe enthalten, die herkömmlicher Natur sind und die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind. Beispiele hierfür sind eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, die eine organische oder anorganische Verbindung sein kann, sowie Nebennährstoffe, wie Quellen für anorganische Ionen,-beispielsweise Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-sulfat und dergleichen.

Der bevorzugte Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums liegt zwischen 5,0 und 7,5. Die bevorzugte Inkubierungstemperatur beträgt 27 bis 30⁰C. Die höchste Pullulan-Konzentration wird gewöhnlich in drei bis acht. Tagen erzielt. Die höchste Pullulan-Ausbeute wird erhalten, wenn die Züchtung weitergeführt wird, bis kein Restzucker mehr vorliegt. Der Po-.lymerisationsgrad des Pullulans neigt dazu, mit steigender Inkubierungszeit abzunehmen. Es kann sein, daß man die Züchtung vor dem Erhalt der höchsten Ausbeute unterbrechen muß, wenn man ein Produkt mit hohem Molekulargewicht anstrebt. Das Kulturmedium kann in jeder gewünschten und üblichen Weise belüftet werden. Es wurde nicht festgestellt, daß die Belüftungsbedingungen einen signifikanten Effekt auf das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens ausüben.

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Nach beendigter Inkubierung wird das Kulturmedium erhitzt, um das vorhandene Enzym zu entaktivieren."Die mikrobiellen Zellen werden aus dem flüssigen Medium entfernt, vorzugsweise durch Zentrifugieren. Methanol oder ein anderes organisches Lösungsmittel, das sich leicht mit Wasser¹· mischt und das nicht dazu imstande ist, Pullulan aufzulösen, v/ird zu der zellfreien Flüssigkeit in einer geeigneten Menge gegeben, daf3 das Pullulan ausfällt. In typischer Weise werden gleiche Mengen der Flüssigkeit und von Methanol zu diesem Zweck vermischt, wenn die Fermentierung bei den bevorzugten Bedingungen durchgeführt v/ird.

Das ausgefällte Pullulan wird von der Flüssigkeit abgetrennt und durch wiederholte Auflösung in V/asser und Ausfällung mit'einem organischen Lösungsmittel gereinigt. Das gereinigte Pullulan ist ein weißliches Pulver, das sich sehr rasch in Wasser unter Bildung von viskosen Lösungen auflöst.

Der mittlere Polyrnerisationsgrad von erfindungsgemäß hergestelltem Pullulan ist ungefähr 1000 bis 3000, bestimmt mittels 3,5-Dinitrosalicylsäure. Das Produkt der Hydrolyse unter Verwendung von Pullulanase bildet einen Flecken im Papierchromatogramm, der für Maltotriose charakteristisch ist. Auch das Produkt der Säurehydrolyse zeigt einen Flekken, der für Glucose charakteristisch ist.

Die Ausbeute an Pullulan wird von der Natur, dem D.Ä. und der Konzentration der Kohlenstoffquelle beeinflußt, wie sich aus den Ergebnissen der nachstehend aufgeführten Vergleichsversuche ergibt.

Einfluß der Natur der Kohlenstoffquelle

Es wurden Kulturmedien hergestellt, v/elche 10% Kohlenstoff-

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quelle, 0,2% Pepton, 0,2% -jeweils K₂HPO^ und NaCl, 0,04% MgSO^«THgO und 0,001% FeSO₄-YH₂O enthielten. 100-ml-Ansätze der verschiedenen Medien wurden in 500-ml-Kolben gegeben, mit einem Pullulan produzierenden Mikroorganismus beimpft und in einem Drehschüttler sieben Tage bei einem pH von 7,5 und bei 28°C kultiviert.

In Tabelle I sind die erhaltenen Ausbeuten, angegeben als prozentuale Umwandlung der Kohlenstoffquellen, zusammengestellt, Die Kohlenstoffquellen sind durch Zahlen identifiziert:

(1) Glucose

(2) Saccharose

(3) 90%ige Maltose (D.Ä. 60,5)

(4) Stärke, hydrolysiert durch Säure bis zu einen D*Ä. von 45

(5) Stärke, durch Enzym hydrolysiert bis zu einem D.Ä. von 35.

