DE2229285A1 - Verfahren zur extraktion von proteinen aus zellen von mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur extraktion von proteinen aus zellen von mikroorganismen

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Description

München, den 15. Juni 1972 ratiitflivill s 509
4·
Tel SO SI M
Societe d'Assistance Technique Pour Produits Nestle S.A.
in Lausanne / Schweiz
/erfahren zur Extraktion von Proteinen aus Zellen von Mikro
organismen
Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von Proteinen.
Es besteht ein wachsendes Interesse an neuen Proteinquellen, und zwar sowohl für die Ernährung von Menschen und Tieren als auch für industrielle Anwendungen. Die Mikrobenzellen stellen eine der Proteinquellen dar, welche zur Zeit Gegenstand von zahlreichen Forschungsarbeiten bilden. In dieser Hinsicht sind insbesondere die Hefen und die Bakterien von Interesse.
Die Gewinnung oder Extraktion der in den Zellen von Mikroorganismen enthaltenen Proteine kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Die bekanntesten sind die erizymatische Behanalung, aas mechanische Zerbrechen der
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OHiGiHAL
Zellenwände Lind die chemische Extraktion mit Hilfe von sauren oder alkalischen Mitteln. Zwar besitzt jede dieser Techniken gewisse Vorteile, aber die Anforderungen an für die Ernährung geeigneten Qualitäten sind so streng, dass die Verfahren, die einen gewissen technischen Wert besitzen, wirtschaftlich wenig attraktiv erscheinen. So können die Zellen von Mikroorganismen beispielsweise auf verschiedenen mechanischen Wegen zerstört v/erden, aber trotzdem bleibt die'Ausbeute an löslichen Stoffen, verhältnismässig niedrig, auch wenn lange Behandlungszeiten angewendet werden,, Da ausserdem die Zellen von Mikroorganismen verschiedene Mengen an Nukleinsäuren enthalten können, deren Anwesenheit in höheren Konzentrationen bei der menschlichen Ernährung nicht ratsam erscheint, wurden auch Arbeiten durchgeführt, mit dem Ziel, den Gehalt an solchen Säuren auf annehmbare Vierte zu verringern.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wirksames Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus Hefen und aus Bakterie"nzellen. Das Verfahren, bei dem die Zellen mechanisch behandelt werden, um die Zellenwände zuzerbrechen, ist dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung der Zellen unter stark alkalischen Bedingungen ausführt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Behandlung, weiche es gestattet, die Qualität der Zellen von Mikroorganismen für die Ernährung zu verbessern»
i,3 wurde festgestellt, dass die Ausbeute an löslichgemachten Stoffen bei der Zerstörung der Zellen von Bakterien Lind Hefen erhöht werden kann, wenn rr.an unter stark alkalischen 3e-
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OfHGiNAi INSPECTED
dingungen arbeitet, und zwar vorzugsweise "bei einem pH über 10 (für Hefen) und über 11 (für Bakterien),, Wenn der pH auf solche Werte gehalten wird, dann zeigt sich., dass die Zellenwände "beträchtlich geschwächt werden, so dass sie leichter zerbrochen werden können. Bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens wird der pH der Zellensuspension durch Zugabe eines Alkalis auf einen gewünschten Wert eingestellt, worauf dann die Zellen einer mechanischen Zerkleinerung unterworfen werden. Dieser Vorgang kann mit den verschiedensten Vorrichtungen durchgeführt werden, wie z.B. mit einem herkömmlichen Homogenisator oder mit einer Braun-Kugelmühle. Das Zerbrechen der Zellenwände kann aber auch dadurch erreicht werden, dass man die Zellen einem plötzlichen Druckabfall oder einer Behandlung mit Ultrascha.llwellen unterwirft.
Die zum Zerbrechen der Zellen besonders geeigneten Verfahren sind Fachleuten auf diesem G-ebiete allgemein bekannt, weshalb es nicht nötig ist, näher darauf einzugehen. Das erfindungsgemässe Verfahren kann bei allen mechanischen Verfahren zum Zerbrechen der Zellen angewendet werden. Ausserdem kann diese Behandlung sowohl bei Hefen als auch bei Bakterien mit Erfolg herangezogen werden.
