DE3625868C2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
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Description
Die Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Herstellung
von Polysacchariden auf mikrobiologischem Wege. Insbesondere
betrifft die Erfindung die Herstellung von Polysacchariden,
die aus Polymeren von Glucopyranose bestehen, durch Pilzfermentation
von Zuckern. Die erfindungsgemäßen Verbesserungen
ermöglichen unter Verwendung von Schimmelpilzen die
Herstellung von derartigen Polymeren und insbesondere von
Polymeren, bei denen die Glucopyranosegruppen durch β-1,6-
oder/und β-1,3-Bindungen verknüpft sind, wobei gute Ausbeuten
erzielt werden und die gleichzeitige Bildung von
Oxalsäure praktisch unterbleibt.
Für verschiedene Polysaccharide gibt es gegenwärtig industrielle
Anwendungsmöglichkeiten, von denen einige besonders
wichtig sind. Beispielsweise werden sie in wäßrigen Zusammensetzungen,
Kosmetika, Anstrichmitteln, Präparationen
von verschiedenen Suspensionen, zur Tierfütterung, als
Mittel bei Hypocholesterinämie und dgl. verwendet. Ein
besonders wichtiges Einsatzgebiet ist die Verwendung von
Polysacchariden in Erdölbohrlöchern und bei der Rohölgewinnung.
Ein Polysaccharidtyp, der für die letztgenannten
Einsatzgebiete besonders geeignet ist, umfaßt Polymerketten,
die durch D-Glukose-Struktureinheiten, die über β-1,3-Bindungen
verknüpft sind, gebildet sind und die unter anderem
D-Glucosegruppen, die über β-1,6-Bindungen mit der Kette
verknüpft sind, tragen. Über derartige Verbindungen gibt
es zahlreiche Arbeiten, über deren Ergebnisse man beispielsweise
in der US-PS 33 01 848 nachlesen kann, worin die Fermentation
von unterschiedlichen Zuckern mit Hilfe von filamentösen
Mikroorganismen, wie Sclerotium rolfsii, Sclerotium
glucanicum, Corticium rolfsii, Sclerotinia gladoli, Stromatinia
narcissi und dgl., beschrieben ist. Die erhaltenen
Scleroglucane weisen einen Polymerisationsgrad von etwa 180
bis 1600 auf und können durch Substitution der OH-Gruppen
durch andere funktionelle Gruppen chemisch umgewandelt
werden. Aus einem Medium mit 30 g Saccharose pro Liter, das
jeweils 0,5 bis 3 g/Liter NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl und
Hefeautolysat sowie 0,01 g/Liter FeSO4 enthält, erhält man
nach einer Fermentation von einigen Tagen bei
28°C 8,2 g Scleroglucan pro Liter. Dieses Verfahren ist
großtechnisch anwendbar, ist jedoch mit dem Nachteil behaftet,
daß neben dem Polysaccharid Oxalsäure gebildet
wird, was bei sämtlichen Einsatzgebieten und insbesondere
bei der Rohölgewinnung, wo die Ausfällung von Calciumoxalat
eine Verstopfung von Gesteinsporen bewirkt, stört.
Man muß daher dafür Sorge tragen, daß aus der durch Fermentation
erhaltenen Polysaccharidlösung das Oxalat entfernt
wird, was sich auf die Herstellungskosten auswirkt.
Maxwell und Bateman weisen in "Phytopatology" Bd. 58, Nr. 10
(1968), S. 1351-1354 nach, daß es bei der in Frage stehenden
Fermentation möglich ist, die Bildung von Oxalsäure erheblich
zu verringern, indem man den ursprünglichen pH-Wert des
Züchtungsmediums auf 2,3 absenkt (vergl. S. 1353, Tabelle 3).
Jedoch haben die Autoren bei ihren Untersuchungen die Konzentration
an Scleroglucan nicht gemessen. Untersuchungen,
die zur vorliegenden Erfindung führten, haben gezeigt, daß
eine einfache Verringerung des ursprünglichen pH-Werts unter
2,5 es nicht ermöglicht, die Konzentration an Oxalsäure in
ausreichendem Maße abzusenken, und daß eine derartige
Senkung des pH-Werts sich noch negativer auf die Bildung von
Scleroglucan auswirkt. Durch diese Untersuchungen ist die
Beobachtung der vorstehenden Autoren bestätigt worden, wonach
bei einem Ersatz eines Teils der Glucose durch Glycerin eine
spürbare Verringerung des Gehalts an Oxalsäure erzielt wird
(Glycerin stellt aber ansonsten keine günstige Kohlenstoffquelle
dar und erhöht die Produktionskosten). Somit ist
schließlich keiner der beiden Wege, die im vorgenannten
Stand der Technik empfohlen werden, für eine tatsächliche
großtechnische Anwendung geeignet, so daß die durch die
Anwesenheit von Oxalsäure gegebenen Schwierigkeiten noch
nicht gelöst sind.