Die verwendeten Mikroorganismen sind durch folgende Großbuchstaben gekennzeichnet:

(A) Pullularia pullulans AHU 9553

(B) Pullularia pullulans IFO 6353

(C) Dematium pullulans IFO 4464.

	Tabelle	(A)	I	(B)	(C)
	35%	31%	43%
(D	51%'	35%	54%
(2)	62%	51%	61%
(3)	65%	76%	75%
(4)	63%	63%	72%
(Ό

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Einfluß des Dextrose-Äquivalents;

Stärke wurde mit Säure zu D.Ä.-Vierten von 25 bis 70 und durch Enzym zu D.Ä-Werten von 25 bis 40 hydrolysiert. Die verschiedenen hydrolysierten Stärkeprodukte wurden bei den vorstehend angegebenen Bedingungen mit dem Stamm (C) fermentiert. In Tabelle II sind die prozentualen Ausbeuten bei den beiden Hydrolysatarten zusammengestellt:

Tabelle	II	40	50	60	70
	30	68	76	75	58
e,% 45	53	65	—>
e,% 47	58

Dextrose-Äquivalent
säurehydrolysierte Stärke, ?3 45
enzynhydrolysierte Stärke,% 47

Wie aus Tabelle II ersichtlich wird, werden die besten Ausbeuten bei D.Ä.-Werten von ungefähr 40 bis 60 erhalten. Bei D.Ä.-Werten oberhalb 60 wird die Ausbeute durch das Vorliegen von Glucose oder Maltose in der Kohlenstoffquelle vermindert. Bei D.Ä.-Werten von weniger als 40 nimmt die Ausbeute ab, da das Dextrin in der Kohlenstoffquelle nicht ohne weiteres in Pullulan umgewandelt wird.

Einfluß der Korzer^tration der Kohlenstoffquelle;

Der Stamm (C) wurde, wie in den vorstehenden Versuchen, auf Kulturmedien gezüchtet, die hinsichtlich der Konzentration der Kohlenstoffquelle unterschiedlich waren. Als solche wurden entweder säurehydrolysierte Stärke mit einem D.Ä.Wert von 45 oder enzymhydrolysierte Stärke mit einem D.Ä.Wert von 40 verwendet. In Tabelle III sind die Ergebnisse, ausgedrückt in prozentualer Umwandlung der Kohlenstoffquo]3e, zusammengestellt.

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3ΠΠ8 1 6/ 1 08ΰ

Tabelle III

Konzentration der Kohlenstoffquelle 5% 10?ä 15% 25% säurehydrolysierte Stärke, D.Ä. 45 65 75 73 55 enzymhydrolysierte Stärke, D.Ä. 40 63 72 70 60

Bei Konzentrationen unterhalb 5°6 wird ein vorwiegender Teil der verfügbaren Saccharide für das Wachstum der Mikroorganismen verbraucht. Bei Konzentrationen von oberhalb \5% muß die Inkubierungsperiode ausgedehnt werden, um die Restzukkermenge zu vermindern. In jedem Fall wird aber die Pullulan-Ausbeute vermindert.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Dematium pullulans IFO 4464 wurde auf Medien mit der im Test über den Einfluß der Natur der Kohlenstoffquelle angegebenen Grundzusammensetzung gezüchtet. Dabei wurden die Kohlenstoff quellen mit den Nummern (1) bis (4) verwendet. Es wurde eine Kohlenstoffquelle (5a) eingesetzt, die sich von dem Stärkehydrolysat (5) durch einen D.Ä.-Wert von 40 unterschied.

