DE2535926A1

DE2535926A1 - Verfahren zur herstellung von einzellproteinpraeparaten mit verbesserter dispergierbarkeit

Info

Publication number: DE2535926A1
Application number: DE19752535926
Authority: DE
Inventors: David Charles Steer
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1974-10-16
Filing date: 1975-08-12
Publication date: 1976-05-06
Also published as: BE834352A; FR2288148A1; NL7508962A; ES441849A1; GB1519957A; FR2288148B3; IT1048478B

Description

IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED London, Großbritannien

Verfahren zur Herstellung von Einzellproteinpräparaten mit verbesserter Dispergierbarkeit

Die Erfindung bezieht sich .auf ein Verfahren zur Behandlung von Mikroorganismenzellen, die bei der Herstellung von Einzellprotein erzeugt werden.

Bei einem Verfahren zur Herstellung von Einzellprotein durch Züchtung von Mikroorganismen auf einem wässrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff aufweist,wird als zunächst anfallendes Produkt eine Mikroorganismenzellen enthaltende wässrige Suspension erhalten.

Zur Abtrennung der Mikroorganismenzellen von der Suspension können unterschiedliche Verfahrensweisen angewandt werden. So können die Zellen-möglicherweise nach einer

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gewissen Vorbehandlung- zunächst in Absetztanks vom Hauptteil der Flüssigkeit geschieden werden. Nach dem Absetzen der Zellen können diese weiter durch Zentrifugieren angereichert und dann getrocknet werden unter Erzielung von getrockneten Mikroorganismenzellen als Endprodukt.

Die in dieser Weise erzeugten Zellen können zur Verfütterung an Jungtiere, wie z.B. Kälber, dem Milchersatz zugemischt werden, d.h. sie sind in Futtermischungen für Jungtiere brauchbar, die einen vollständigen oder teilweisen Ersatz für Kuhmilch bilden sollen. Ein bei der Erzeugung von Milchersatz auftretendes Problem besteht darin, die Zellen in Wasser gut dispergierbar zu machen, so daß eine homogene Suspension erhalten wird.

Gemäß der Erfindung wird nun ein Verfahren zur Behandlung von Mikroorganismenzellen vorgesehen, bei. dem eine die Zellen enthaltende wässrige Suspension mit einem proteolytischen Enzym oder einem proteolytischen Enzympräparat unter Bildung eines Produktes mit verbesserter Dispergierbarkeit behandelt wird.

Normalerweise werden die Zellen für die Verwendung in Milchersatzprodukten anschließend getrocknet. Vor der Behandlung mit einem proteolytischen Enzym kann die wässrige Zeilsuspension zweckmäßigerweise einer Vorbehandlung unterworfen werden. Dies ist besonders erwünscht, wenn die Zellen

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Hefezellen sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Behandlung von Mikroorganismenzellen angewandt werden, die nach irgendeinem Verfahren zur Erzeugung von Einzellprotein erzeugt werden. So können die Zellen beispielsweise Hefe- oder Bakterienzellen sein, die in einem Medium gezüchtet wurden, das irgendeine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie z.B. Kohlehydrat, Kohlenwasserstoff oder einen oxydierten Kohlenwasserstoff wie einen Alkohol enthält. Vorzugsweise sind die Zellen Bakterienzellen, insbesondere Bakterienzellen, die auf einem Medium gezüchtet werden, das einen Alkohol, beispielsweise Methanol, als eine Kohlenstoffquelle enthält.

Zu Beispielen für Hefezellen gehören Stämme der Genera Candida« Hansenula« Saccharomyces» Torula und Torulopsis.

Zu Beispielen für Bakterienzellen gehören Stämme der Genera Pseudomonas. Alcaligenes. Arthrobacter. Micrococcus. Cellulomonas. Hvdrogenomonas, Methylococcus« Methanomonas« Nocardia und Bacillus wie Pseudomonas fluorescens NCIB 9046, Pseudomonas diminuta NCIB 9393ι Alcaligenes faecalis NClB 8156 und Arthrobacter Stamm NRRL B3728. Sehr geeignete Bakterienzellen sind Stämme der Arten Pseudomonas methylotropha, Pseudomonas rosea, Hyphomicrobium variabill und Microcyclus polvmorphum« die in der GB-PS 1 370 892 (entsprechende US-