Die Konzentration der Zellen in der Suspension, die der mechanischen Zerkleinerung unterworfen wird, kann innerhalb weiter Grenzen schwanken und ist durch praktische Erwägungen bestimmt. Die Durchführung des Verfahrens mit einer sehr verdünnten Suspension erfordert die Abtrennung und die Behandlung von beträchtlichen Mengen Flüssigkeiten, während das Arbeiten mit einem konzentrierteren Medium, beispielsweise bei einer Konzentration von 15 bis 20 Gew.-^ Fest-
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substanz, insbesondere wegen der Viskosität der Suspension beträchtliche Schwierigkeiten mit sich bringt. In der Praxis liegt die Konzentration zwischen 1 und 15 Gew. -fy und vorzugsweise zwischen 5 und 10 Gew.-^ Zellentrockensubstanz. Bei der Produktion von Mikroorganismuszellen durch Fermentation liegt die Konzentration des Mediums gewöhnlich zwischen 1 und 3 f° Trockensubstanz, bezogen auf die Biomasse. Es ist deshalb vorteilhaft, das Fermentationsmedium vor der Einstellung des pH für die mechanische Zerkleinerung zu konzen- ■ trieren. Diese Konzentrierung kann beispielsweise durch Zentrifugierung, Dekantierung oder Eindampfung vorgenommen werdeno Wenn die Suspension durch eine Zentrifugierung konzentriert wird, dann kann es vorteilhaft sein, vorher das Medium anzusäuern, wobei auch gegebenenfalls auf eine Temperatur zwischen 40 und 100 G erhitzt werden kann, um die Zellenmasse zum Zusammenballen zu veranlassen und die Abtrennung zu erleichtern.
Die mechanische Behandlung wird bei einem pH ausgeführt, der sich im allgemeinen nach der Art der Mikroorganismen und der vorgesehenen Verwendung des Zellenprodukts richtet. Wenn das Zellenprodukt für die Ernährung bestimmt ist, dann ist ein pH über 12 nicht anzuraten, da übermässig stark alkalische Bedingungen die Neigung ergeben, dass die Ernährungseigenschaften des Proteins verschlechtert werden. Im Gegensatz hierzu können bei industriellen Anwendungen der Proteine, beispielsweise bei der Herstellung von Klebstoffen oder Harzen, Alkalikonzentrationen, Vielehe höhere pH-Werte ergeben, von Vorteil seino Dadurch wird die Wirksamkeit der mechanischen Behandlung im allgemeinen erhöht und das Zerbrechen dex· Zellenwände in einem beträchtlichen Ausmass erleichtert»
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Die Temperaturbedingungen können ebenfalls das Ergebnis der erwähnten mechanischen Behandlung beeinflussen. Auch die lemperaturbedingungen werden weitgehend von der Verwendung der Proteine "bestimmt. Hohe Alkalikonzentrationen und hohe Temperaturen fördern den Abbau der Proteine« Infolgedessen soll die Behandlung beispielsweise bei Temperaturen von 18 bis 25 C und nicht beträchtlich über der Raumtemperatur aus- ■ geführt werden, wenn das Produkt für die menschliche Ernährung bestimmt-ist. Die Behandlung kann aber bei höheren Temperaturen ausgeführt werden, wenn die Proteine für andere Anwendungen dienen sollen.
wirksames Zerbrechen der Zellen kann in zweckmässiger Weise unter Druck mit Hilfe eines Homogenisators ausgeführt werden, wie er allgemein in der Ernährungsindustrie verwendet wirdo Der Druck kann zwischen 200 und 700 kg/cm liegen. Er richtet sich nach den Behandlungsbedingungen und nach dem 3-rad der gewünschten Zerkleinerung» Im allgemeinen gestattet es das erfindungsgemässe Verfahren, den Druck beträchtlich herabzusetzen, der nötig ist, wenn auf üblichem Wege ein vergleichbarer Auflösungsgrad erzielt werden sollo
Vor der mechanischen Zerkleinerung kann man, je nach der Bestinniung der Zellenstoffe, eine saure oder enzymatisch^ Hydrolyse der Zellen durchführen, um die Nukleinsäuren löslich zu machen. Es kann aber auch vorteilhaft sein, eine solche Hydrolyse nach dem Zerbrechen der Zellen durchzuführen, da dann ihr Inneres besser für den Angriff durch die Säure oder die Enzyme zugänglich ist.
