DE2708239C2 - Verfahren zur Erzeugung von Polysacchariden durch Fermentation - Google Patents
Verfahren zur Erzeugung von Polysacchariden durch FermentationInfo
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Description
Es Ist bekannt, daß zur Erzeugung von extrazellularen
Polysacchariden durch Mikroorganismen des Genus Xanthomonas das zu fermentierende Milieu gewöhnlich
eine Quelle für Kohlehydrate, eine Quelle für Phosphor, eine Quelle für Magnesium, das ein Enzymaktivator ist,
und eine Stickstoffquelle, die üblicherweise »Distiller's Solubles« (US-Patent 30 00 790), umfaßt sowie Kleie oder
Mehl von ganzen Körnern, wie Sorghum, Soja oder Mals
(US-Patent 32 71 267) oder auch »Maisquellwasser« (US-Patent 33 55 447).
Diese organischen Stickstoffquellen weisen den Nachteil auf, daß sie außer der L Ie fein ng von assimilierbarem
Stickstoff auch unlösliche Verunreinigungen zuführen, welche sich In dem Polysaccharid, das aus der Fermentationsbrühre extrahiert wird, wiederfinden.
Diese Verunreinigungen verleihen dem aus dem extrahierten Produkt gewonnenen Gel eine gewisse Färbung
und ein trübes Aussehen und bewirken außerdem, daß das Gel für gewisse Verwendungszwecke, beispielsweise
die Rückgewinnung des Erdöls, ungeeignet Ist. Tatsächlich beeinträchtigt die Anwesenheit wenig löslicher Verunreinigungen und großer Proteinmoleküle die Flltrlerbarkeit der aus diesen Polysacchariden erhaltenen Gele
und erschwert Ihr Eindringen In die Gesteinszwischenräume.
Man hat bereits verschiedene Reinigungstechniken vorgeschlagen, jedoch sind diese kostspielig und wenig
befriedigend.
Aufgabe der Erfindung Ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung von möglichst reinen Polysacchariden durch Fermentation von Kohlehydraten (Insbesondere Zuckern) mittels eines Mikroorganismus des Genus
Xanthomonas und Insbesondere Xanthomonas campestrls, das mit einer völlig löslichen Quelle für anorganischen Stickstoff durchgeführt werden kann.
Es Ist bereits bekannt, gewisse anorganische Stickstoffverbindungen als Stickstoffquelle zur Erzeugung von
Polysacchariden durch Bakterien, Insbesondere Xanthomonas, zu verwenden.
Beispielsweise wird In der DE-OS 21 14 066 die Erzeugung von Polysacchariden durch Fermentation mittels
der Mikroorganismen Agrobacterlum radlobacter und Alcaligenes faecalis beschriebt.·n, wobei Ammoniumphosphat als Stickstoffquelle In Betracht kommt; jedoch
Ist das Verfahren nur mit den zwei speziell genannten Mikroorganismen durchführbar, führt zu speziellen
Homopolysaccharlden vom Typ des /M,3-Glucans und
häufig muß eine organische Stickstoffquelle zusätzlich verwendet werden. Von M. P. Starr (»The nutrition of
phytopathogenlc bacteria - I. Minimal nutritive requirements of the genus Xanthomonas«, J. Bacterlol. 51,
S. 131 bis 143,1946) wird die Verwendung von Ammoniumchlorid angegeben. Jedoch ist beim Arbeiten In Industriellem Maßstab die Anwesenheit von Cl~-Ionen In der
Brühe die Ursache für Korrosionen der Apparaturen.
Man hat auch bereits vorgeschlagen (US-Patent 33 91 060), Ammoniumnitrat als einzige Stickstoffquelle
In dem Endstadium der Fermentation zu verwenden; jedoch werdep bei diesem Verfahren bis zu vier Vorstu
fen auf Medien, die als Stickstoffquelle hauptsächlich
Sojapepton enthalten, notwendig.
Weiterhin Ist aus Blotechn. Bioeng., Vol. XV, 1973,
S. 225 bis 237 bekannt, daß zur Xanthanfermentlerung
eines Xanthomonas Ammoniumphosphat als einzige
Stickstoffquelle eingesetzt wird. Dabei wird Immer In
zwei Stufen gearbeitet: In einer 1. Stufe wird das Inokulum hergestellt und dann folgt eine zweite Fermentationsstufe. Für das Inokulum wird als .r:ickstoffquelle
YM-Boulllon verwendet. Außerdem wird das Inokulum
In einer Menge von 5 bis &% bei der Fermentation verwendet. Daraus ergibt sich, daß durch den relativ großen
Anteil an Inokulum die Rolle der organischen Stickstoffquelle des Inokulums nicht vernachlässigbar ist. Außerdem enthält die Inokulummlschyng große Proteinmole-
küle, weiche die Filtrierbarkelt der Polysaccharldgele vermindern.