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Patentanmeldung Serial Nr. 416098 und FR-Patent-Nr. 7 144 042) der Anmelderin beschrieben sind. Kulturen von einer Anzahl von Stämmen dieser letzten Arten wurden im National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torrey Research Station, Aberdeen, Schottland (GB) hinterlegt und entsprechende Hinterlegungen wurden bei den Sammlungen des US Department of Agriculture (NRRL) Peoria, Illinois und beim Fermentation Research Institute (FRI), Japan vorgenommen. Die Hinterlegungsnummem dieser Kulturen sind folgende:

NCIB Nr. 10508 bis 17 und 10592 bis 10612 NRRL Nr. B5352 bis B5382 FRI Nr. 1215 bis 1245

Bei einem Verfahren zur Erzeugung von Einzellprotein durch Züchtung von Mikroorganismen in einem Fermenter ist das ursprüngliche, den Fermenter verlassende Produkt eine Mikroorganismenzellen umfassende, wässrige Suspension. Zur Abtrennung der Zellen von dieser Suspension kann letztere in Absetztanks für eine gewisse Trennung der Zellen von der Flüssigkeit geschickt werden. Alternativ können die Zellen durch ein Flotationsverfahren abgetrennt werden. Zur Verbesserung der Absetzgeschwindigkeit kann die Suspension einer Vorbehandlung unterworfen werden, bevor sie in die Absetztanks geschickt wird. Bei dieser Vorbehandlung können die Zellen entweder durch Zugabe eines ausflockenden Mittels

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oder nach dem Verfahren der GB-PS 1 381 306 der Anmelderin ausgeflockt werden. Bei dem letzteren Verfahren werden die Zellen einem Wärmeschock von begrenzter Dauer (dem ggf. eine Behandlung mit einem Alkali vorangehen kann) unterworfen, woran sich eine Behandlung mit Säure anschließt. Nach dem Absetzen können die Zellen weiter durch Zentrifugieren eingeengt und dann zur Erzielung von Mikroorganismenzellen getrocknet werden.

Das nach dem Zentrifugieren anfallende zellhaltige Material ist ein etwa 25 Gew.% Feststoffe umfassender Creme mit einem pH von 3,0 bis 5,0 (wenn eine Vorbehandlung nach dem Verfahren der GB-PS 1 381 306 der Anmelderin vorgenommen wurde). Ohne Zentrifugieren enthält der Creme weniger, etwa 5 bis 20 Gew.# Feststoffe. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird dieses Material mit einem proteolytischen Enzym geeignet behandelt, wonach die Zellen getrocknet werden. Vorzugsweise wird der Zentrifugencreme vor der Behandlung mit dem proteolytischen Enzym mit einem Alkali, z.B. Natriumhydroxid, auf etwa pH 7,0 neutralisiert. Diese Neutralisation ist nicht wesentlich. Wenn allerdings einige proteolytische Enzyme, wie z.B. die von Organismen der Genus Bacillus erzeugteil neutralen oder alkalischen. Proteasen verwendet werden, ist der Neutralisationsschritt erwünscht.

Die Zugabe des proteolytischen Enzyms erfolgt zweckmäßigerweise bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 90⁰C

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I NACHGEREICIrIT

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(vorzugsweise 50 bis 80⁰C) und bei einem pH im Bereich von 3,5 bis 10,0 (vorzugsweise pH 6,0 bis 7,0). Vorzugsweise wird das Enzym mit dem Zentrifugencreme eine Zeitdauer von 5 bis 12o Minuten, insbesondere 15 bis 30 Minuten lang gemischt, bevor die Zellen getrocknet werden. Das handelsübliche Enzympräparat wird zum Zentrifugencreme vorzugsweise in einer Konzentration von 0,05 bis 1,0 Qev.% des anwesenden Einzellproteins zugesetzt. Wenn ein Enzympräparat von höherer Potenz bzw. Leistungsfähigkeit als normale handelsübliche Präparate angewandt wird, kann die Konzentration bei 0,005 bis 0,05 Gew.% liegen.

Bei einer alternativen Methode zur Angabe der benutzten Enzymmenge wird diese in Aktivitätseinheiten angegeben. Dies ist allerdings ziemlich schwierig bzw. problematisch, da die für die Ermittlung der Aktivität angewandten Bedingungen selten in unmittelbare Nachbarschaft zu denjenigen kommen, die bei der gewerblichen Anwendung der Enzyme herrschen. Im vorliegenden Falle trifft dies gewiss für die international akzeptierten Methoden der Bestimmung proteolytischer Enzyme zu, von denen sich keine auf Bedingungen bezieht, die den im vorliegenden Verfahren angewandten ähnlich sind. Um jedoch eine annähernde quantitative Aussage zu machen, kann unterstellt werden, daß für die vorliegenden Zwecke Bereiche der

-5 -2 proteolytischen Aktivität von 5 x 10 bis 5 χ 10 Anson-Einheiten der proteolytischen Enzymaktivität pro g Einzellprotein oder in anderen Aktivitätseinheiten ausgedrückte

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Äquivalente anwendbar sind.

