DE2643834B2

DE2643834B2 - Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein

Info

Publication number: DE2643834B2
Application number: DE2643834A
Authority: DE
Inventors: Donald Oliver Bartlesville Okla. Hitzman (V.St.A.)
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Current assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1975-09-30
Filing date: 1976-09-29
Publication date: 1978-03-23
Also published as: US3981774A; DE2643834A1; ES451936A1; FR2326469A1; SE7609517L; MY8100001A; NO763303L; DK438276A; GB1546691A; CA1069072A; DE2643834C3; IN144617B; BE846776A; NL7610783A; NL168880C; JPS5244294A; NO146331B; SU701545A3; NO146331C; NL168880B

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein durch eine Kultur von einem Mikroorganismus.

Zu den Anstrengungen für die Behebung der weltweiten Knappheit an Protein gehören verschiedene biosynthetische Verfahren, bei denen biologisch hergestelltes Einzellprotein durch das Wachstum einer Vielzahl von Mikroorganismen auf einer Vielzahl von kohlenstoffhaltigen Substraten erzeugt wird. Bei derartigen Verfahren sollten die Kohlenstoff- und Energiequellen, die als Substrate verwendet werden, in großem Umfang zur Verfügung stehen, relativ billig, gleichförmig und ungefährlich sein, so daß keine störenden Rückstände in dem als Endprodukt erhaltenen Protein vorhanden sind. Man hat schon Erdölkohlenwasserstoffe als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet, doch traten dabei in der Praxis Schwierigkeiten wegen der geringen Wasserlöslichkeit, des hohen Sauerstoffverbrauchs und der möglicherweise in den Erdölrohstoffen vorkommenden krebserregenden Stoffe auf.

Bei anderen Verfahren wurde von oxydierten Kohlenwasserstoffderivaten ausgegangen, die in Wasser löslich sind und sich infolgedessen leicht handhaben lassen, da die mikrobielle Umwandlung im wesentlichen in wäßrigem Medium stattfindet. Solche Ausgangsstoffe stehen leicht zur Verfügung, wobei als Rohstoffe Erdöl, Erdgas, verschiedene Verarbeitungen von Abfällen und Müll, die Umwandlung von Methan, die Vergärung von verschiedenen Getreidearten und die trockene Destillation von Holz in Betracht kommen. Unabhängig von der Rohstoffquelle stehen diese oxydierten Kohlenwasserstoffe in großen Mengen und bei relativ niedrigen Preisen zur Verfügung. Auf der Tatsache, daß diese Ausgangsstoffe bereits teilweise oxydiert sind, beruht es, daß ein wesentlich geringerer molekularer Sauerstoffbedarf bei der mikrowellen Umwandlung und Wachstum erforderlich ist. Ein anderer Faktor, der Schwierigkeiten bereitete und die praktische Verwendung der Verfahren zum Herstellen von Einzellproteinen einschränkte, bestand darin, daß diese Verfahren bei relativ niedrigen Temperaturen von etwa 20 bis 50⁰C, bevorzugt nicht oberhalb von 35° C durchgeführt werden mußten. Da die mikrobielle Umwandlung eine stark exotherme Oxydationsreaktion ist, bei der große Wärmemengen entstehen, ist es erforderlich, während der Umwandlung kontinuierlich und wirkungsvoll die Wärme abzuführen, weil sonst die Gefahr besteht, daß eine Überhitzung des Systems und eine Abtötung oder mindestens eine schwere Schädigung der Mikroorganismen eintritt, wodurch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erheblich reduziert wird.

Zahlreiche dieser mikrobiellen Verfahren haben sich auf die Verwendung von einer oder anderen Hefeart als Mikroorganismus konzentriert. Es stehen im allgemeinen viele Hefearten zur Verfügung, und die Hefezellen sind im allgemeinen etwas größer als die Bakterienzellen und lassen sich manchmal leichter von dem Gärungsmedium abtrennen.

Die Bakterien besitzen aber andere Vorzüge, da sie einen höheren Gehalt an Rohprotein und einen geringeren Gehalt an nichtproteinartigen Materialien in ihren Zellen enthalten. Die Bakterien haben deshalb in der Regel einen wesentlich höheren echten Proteingehalt und enthalten einen höheren Anteil an den für die Ernährung wichtigen schwefelhaltigen Aminosäuren und Lysin.