Es wurde nun gefunden, daß man mittels Xanthomonas und insbesondere Xanthomonas campestrls ein Polysaccharid mit verbesserten physikalischen Eigenschaften
erhalten kann. Indem mit einer beschränkten Anzahl von
Stufen, welche drei nicht überschreiten, gearbeitet wird,
wobei alle diese Stufen mit Ausnahme der Anfangsstufe bei der Bildung des Inokulums auf Medien durchgeführt
werden, welche als einzige Stickstoffquelle Ammonlum
phosphat enthalten, das gleichzeitig die für die Fermen
tation notwendige Phosphorquelle darstellt, und das Inokulum Im Hinblick auf das Volumen des Fermentationsmediums in sehr geringer Menge verwendet wird.
Gegenstand der Erfindung Ist daher das im Patentan
spruch beschriebene Verfahren.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Fermentation erfolgt zweckmäßig bei einem pH-Wert In dem
Bereich von 6 bis 7,5, vorzugsweise 6,5 bis 7,2, und Infolgedessen wird dem Fermentationsmedium eine Puffer-
substanz, wie Dlkallumphosphat, zugesetzt. Wenn das Medium nicht gepuffert wird, kann man eine Vorrichtung zur Regulierung des pH-Wertes anwenden, wodurch
dem Reaktlonsmllleu die notwendigen Mengen eines alkalischen Reagenz, wie Natriumhydroxid, Kallum
hydrlxld oder Kalk In gelöster oder nicht-gelöster Form,
zugeführt werden.
Unter den Kohlehydraten, die auf diese Welse zu Polysacchariden umgewandelt werden, kann man u. a. nennen: Saccharose, Glucose, Fructose, Getreidestärken oder
Die Menge an Ammoniumphosphat, das als Stickstoffquelle verwendet wird, beträgt 1 bis 6 g je Liter, ausgedrückt In Dlammonlumphosphat, vorzugsweise 1,3 bis
3 g je Liter.
Nach Beendigung der Fermentation Isoliert man das Polysaccharid aus der Brühe In üblicher Welse, beispielsweise Indem man es durch Zugabe eines niedermolekularen Alkohols oder Aceton oder eines Gemisches dieser
Fäliungsmlttel zu der Brühe ausfällt, den Niederschlag
abtrennt, wäscht, trocknet und zerkleinert. Das erhaltene
Produkt Ist dann durch Zugabe von Wasser zur Herstellung von Gelen verwendbar, die eine erhöhte Viskosität
und gute Filtrierbarkelt aufweisen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der
erflndungsgemäBen Erzeugung und der dabei erhaltenen Polysaccharide.
Aus einer Kultur von Xanthomonas campestris, die
auf Gelose in Röhrchen gehalten wird, beimpft man mit der Platinöse einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit 75 ml
YM-Bouillon; dieses Züchtungsmedium, das In entwässerter
Form geliefert wird, hat die folgende Zusammensetzung: Hefeextrakt für die Bakteriologie, Malzextrakt,
Sojapepton für Bakteriologie und reine Glucose.
Nach 48 Stunden Inkubationszeit bei 28 bis 300C
benützt man den Inhalt dieses Erlenmeyer-Kolbens zur
Beimpfung eines Laboratoriurn-Fermentatlonsgefäßes
von 101 Inhalt mit 6 1 eines sterilen Mediums folgender
Zusammensetzung:
Glucose
Dlammonlumphosphat
Dikallumphosphat
Magneslumsuifatheptahydrat
Antischaummittel
Wasser
20 g/l 1,5 gn 3 g/I 0,25 g/i 2 ml/1 ad 6000 ml/1.
Hler dient das Dikallumphosphat als Puffer, um den
pH-Wert zwischen 6,9 und 7,5 zu halten.