Geeigneterweise ist das proteolytische Enzym ein Enzym, das sich von einem Bakterium ableitet, das bei höheren Temperaturen, d.h. über 50⁰C,stabil ist. Zu Beispielen für geeignete Enzyme gehören Enzyme, die sich von Mikroorganismen der Arten Bacillus subtilis ableiten, Pilzproteasen und Proteasen pflanzlichen Ursprungs, wie Papain und Ficin. Zu besonders geeigneten Enzymen gehören ALCALASEWvon Novo Industri A/S, Kopenhagen (DK), ein durch Tauchfermentation einer Spezies des Genus Bacillus gewonnenes proteolytisches Enzympräparat und PROTEINASE von ABM chemicals Ltd., Stockport, England.

Das getrocknete Produkt, das durch Behandlung der Mikroorganismenzellen mit einem proteolytischen Enzym gemäß der Erfindung und anschließendes Trocknen der Zellen erhalten wird, liefert stabilere und homogenere Dispersionen in Wasser und besitzt eine verbesserte Löslichkeit beim Einbringen in Kälbermilchersatz (im Vergleich zu Produkten, die nicht behandelt wurden). Typischerweise liegt die Stickstoff-Löslichkeit von unbehandelten Produkten bei 20 bis 25 %, während mit den enzymbehandelten Produkten in einigen Fällen Löslichkeiten über 50 % erreicht werden können.

Der Mechanismus, nach dem durch die Erfindung verbesserte Dispergierbarkeiten von Mikroorganismenzellen in Wasser

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erreicht werden, ist wahrscheinlich sehr komplex. Zur Unterstützung des Verständnisses der allgemeinen Natur des Verfahrens wird jedoch,ohne dadurch den Rahmen der Erfindung irgendwie einschränken zu wollen, folgende Hypothese für eine teilweise Erklärung des Effekts vorgeschlagen:

Die Teilchen von getrockneten Einzellproteinpräparaten haben oft eine durchgehende Außenschicht, von der angenommen wird, daß sie hauptsächlich aus Protein besteht. Eine teilweise Hydrolyse des Proteins vor dem Trocknen bewirkt die Einführung von mehr geladenen Gruppen in das Protein durch Aufspaltung von Peptidbindungen. Daraus ergibt sich eine modifizierte Struktur des endgültigen getrockneten Materials mit einem höheren Grad an Protein-Löslichkeit. Die gesteigerte Löslichkeit der Außenschicht führt zu einer vermehrten Tendenz der Teilchen zum Auf- bzw. Auseinanderbrechen, was die Dispergierbarkeit des Produktes verbessert. Ferner wird die Viskosität der Flüssigkeit dadurch,daß mehr Protein gelöst wird, erhöht, was ebenfalls zur Erzielung stabiler Dispersionen beiträgt. Beim Mischen mit Wasser ergeben die enzymbehandelten Produkte somit rascher stabile Dispersionen als unbehandelte Produkte.

Nachfolgend wird die Erfindung an Hand von Beispielen erläutert:

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Beispiel 1

50 1 eines 10 Gevr.% Einzellprotein (erlangt von einem Organismus der Spezies Pseudomonas methylotropha) enthaltenden Schlamms,der durch Einengen der Fermentationskultur nach dem in der GB-PS 1 381 306 der Anmelderin beschriebenen Verfahren erhalten worden war, wurdenmit dem Enzym "Bacterial Proteinase Novo"CNovo Industri A/S) unter den folgenden Bedingungen behandelt:

"Bacterial Proteinase Novo" wurde in einer kleinen Menge ^ Wasser gelöst und zu dem Schlamm hinzugegeben zur Erzielung einer Endkonzentration von 0,2 % (bezogen auf das Einzellproteingewicht).. Der Schlamm wurde unter beständigem Rühren 20 Minuten lang bei 60°C und pH 7,0 gehalten und dann sprühgetrocknet. Eine Vergleichsprobe ohne Enzymzusatz wurde ebenfalls hergestellt.