Es besteht deshalb ein Interesse für Gärungsverfahren mit Bakterien, die ein rasches Wachstum und hohe Produktivitätsraten bei relativ hohen Gärungstempera-

jo türen zeigen. Die Verwendung von hohen Gärungstemperaturen hat zur Folge, daß weniger Wärme entfernt werden muß, daß die Aufwendungen für Kühleinrichtungen geringer sind und daß auch geringere Mengen an Wärme für die Sterilisierung, Koagulation und

j> die Trennverfahren benötigt werden. Außerdem wird bei der Durchführung der Gärung bei höheren Temperaturen die Gefahr der Kontaminierung mit anderen Mikroorganismen stark verringert. Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, thermophile oder

•ίο thermotolerante Bakterien für die Herstellung von Einzellprotein zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein durch eine Kultur von thermophilen Bakterien in einem wäßrigen Medium unter Verwendung von mineralischen Nährstoffen, einem oxydierten Kohlenwasserstoff als Kohlenstoff- und Energiequelle und einer unter den Bedingungen der aeroben Gärung assimilierbaren Stickstoffquelle und durch Aufarbeiten der erhaltenen Mikroorganismen als Einzellprotein, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Bacillus NRRL B-8065 oder Bacillus NRRL B-8066 einsetzt.

Diese beiden thermophilen Bakterienarten gehören zur Gruppe Protophyta, Klasse Schizomycetes, Ordnung Eubacteriales, Familie Bacillaceae, Stamm Bacillus. Sie besitzen sehr vorteilhafte und nützliche Eigenschaften und vermehren sich bei höheren Temperaturen stärker als bei den üblichen Temperaturen.
Aus der DT-OS 24 18 385 ist ein Verfahren zur Her-

bo stellung eines proteinreichen Produktes durch Züchtung einer besonderen Pseudomonas-Art unter aeroben Bedingungen bekannt. Bei diesem Verfahren soll die Temperatur der Kultur im allgemeinen bei 30—50⁰C, bevorzugt 38—45⁰C liegen. Demgegenüber ermöglicht die erfindungsgemäße Verwendung von Bacillus NRRL B-8065 oder Bacillus NRRL B-8066 die Benutzung von Temperaturen bis zu 65°C bei der Herstellung von Einzellprotein. Dadurch werden eine Reihe von Vorzügen

erzielt, wie eine Erleichterung des Wärmeübergangs, eine weniger anspruchsvolle Temperaturkontrolle und eine geringere Kontaminierungsgefahr durch andere Mikroorganismen. Aus der Veröffentlichung von B. Snedecor und Charles L C ο ο η e y in Applied Microbiology (Juni 1974), S. 1112-1117, ist es bekannt, thermophile Bakterien zur Herstellung von Einzellprotein unter Benutzung von Methanol als Kohlenstoffquelle zu verwenden. Die dort verwendeten Bakterien waren in der Lage bei einer Methanolkonzentration von nur bis zu 1,2 Gramm/Liter zu wachsen, wogegen bei dieser Erfindung Methanolkonzentrationen bis zu 1,5% möglich sind. Außerdem erhält man bei der Erfindung ein Einzellprotein mit einem höheren Gehalt an den wesentlichen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin. Als oxydierte Kohlenwasserstoffe kommen für das Wachstum dieser Mikroorganismen insbesondere niedrige Alkohole, bevorzugt Methanol oder Äthanol, in Betracht. Das Wachstum dieser Mikroorganismen findet bei erhöhten Temperaturen statt, bei denen die bekannten Bazillusarten entweder relativ unproduktiv sind oder diese Temperaturen nicht vertragen oder bei diesen Temperaturen einen oxydierten Kohlenwasserstoff nicht vertragen oder unproduktiv sind. Es wurden je dreißig lyophilisierte Zubereitungen von jeder Bazillusart hinterlegt beim United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Region Research Laboratory, Peoria, Illinois 61 604. Dort sind diese Proben registriert worden und haben die bereits angegebene Kennzeichnung erhalten. Die