Nach 64 Stunden Fermentation bet 28 bis 30° C unter Rühren und Belüften findet man keine Glucose mehr In
dem Milieu Die Viskosität, gemessen mit dem Brookfield
LVT-Viskosimeter zu 30 Umdrehungen je Minute und mit der Nadel Nr. 4, beträgt 4800 Centlpoise und der
Gehalt an Polysaccharld beträgt 14,4 g/kg, was einer Ausbeute von 72SC entspricht
Man arbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben und beimpft 6 I des sterilen Milieus mit folgender Zusammensetzung:
Saccharose
Dlammoniumphosphat
Magnesiumsulfatheptahydrat
Antischaummittel
Wasser
20 g/l
1,3 g/l
0,25 g/l
2 ml/1
ad 6000 ml/l.
der pH-Wert wird mittels KOH bei 6,7 gehalten.
Nach 68 Stunden Fermentation bei 28: bis 30° C unter
Rühren und Belüften Ist die gesamte Saccharose umgewandelt.
Die Viskosität des Mediums beträgt 5100 Centlpoise und der Gehalt von Polysaccharide beträgt
15,3 g/kg, was einer Ausbeute von 76,5S> entspricht.
Man arbeitet In gleicher Welse wie in Beispiel 1 und
beimpft 6 I eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung:
| Maisstürke | 20 | g/l |
| Dlammonlumphosphat | 3 | g/l |
| Magnesiumsulfatheptahydrat | 0,25 | g/i |
| Antischaummittel | 2 | ml/1 |
| Wasser | ad 6000 | ml/1 |
Der pH-Wert wird während der Fermentation durch
NaOH bei 6,8 gehalten.
Nach 65 Stunden Fermentation beträgt die Viskosität des Mediums 5200 Centipoise und der Gehalt an PoIysaccharid
15,1 g/kg, was einer Ausbeute von 75,5% entspricht.
Man verwendet das so erhaltene Pulver für Viskositäts-
und Flltrlerbarkeltsversuche im Vergleich mit einem industriellen Polysaccharid, das durch Fe.mentation
auf einem Milieu mit einer organischen Stickstoffquelle erhalten wurde.
Viskositätsversuche
Man mißt mit Hilfe eines Brookfield LVT-Vlskoslmeters
die Viskosität von Gelen, welche aus dem oben erhaltenen Polysaccharid und einem industriellen Polysaccharid
hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Polysaccharid Polysaccharid
aus dem Milieu aus einem
mit anorganl- Milieu
schem Stickstoff mit organischem Stickstoff
Gel zu 1» In Wasser 2700 cPs 2800 cPs
Nadel Nr. 4,
30 Umdrehungen/Min.
Gel zu 0,3% in Wasser 2000 cPs 2000 cPs
Nadel Nr. 2
3 Umdrehungen/Min.
Gel zu 1* In Wasser 350 cPs 340 cPs
Adapter UL
0,6 Umdrehungen/Min.
Man stellt keine gravierenden Uni^rschiede zwischen
den beiden Kategorien von Polysacchariden fest.
Flltrlerbarkeltsversuche
Man mißt das Volumen eines 0,l%lgen wäßrigen Gels,
welches durch ein Mllllporenfllter mit einer Porosität von 0,45 μ und 47 mm Durchmesser unter einem absoluten
Druck von 2,4 bar filtriert wurde, nach 10 Minuten.
Das Polysaccharldgel, welches durch Fermentation mit
einer anorganischen Stickstoffquelle gemäß der Erfindung erhalten wurde, hat eine Filtrierbarkelt von 25 ml.
Das Gel des Polysaccharide, welches durch Fermentation mit einer organischen Stickstoffquelle erhalten
wurde, hat eine Filtrierbarkelt von 9 ml.
Aus diesen Versuchen wird ersichtlich, daß das erflndungsgemäß
erhaltene Polysaccharid Gele liefert, welche ähnliche Viskositätseigenschaften haben wie die Gele
von Polysacchariden, die aus einem Milieu mit organischer Stickstoffquelle erhalten wurden, daß jedoch die
Flltrlerbarkelt der erfindungsgemäß erhaltenen PoIysaccharidgele
bedeutend besser Ist.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Gewinnung von Polysacchariden durch Fermentation von Kohlehydraten mittels eines Mikroorganismus der Gattung Xanthomonas, bei dem man nach der Anfangsstufe der Bildung des Inokulums für die folgende Stufe ein Fermentationsmedium mit Ammoniumphosphat als einziger Stickstoffquelle verwendet und das gebildete Polysaccharid aus der Brühe In üblicherweise isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man das Inokulum in einer Menge von 1,27%, bezogen auf das Volumen des Fermentationsmediums der nachfolgenden Stufe, gibt.
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