Die Stickstoff-Löslichkeit der sprühgetrockneten Vergleichsprobe lag bei 24 %, während die sprühgetrocknete enzymbehandelte Probe eine Stickstoff-Löslichkeit von 54 % aufwies.

Die "Dispergierbarkeit" dieser beiden Proben wurde in folgender Weise verglichen:

Eine 5 %ige Dispersion des Vergleichsmaterials wurde durch Einmischen von 250 g in 5 1 Wasser bei 70⁰C in einem Hobart-

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Mischer unter Verwendung eines quirlartigen Zusatzes erzeugt. Die Suspension wurde 2 Minuten lang gemischt und dann rasch in zwei 2 1 Meßzylinder überführt. Die mit "Bacterial Proteinase Novo" behandelte Proteinprobe wurde in gleicher Weise untersucht.

Im Falle der Vergleichsprobe bildete sich am Boden der Zylinder rasch eine Sedimentschicht mit einer Grenzfläche bei etwa 40 ml nach 10 Minuten und 80 ml nach 30 Minuten. Eine obere Grenzschicht von sich absetzendem Material wurde ebenfalls langsamer ausgebildet. Diese obere Grenzschicht war nach 10 Minuten nicht sichtbar, jedoch zeigte sie sich nach 30 Minuten bei 1850 ml und nach einer Stunde bei 1700 ml.

Bei der mit "Bacterial Proteinase Novo" behandelten Probe wurde dagegen eine homogene Suspension erhalten, bei der selbst nach 60 Minuten keinerlei Grenzflächen festzustellen waren.

Beispiel 2

Es wurden Proben wie in Beispiel 1 hergestellt, nur daß an Stelle von "Bacterial Proteinase Novo" das Enzym

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ALCALASEv_yverwendet wurde. Die Behandlungsbedingungen wurden in diesem Falle ebenfalls auf 70⁰C, pH 7,0 und

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20 Minuten abgewandelt. Es wurde wiederum eine Vergleichsprobe ohne Enzym hergestellt.

Die Stickstoff-Löslichkeit der sprühgetrockneten Vergleichsprobe lag bei 22 %, während für die sprühgetrocknete enzymbehandelte Probe eine Stickstoff-Löslichkeit von 51 % gefunden wurde.

Die Dispergierbarkeit der beiden Proben wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise überprüft. Im Falle der Vergleichsprobe erschien eine untere Sedimentgrenze rasch nach 10 Minuten bei etwa 90 ml und blieb bei diesem Niveau konstant. Eine obere Grenzschicht von sedimentierendem Material sonderte sich langsam nach 30 Minuten bei 1700 ml und nach einer Stunde bei 1000 ml ab.

Bei der mit ALCALASE^behandelten Probe zeigte sich nach 10 Minuten ein wenig Sediment bei 20 ml, das nicht weiter zunahm. Eine obere Grenzschicht war selbst nach einer Stunde nicht erkennbar.

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Claims

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Patentansprüche

(V) Verfahren zur Behandlung von Mikroorganismenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Zellen enthaltende wässrige Suspension mit einem proteolytischen Enzym oder einem proteolytischen Enzympräparat unter Bildung eines Produktes mit verbesserter Dispergierbarkeit behandelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen nach Behandlung mit dem proteolytischen Enzym oder Enzympräparat getrocknet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenzellen Bakterienzellen, vorzugsweise von Stämmen der Spezies Pseudomonas methylotropha oder Pseudomonas rosea und insbesondere von den Stämmen NCIB 10508-15 und 10592 bis 10612 sind.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung Thit dem proteolytischen Enzym oder Enzympräparat bei einem pH im Bereich von 3,5 bis 10,0 vorgenommen wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da-

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durch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit dem proteolytischen Enzym oder Enzympräparat bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 90⁰C vorgenommen wird.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Suspension mit dem proteolytischen Enzym oder Enzympräparat für eine Zeitdauer von 5 bis 120 Minuten behandelt wird.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym oder Enzympräparat zu der wässrigen Suspension in einer ausreichenden Konzentration zugesetzt wird zur Erzielung

-5 -2 einer Enzymaktivität zwischen 5 x 10 und 5 x 10 Anson-Einheiten der proteolytischen Enzymaktivität pro g Einzellprotein in der Suspension.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich das proteolytische Enzym von einem Bakterium ableitet, das bei ΤβιηρβΓΒΐμΓβη über 50⁰C stabil ist.
9. Einzellproteine mit verbesserter Dispergierbarkeit, erhältlich nach einem der vorangehenden Ansprüche.

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