Die Kasse der behandelten Zellen, d.h. nach dem mechanischen Zerbrechen aer Zellenwände, kann, wie oben erläutert, für
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die Herstellung der verschiedensten Produkte verwendet werden. Beispielsweise kann man die Bruchstücke der Zellenwände durch. Zentrifugation abtrennen und die löslichen Proteine aus der alkalischen Lösung mit Hilfe einer Säure ausfällen. Man kann aber auch die Proteine einer enzymatischen Hydrolyse unterwerfen, um Peptide mit einem niedrigen Molekulargewicht herzustellen, welche ebenfalls unter Vervrendung einer geeigneten 'lechnik (Ausfällung, Abtrennung, Waschung uswo) gewonnen werden können.
Es hat sich gezeigt, dass man eine zerkleinerte Zellenmasse, und zwar insbesondere eine bakterielle Biomasse, direkt nach der erfindungsgemässen Behandlung in Proteinfasern verspinnen kann,, Solche Pasern kann man, obwohl sie Bruchstücke der Zellenwände enthalten, durch Verstrecken orientieren, während es kaum möglich ist, Fasern mit einer zufriedenstellenden Qualität aus einer Biomasse herzustellen, die intakte Zellen enthält, Endlich kann man die Proteine auch für die Herstellung von Formgegenständen durch Extrusion, von Harzen auf Proteinbasis oder von Klebstoffen verwenden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die Prozentangaben sind in Gewicht ausgedrückte
Beispiel 1
Eine Fermentationsbrühe, die 1,5 > Zellentrockensubstanz enthält und die durch Kultivierung von Micrococcus cerificans in einem Medium hergestellt worden ist, welches Äthanol als Kohlenstoffquelle enthält, wird mit Schwefelsäure auf einen pH von 1 angesäuert. Das Gemisch wird 30 Minuten lang auf 90°C erhitzt, und dann wird die Zellensuspension auf etwa 20 C abgekühlt und durch Zentrifugierung konzentriert, um
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eine Biomasse herzustellen, die 6,5 $ Zeilentrockensubstanz enthält* Dann wird 2 η l\fatriumhydroxyd zu 50 ml-Proben der konzentrierten Suspension zugegeben, derart, dass eine Probenreihe erhalten wird, deren pH-Werte 3,5, 5,0, 7,0, 9,5, 11 bzw« 1 2. betragene
Jede Probe wird 1 Einute lang mittels eines Braun-Apparats mit 30 ml Glaskugeln von 0,1 bis 0,11 mm behandelt« Unter normalen Bedingungen reicht diese Zeit nur dazu, ein teilweises Zerbrechen der Zellen zu erzielen«, Nach einem 60 Minuten dauernden Rühren bei 20 0 unter verschiedenen pH-Werten werden die in der folgenden Tabelle angegebenen Mengen an freien Proteinen (in Prozent ausgedrückt) erhalten.
pH während der löslichgemachte Proteine
Behandlung
3,5 5,0 7,0
9,5 11,0 12,0
Die Resultate in dieser Tabelle zeigen, dass die mechanische Zerkleinerung der Zellen bei einem pH von mehr als 11 in unerwarteter Weise eine erhöhte Ausbeute an löslichgemachten Proteinen ergibt.
!■•seispiel 2
λ κ wird eine Fermentationsbrühe, die 1,5 i» Zellentrockensub-3tanz eritnäli;, aus einer Kultur von Micrococcus cerificans
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pH 7 pH 9 pH 11 pH 12
3,5 6,0 15,8 31,2
3,6 5,8 14,6 33,2
4,8 5,5 14,2 29,2
7,0 8,2 16,3 34,2
8,3 10,2 20,0 34,0
12,0 16,2 33,2 42,2
in einem Medium gezüchtet, die als Kohlenstoffquelle lineare C.0~C .-Paraffine enthält. Die Brühe wird mit Schwefelsäure auf pH 3 angesäuert und dann 10 Minuten auf 700C erhitzt. Die Biomasse wird konzentriert und auf ungefähr 20 C abgekühlt.