Aufgabe der Erfindung ist es, bei der Fermentation von
Zuckern zur Bildung von Polysacchariden unter Verwendung
der in der US-PS 33 01 848 genannten Mikroorganismen die
Bildung von Oxalsäure erheblich zu verringern oder vollständig
zu unterdrücken. Insbesondere sollen nach einem
mikrobiologischen Verfahren, das dem der vorgenannten
US-PS ähnlich ist, Scleroglucane vom gewünschten Polymerisationsgrad
erhalten werden, wobei die Produktion pro Stunde
und pro Volumeneinheit der Kulturbrühe im Vergleich zum
bekannten Verfahren ebenso gut oder sogar besser ist und
das Produkt praktisch frei von Oxalaten anfällt.
Die erfindungsgemäße Verbesserung des vorerwähnten mikrobiologischen
Verfahrens folgt insoweit dem Stand der Technik,
als der anfängliche pH-Wert des Züchtungsmediums des
Schimmelpilzes 2 bis 3 beträgt. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß zu jedem Fermentationszeitpunkt
1 × 10-3 bis 11 × 10-3 und vorzugsweise
3 × 10-3 bis 6 × 10-3 Grammionen NH4⁺ pro Liter enthalten
sind (vgl. die Patentansprüche).
Aufgrund des vorgenannten Merkmals ist mit dem Ausbleiben
der Oxalsäurebildung keine Verringerung der Polysaccharidbildung
verbunden.
Die NH₄⁺-Ionen können in Form eines Ammoniumsalzes einer anorganischen
Säure, insbesondere als Hydrochlorid, Nitrat,
Sulfat oder Phosphat, zugesetzt werden.
Da im Verlauf der Fermentation ein Verbrauch an NH4⁺-Ionen
stattfindet, besteht eine bevorzugte Ausführungsform der
Erfindung darin, daß man dem Medium zu Beginn die angemessene
Menge an Ammoniumsalz zusetzt und anschließend
alle paar Stunden, beispielsweise nach 6, 8, 10 und 12
Stunden, portionsweise weiteres Ammoniumsalz zusetzt, um
den vorstehend genannten Gehalt an Ammoniumionen einzuhalten.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens besteht darin, daß man dem Medium kontinuierlich
NH4⁺ zusetzt und entsprechend dem Fermentationverlauf die
verbrauchten Ammoniumionen ersetzt.
Obgleich die vorerwähnten verschiedenen Spezialbedingungen
für die Nährmedien des Stands der Technik zur starken Verringerung
des Gehalts an bei der Fermentation gebildeter
Oxalsäure geeignet sind, lassen sich noch wesentlich bessere
Ergebnisse erzielen, wenn man Medien verwendet,
in denen sämtliche chemischen Bestandteile, insbesondere
die Spurenelemente und Vitamine, als chemisch definierte
Verbindungen vorliegen (im Gegensatz zu den gemäß dem
Stand der Technik verwendeten Medien, die komplexe natürliche
Extrakte wie Hefeautolysat oder Maisquellwasser,
enthalten).
Wie beim Stand der Technik kann das erfindungsgemäße Verfahren
bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden,
insbesondere im Bereich von 15 bis 35°C und vorzugsweise
im Bereich von 26 bis 30°C. Da die Fermentation aerob verläuft,
ist es zweckmäßig, das Medium mit 0,1 bis 1 Volumenteil
Luft pro Volumenteil des Mediums und pro Minute zu
belüften, wobei ein bevorzugtes Belüftungsverhältnis 0,3
bis 0,6 beträgt. Ferner ist es entsprechend der sich einstellenden
viskosen Beschaffenheit des Mediums erforderlich,
das Medium mit zunehmender Geschwindigkeit zu rühren
(von 150 bis 700 U/min).