Es wurden jeweils 100-ml-Ansätze der Medien in 500-ml-Kolben gebracht, bei erhöhter Temperatur sterilisiert und mit dem Mikroorganismus beimpft, der zuvor zwei Tage auf Schrägkulturen und zwei Tage auf Samenkulturen gezüchtet worden war. Die Kultivierung erfolgte über sieben Tage bei 27⁰C und einem pH-Viert von 7,5.

Nach drei, fünf und sieben Tagen wurden Proben der einzelnen Kulturmedien gesammelt und zentrifugiert. Die zellfreien überstehenden Produkte wurden mit drei Volumenteilen Metha-

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nol verdünnt, um die vorhandenen Polysaccharide zur Ausfällung zu bringen. Diese wurden zweimal durch Auflösung in geringen Wassermengen und erneute Ausfällung mit Methanol gereinigt. Die letzten Ausfällungen wurden mit Methanol gewaschen, getrocknet und gewogen. Durch Hydrolyse mit Pullulanase und Papierchromatographie des Hydrolysats wurden sie als Pullulan identifiziert.

Nach drei und sieben Tagen nach Verdünnung mit 9 Volumina Wasser wurde die Trübung der einzelnen Proben gemessen. Nach drei und sieben Tagen wurde gleichfalls der pH-Wert des Mediums bestimmt. Nach drei, fünf und sieben Tagen wurde ebenfalls der Restzucker in den Kulturmedien bestimmt, und in Tabelle IV als g je 100 ml aufgeführt. Die Tabelle zeigt die .Mittelwerte für zwei Bestimmungen Jedes Werts.

Tabelle IV

pH Trübung Restzncker Ausbeute, %

Nach Tagen 3 7 3 7 3 5 7 3 5 7

(1) 4,2 4,8 0,8 1,5 5,8 3,2 0,5 21 32 43

(2) 4,2 4,2 0,7 1,4 5,1 1,20,3 30 45 54

(3) 4,2 4,6 0,972,0 6,5 3,1 0,5 10 32 61

(4) . 4,2 4,4 0,9 1,9 5,5 1,8 0,1 38 67 75 (5a) 4,2 4,2 0,9 1,8 5,1 2,0 0,3 35 65 72

Beispiel 2

Pullularia pullulans AHU 9553 wurde bei den Bedingungen des Beispiels 1 auf Kulturmedien, die jevreils die folgenden Kohlenstoff quellen enthielten, gezüchtet:

(1) Glucose

(2) Saccharose

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(6).Maltose

(7) Stärke, zweistufig durch Säure und Enzym zu einem D.Ä.-Wert von 46 hydrolysiert

(8) Stärke, durch Säure zu einen D.Ä.Wert von 43 hydrolysiert.

In Tabelle V sind die Werte für den Restzucker und dije Pullulan-Ausbeute, erhalten bei verschiedenen Medien, zusammengestellt. Das erhaltene Pullulan war geringfügig gefärbt. Die Ausbetite war bei sonst vergleichbaren Bedingungen geringfügig niedriger als in Beispiel 1.

Tabelle	V	(2)	(6)	(7)	(8)
(D	1,1 51	2,1 62	0,8 63	0,5 65
1,7 35

Restzucker, g/100 ml
Pullulan-Ausbeute,%

Beispiel 3

Pullularia pullulans EFO 6353 wurde auf den Medien und bei den Bedingungen gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß eine Inkubationszeit von nur fünf Tagen angewandt· wurde. Die Pullulan-Ausbeuten waren niedriger als die Maximalausbeuten in Beispiel 1, da eine kürzere Inkubierungsperiode vorlag. Jedoch bildeten die teilweise hydrolysierten Stärken immer noch 25 bis 30% mehr Pullulan als Saccharose oder Glucose. Das erhaltene Pullulan hatte eine geringere^ Färbung als dasjenige des Beispiels 1. Es war leicht in kaltem Wasser löslich. Durch Hydrolyse mit Pullulanase und Papierchromatographie, wie oben beschrieben, wurde es identifiziert. Die Viskosität der Lösungen war erheblich niedriger als von entsprechenden Lösungen, die aus den Pullulanen des Beispiels 1 hergestellt worden:, vrren.