Bazillusart NRRL B-8065 entspricht der Züchtung 47 und die Bazillusart NRRL B-8066 der Züchtung 72. Diese Bazilluszüchtungen sind bei relativ hohen Gärungstemperaturen sehr produktiv und erzeugen wertvolle Einzellproteinprodukte mit einem hohen Proteingehalt und einer erwünschten Art und Verteilung der Aminosäuren. Diese hinsichtlich ihres Verhaltens bei hoher Temperatur einmaligen Bazillusarten ermöglichen die Herstellung von Einzellprotein mit höherer Raumzeitausbeute und geringerem Aufwand an Kühleinrichtungen. Unter den bereits genannten oxydierten Kohlenwasserstoffen ist als Kohlenstoff- und Energiesubstrat besonders Methanol oder ein im wesentlichen methanolhaltiges Substrat geeignet. Für die Herstellung von Einzellproteinen mit Hilfe dieser Bazillusarten sind mit Schaum gefüllte Gärungseinrichtungen von besonderem Interesse.

Die Kultur Nr. 72 NRRL ß-8066 ist ein grampositiver, sporenbildender Bazillus von enger, stabförmiger Erscheinung. In den Zellen sind keine farbigen Pigmente erkennbar.

Die Kultur Nr. 47 NRRL B-8065 ist ein grampositiver, sporenbildender Bazillus von dicker, stabförmiger Erscheinung. Auch bei dieser Bazillusart sind keine farbigen Pigmente in den Zellen erkennbar.

Die neu isolierten Mikroorganismen können durch die in der folgenden Tabelle angeführten Merkmale charakterisiert werden. Zum Vergleich sind in diese Tabelle auch die Eigenschaften von einigen bekannten Bazilluskulturen aufgenommen.

Bazillus-Kulturen	Kultur 47	Kultur 72	B. licheniformis	B. coagulans	B. subtilis	B. Stearo-
Kultureigenschaft	NRRL B-8065	NRRL B-8066	NRRL B-IOOl	NRRL B-1103	ATCC 10774	thermophilis ATCC 12987
od. Testergebnis	positiv	positiv	positiv	positiv	positiv	variabel
Gram-Färbung	ja	ja	ja	ja	ja	ja
Sporenbildung	ja	ja	ja	ja	ja	ja
Aerob	0,5 · 1-2,5	0,6 ■ 1 -5	0,6-0,8 · 1,5-3	0,6-2,5· 1-5	0,7-0,8 · 2-3	0,6-1 · 2-5
Ungef. Größe, μ	ja	ja	ja	ja	ja	ja
Bewegbarkeit	55	55	32-45	33-45	28-40	30
Opt. Temp., "C	60-65	60-65	50-56	55-60	50-55	50-55
Max. Τβιΐΐμ., "C	5-9	5-9	5,2-8,2	5-7	5-8,6	4,5-6,6
pH-Bereich	6,2-6,8	6,2-6,5	kW	kW	kW	kW
Opt. pH
(IM2-Medium)	nicht	nicht	nicht	Thiamin, Biotin	nicht	kW
Wachstumsfaktoren	erforderlich	erforderlich	erforderlich		erforderlich
	braun, H2O	gelb, H2O	kW	kW	kW	kW
Pigmente in	lösl, unlösl.	löst., unlösl.
IM2-Medium+1,5%	in org. Lösg.-	in org. Lösg.-
CHiOH	mittel	mittel
	Stäbchen bis	Stäbchen	Stäbchen,	Stäbchen,	Stäbchen,	Stäbchen,
Zellaussehen	lange Ketten		keine Ketten	keine Ketten	keine Ketten	manchmal
						fadenförmig
	rund erhaben,	rund erhaben,	kW	kW	kW	kW
Kulluraussehen im	leicht braun	mattweiß
IM2-Medium+1,5%
CH3OH
Wachstum bei 55°C auf	-	—	+	+	+	+
Nährlösung	+	+	+	+	-	+
Nährlösung
+ 1% CH3OH	+	+	-	-	-	-
1M2 + O,5% CHjOH	+	+	—	—	—	—
IM2+1,5% CHjOH	—	—	+	+	+	+
Glukose	+	+	—	_	-	-
CH3OH	+	+	_	_		_
CH3CH2OH

Fortsetzung

Kultureigenschaft
od. Testergebnis

Kultur 47
NRRL B-8065

Kultur 72 NRRL B-8066

B. licheniforrnis NRRL B-1001

B. coagulans
NRRL B-1103

B. subtilis
ATCC 10774

B. Slcarothermophilis
ATCC 12987

IM2 + 0,5% CHjOH
IM2+1,5% CHjOH
BHM

+ 0,1% NaCl
BHM+5% CH3OH
»Plate count«
+ 1,5% CH3OH

durchscheinend

»spreading

edges«

durchscheinend — glitzernd klein

+ = Erkennbares Wachstum durch Zunahme der Trübung der Ausgangsmischung.