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen zur
Züchtung mit dem Pilz Sclerotium rolfsii (Stamm ATCC 15206)
erläutert, wobei Fermenter mit einem Gesamtvolumen von
20 Liter verwendet werden. Die Temperatur beträgt 28°C.
Die Rührgeschwindigkeit wird in Abhängigkeit von der Viskosität
des Mediums zunehmend gesteigert. In sämtlichen
Fällen wird zunächst durch eine 48- bis 72stündige vorherige
Fermentation des gewünschten Mediums mit dem Pilz in einem
Fermenter mit 2 Liter Fassungsvermögen oder in mehreren bewegten
Flaschen, deren Inhalt unmittelbar vor der Überimpfung
vereinigt wird, ein Inokulum hergestellt. Anschließend
werden 1200 ml des Inokulums in 13,8 Liter Medium, das in
einem 20 Liter fassenden Fermenter bereitgestellt worden
ist, eingeführt. Die Züchtung wird 55 bis 72 Stunden fortgesetzt.
Sodann wird eine Fraktion der homogenen flüssigen
Masse aus dem Fermenter entnommen, um die Summe aus Myzel +
Polysaccharid - als "nativ" bezeichnet - durch Fällung mit
Alkohol zu bestimmen. Nach Filtration einer weiteren Fraktion
der flüssigen Masse zur Abtrennung von Myzel und Polysaccharid
unter anschließender Fällung des Filtrats (ebenfalls
mit Alkohol) erhält man die Menge an gebildetem Scleroglucan.
Ferner wird der Oxalsäuregehalt im Überstand nach
Zentrifugation einer Fraktion des Fermentationsprodukts
chromatographisch in flüssiger oder gasförmiger Phase bestimmt.
Eine derartige Bestimmung wird auch mittels einer
enzymatischen Sonde durchgeführt, die aus einer sauerstoff-
empfindlichen Elektrode besteht, die mit einer Schutzmembran,
die Oxalatoxidase enthält, umgeben ist. Schließlich wird
auch die Konzentration des während der Fermentation nicht
verbrauchten Zuckers ermittelt.
Die Züchtung wird gemäß US-PS 33 01 848 in 20 Liter fassenden
Fermentern oder in 0,5 Liter fassenden Schüttelflaschen
unter Verwendung des nachstehend angegebenen Mediums (die
Mengenangaben beziehen sich auf g/Liter Wasser) durchgeführt.
Glucose | |
35 | |
Maisquellwasser | 4 |
NaNO₃ | 1,6 |
KH₂PO₄ | 0,8 |
MgSO₄ · 7 H₂O | 1,2 |
Vitamin B1 | 5 × 10-3 |
pH-Wert am Anfang | 4,5 |
Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle wiedergegeben
und erlauben einen Vergleich mit den erfindungsgemäßen Beispielen.
Man verfährt wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß der
pH-Wert des Mediums vorher auf 2,5 eingestellt wird.
Das Medium von Beispiel 2 mit einem pH-Wert von 2,5 wird
mit 3 g/Liter NH4Cl, d. h. 5,6 × 10-2 Mol/Liter NH4⁺, versetzt,
wobei sämtliche übrigen Bedingungen gleich wie in Beispiel 1
sind.
Das allgemeine Verfahren wird beibehalten, wobei man aber
das Kulturmedium der vorstehenden Beispiele durch das nachstehend
angegebene erfindungsgemäß verwendete Medium ersetzt (g/Liter).
Glucose | ||
35 | ||
K₂HPO₄ | 0,7 | |
NH₄NO₃ | 0,88 | |
NCl | 0,15 | |
MgSO₄ · 7 H₂O | 0,20 | |
FeSO₄ · 7 H₂O | 3,66 × 10-3 | |
MnSO₄ · H₂O | 2,68 × 10-3 | |
ZnSO₄ · 7 H₂O | 3,56 × 10-3 | |
Thiamin-hydrochlorid | 10-4 | |
pH-Wert 2,5 @ | NH₄⁺ = 11 × 10-3 Mol/Liter @ | (Ergebnisse im Anschluß an Beispiel 6) |
Das Medium mit einem ursprünglichen pH-Wert von 4,5 ist das
gleiche wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß als
mineralischer Stickstoff anstelle von Natriumnitrat 0,74 g
Ammoniumnitrat verwendet werden. Ferner werden immer dann,
wenn die Konzentration an NH4⁺-Ionen im Medium unter 3 × 10-3
Mol/Liter abfällt, 0,3 g/Liter NH4Cl zugesetzt. Dieser Zusatz
erfolgt 3 oder 4mal während des gesamten Fermentationsverlaufs.