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Beispiel 4

Pullularia pullulans var fusca IFO 6402 wurde auf ein allgemein im Beispiel 1 beschriebenes Medium inokkuliert. Es enthielt 15% säurehydrolysierte Stärke mit einem D.Ä.-Wert von 35 als einzige signifikante Kohlenstoffquelle. Nach achttägiger Inkubierung unter Rühren bei 27°C waren keine Restzucker mehr vorhanden. Das Enzym wurde durch Erhitzen inaktiviert. Die Zellen wurden entfernt und das Pullulan wurde aus der zellfreien Flüssigkeit ausgefällt, indem 3 Volumina Methanol zugegeben wurden. Der Niederschlag wurde gewonnen und durch wiederholte Auflösung in Wasser und Ausfällung mit Methanol gereinigt.

Eine 10%ige Lösung des gereinigten Pullulans in Wasser wurde mit 200 Einheiten Pullulanase vermischt, welche aus einer Kultur von Aerobacter ausgesalzt worden v/aren. Das Gemisch wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauscherharz entionisiert und teilweise eingedampft, bis ein farbloser Sirup erhalten wurde. Aufgrund des Reduktionsvermögens und des Ergebnisses der chromatographischen Analyse war das Produkt reine Maltotriose. Die Ausbeute an Maltotriose betrug 95%.

Eine 30%ige wäßrige Lösung der Maltotriose wurde in einen Autoklaven mit 0,3% Calciumcarbonat und 10% Raney-Nickel, bezogen auf den Feststoffgehalt der Lösung, gegeben. Die Mättotriose wurde bei 100⁰C und einem Wasserstoffdruck von 100 kg/cm hydriert. Das Hydrierungsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wurde entfärbt und, wie oben beschrieben, entionisiert. Die farblose Flüssigkeit hatte kein Reduktionsvermögen mehr und ergab bei der Hydrolyse Glucose und Sorbit im Molverhältnis von 2 : Das Hydrienmgsprodukt war somit Maltotritol und wurde rur, der Malto'riose in einer Ausbeute von 96,0 erhalten.

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Claims

Patent an s ρ r ü c h e

1. Verfahren zum Herstellen von Pullulan durch Züchten von Pullulan bildenden Mikroorganismen bei aerobischen Bedingungen auf einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und für das Wachstum der Mikroorganismen notwendige Nebennährstoffe enthält, bis Pullulan in dem Medium gebildet wird, und Gewinnung des gebildeten Pullulans aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man .als Kohlenstoffquelle ein Stärkehydrolysat mit einem Dextrose--Äquivalent von 20 bis verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch t, dadurch g e k e η η zeich.net, daß man ein Stärkehydrolysat mit einem Dextrose-Äquivalent von 35 bis 60 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß man das Stärkehydrolysat vor dem Züchten herstellt, indem man Stärke bei hydrolysierenden Bedingungen in Gegenwart von V/asser und einer Säure und/oder eines stärkehydrolysierenden Enzyms als Hydrolysiermittel halt, bis das Dextrose-Äquivalent erreicht ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hydrolysierungsmittel Salzsäure oder Oxalsäure verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Hydrolysierungsmittel 06-Amylase, Isoamylase oder Maltamylase verwendet.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch

gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pullularia fermentans var fermentans IFO 6401, Pullularia fermentans var fusca IFO 6402, Pullüiariä pulluians AHU 9553, Pullularia pulluians IFO 6353 oäer Üematium pulluians IFO 4464 verwendet.

Ii Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch

gekennzeichnet , daß man ein Hydrolysat verwendet, das im wesentlichen aus Oligosaccharide^, "besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch

gekennzeichnet , daß man eine Konzentration des Hydrolysats in dem Medium von zv/ischen 5 und 15 Gew.-⁰/* anwendet.

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