Dann wird zu 100 ml-Proben der konzentrierten Brühe Ifatriumhydroxyd zugesetzt, um Proben herzustellen, die einen pH von 7 bzw. 1 2 aufweisen,, Jede Probe wird mit Hilfe eines BIBI- " Zellendesintegrators unter einem Druck von 650 kg/cm homogenisiert. Nach einem 60 Minuten dauernden Rühren bei einem pH γόη 12 und bei einer Temperatur von 200O hat sich der Anteil an proteinischem Stickstoff in der überstehenden Flüssigkeit der beiden Proben auf 32 bzw«, 45 $ erhöht,,
Beispiel 3
Es wird eine Hefesuspension durch Kultivierung von Candida lypolytica in einem Medium hergestellt, welches als Kohlenstoff quelle lineare C10-C2.-Paraffine enthält. Die Suspension wird zentrifugiert, und dann wird zu 100 ml-Proben der konzentrierten Suspension, die 5 ?° Trockenzellensübstanz enthält, Ammoniak zugesetzt, um Proben herzustellen, die einen pH von 6,5, 10 bzw. 11 aufweisen,,
Jede Probe wird unter identischen Bedingungen unter einem
ο
Druck von 650 kg/cm mit Hilfe eines HIBI-Zellendesintegrators behandelt. Der pH der Proben wird durch Zusatz von Schwefelsäure auf 7 eingestellt, und dann werden die Mischungen 60 Minuten bei 220C gerührt» Der Anteil des gesamten gelösten Stickstoffs in der überstehenden Flüssigkeit der drei Proben steigt auf 49, 60 bzw. 70 °/om
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Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE:
    1 ö Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus Zellen von Mikroorganismen, bei welchem die Zellen mechanisch "behandelt werden, um die Zellenwände zu zerbrechen, dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung der Zellen unter stark alkalischen Bedingungen ausführte
    2« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung von Bakterienzellen bei einem pH über 11 ausführt.
    3* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung von Hefezellen bei einem pH über 10 ausführt.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Fermentationsbrühe von Bakterien konzentriert, um eine Zellensuspension mit einem Zellentrockensubstanzgehalt von 5 bis 10 fo herzustellen, dass man ein Alkali zusetzt, um den pH der Suspension auf einen Wert zwischen 11 und 12 zu bringen, und dass man die Zellen der erwähnten mechanischen Behandlung unterwirft.
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Fermentationsbrühe von Hefe konzentriert, um eine Zellensuspension mit einem Zellentrockensubstanzgehalt von 5 bis 10 fo herzustellen, dass man ein Alkali zusetzt, um dein pH der Suspension auf einen Wert zwischen 10 und 12 zu bringen, und dass man die Zellen der erwähnten mechanischen Behandlung unterwirft.
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    - ίο -
    6β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine üPermentationsbrühe ansäuert, dass man die angesäuerte Brühe konzentriert, um eine Zellensuspension mit einem Zellentrockensubstanzgehalt von 5 bis 10 °/o herzustellen, dass man ein Alkali zusetzt, um die Suspension auf einen pH über 10 zu bringen, und dass man die Zellen der erwähnten mechanischen Behandlung unterwirft,
    7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellensuspension einer sauren oder enzymatischen Hydrolyse unterwirft, um die Nukleinsäuren löslich zu machen,,
    8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellensuspension nach der erwähnten mechanischen Behandlung einer sauren oder enzymatischen Hydrolyse unterwirfto
    9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung der Zellen bei einer Temperatur zwischen 18 und 25 0 ausführte
    10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung der Zellen mit Hilfe eines Homogenisators ausführt.
    11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die mechanische Behandlung der Zellen mit Hilfe eines Zellendesintegrators bei einem Druck zwischen 200 und 700 kg/cm2 ausführt.
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