Das Medium mit einem ursprünglichen pH-Wert von 2,5 entspricht
dem Medium von Beispiel 4, wobei aber 0,3 g/Liter
NH4Cl jedesmal dann zugesetzt werden, wenn die Konzentration
an NH4⁺-Ionen unter 3 × 10-3 Mol/Liter fällt.
Ein Vergleich der Ergebnisse in Schüttelflaschen gemäß Beispiel 1
einerseits und Beispiel 2 andererseits zeigt, daß
eine Verminderung des pH-Werts entsprechend dem Stand der
Technik nicht ausreicht, um eine Verringerung der Oxalsäure
auf Spurenmengen zu erreichen. Beispiel 3 zeigt, daß eine
hohe Konzentration an Ammoniumionen eine vollständige Unterdrückung
der Oxalsäurebildung ermöglicht. Jedoch bringt
eine derartige Konzentration an Ammoniumionen auch eine
starke Verringerung der Bildung an Scleroglucan mit sich.
Es gibt in bezug auf die Konzentration an NH4⁺-Ionen im Fermentationsmedium
einen mittleren Konzentrationsbereich, bei
dem die Bildung an Oxalsäure verhindert wird, ohne daß sich
ein nachteiliger Einfluß auf die Polysaccharidausbeute
ergibt. Dies ergibt sich auch aus einem Vergleich der in Fermentern
mit 20 Liter Fassungsvermögen durchgeführten Beispiele.
Das in Schüttelkolben durchgeführte Beispiel 4 zeigt, daß die
Bildung von Scleroglucan im erfindungsgemäß verwendeten Medium mindestens
ebenso gut wie bei bekannten Verfahren ist und daß
sich eine deutliche Verringerung an gebildeter Oxalsäure
ergibt.
Die Endkonzentration an Polysaccharid ist in Fermentern mit
20 Liter Fassungsvermögen (wo die Rühr- und Belüftungsbedingungen
besser kontrollierbar sind) im allgemeinen höher
als in den Flaschen. Ein Vergleich der Ergebnisse mit Fermentern
von 20 Liter Fassungsvermögen von Beispiel 1 mit den
Ergebnissen von Beispiel 5 zeigt, daß gemäß dem Stand der
Technik zwar eine starke Verringerung aber keine vollständige
Unterdrückung der Bildung an Oxalsäure erreichbar ist. Durch
eine kontrollierte Zugabe an NH4Cl während des Fermentationsverlaufs
ist es beim erfindungsgemäß verwendeten Medium möglich, die
Oxalsäurebildung vollständig zu unterdrücken, ohne daß die
Ausbeute an Scleroglucan verringert wird. Es handelt sich hiermit
um den mittleren Bereich, von dem vorstehend die Rede gewesen
ist.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden praktisch
ohne Oxalatbildung, bei dem man eine Pilzfermentation
in einer wäßrigen Lösung eines Zuckers bei einem anfänglichen
pH-Wert von 2 bis 3 durchführt, dadurch gekennzeichnet,
daß dem Medium NH4⁺-Ionen in solcher Weise zugesetzt
werden, daß zu jedem Fermentationszeitpunkt
1 × 10-3 bis 11 × 10-3 Grammionen NH4 je Liter Medium
enthalten sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
zu jedem Fermentationszeitpunkt 3 × 10-3 bis 6 × 10-3
Grammionen NH₄ je Liter Medium enthalten sind.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8511765A FR2585723B1 (fr) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | Procede ameliore d'obtention de polysaccharides par fermentation |
Publications (2)
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---|---|
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ID=9321856
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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---|---|
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GB (1) | GB2178437B (de) |
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1985
- 1985-08-01 FR FR8511765A patent/FR2585723B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-07-29 NO NO863065A patent/NO863065L/no unknown
- 1986-07-29 GB GB8618414A patent/GB2178437B/en not_active Expired
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2178437B (en) | 1989-07-26 |
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GB2178437A (en) | 1987-02-11 |
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FR2585723A1 (fr) | 1987-02-06 |
GB8618414D0 (en) | 1986-09-03 |
FR2585723B1 (fr) | 1989-01-13 |
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