- — Kein Wachstum erkennbar.

± = Sich selbst erhaltend, aber kein erkennbares zusätzliches Wachstum.

kW = Kein Wachstum auf diesem Medium.

Diese Vergleiche wurden so durchgeführt, daß man eine möglichst direkte Vergleichbarkeit der einzelnen Arten hat. Wie bei allen Mikroorganismen können aber bestimmte charakteristische Merkmale gewissen Änderungen in Abhängigkeit von dem Medium unter besonderen Bedingungen unterworfen sein.

Als Kohlenstoff- und Energiequelle oder Substrat für das Gärungsverfahren dient bei der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere wasserlösliche Verbindungen, die Kohlenstoff, Sauerstoff und Wasserstoff enthalten. Der Ausdruck »oxydierter Kohlenwasserstoff« umfaßt derartige Verbindungen im allgemeinen und stellt nicht eine Beschränkung des Substrats dar. Beispiele für geeignete oxydierte Kohlenwasserstoffe sind Alkohole, Ketone, Ester, Äther, Säuren und Aldehyde, die im wesentlichen wasserlöslich sind und deshalb bis zu etwa 10 Kohlenstoffatome im Molekül enthalten können.

Typische Verbindungen dieser Art sind Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, 1,7-Heptandiol, 2-Heptanol, 2-Methyl-4-pentanol, Pentansäure, 2-Methylbutansäure, 2-Pentanol, 2-Methyl-4-butanol, 2-Methyl-3-butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-1-propanol, 2-Methyl-2-propanol, 2-Propanol, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Formaldehyd, Acetaldehyd, Propanal, Butanal, 2-Methylpropanal, Buttersäure, 2-Methylpropionsäure, Pentansäure, Glutarsäure, Hexansäure, 2-Methylpentansäure, Heptandicarbonsäure, Heptansäure, 4-Heptanon, 2-Heptanon, Octansäure, 2-Äthylhexansäure, Glyzerin, Äthylenglycol, Propylenglycol, 2-Propanon, 2-Butanon, Diäthyläther, Methyläthyläther, Dimethyläther, Di-n-propyläther und n-Propylisopropyläther und Mischungen von zwei oder mehreren dieser Stoffe.

Eine bevorzugte Gruppe von solchen Kohlenstoff- und Energiequellen sind die wasserlöslichen aliphatisehen einwertigen Kohlenwasserstoffalkohole aufgrund ihrer Löslichkeit in Wasser, wobei besonders die niedrigen Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen im Molekül wegen ihrer leichten Zugänglichkeit bevorzugt sind. Unter diesen Alkoholen sind Äthynol und Methanol von besonderem Interesse, wobei Methanol wegen seines niedrigen Preises am meisten bevorzugt wird.

Es lassen sich auch Mischungen von beliebigen dieser oxydierten Kohlenwasserstoffe verwenden. So ist z. B. eine handelsübliche Mischung geeignet, die aus &5 Methanol und einem niedrigen Prozentsatz an höheren Alkoholen besteht (vgl. C. & E. N., 17. September 1973. Seite 231. Eine andere Kohlenstoff- und Energiequdle ist oxydiertes Erdgas, das Methan, Äthan und dergleichen enthält, wobei Mischungen entstehen, die vorwiegend die entsprechenden Alkohole und außerdem verschiedene Ketone, Aldehyde, Äther und Säuren enthält. In ähnlicher Weise können oxydierte Kohlenwasserstoff-Fraktionen aus verschiedenen Erdölquellen als Substrat verwendet werden.

Die Züchtung der neuen Bakterienarten kann auf dem oxydierten Kohlenwasserstoffsubstrat mit Vorteil in einem Temperaturbereich von 45 bis 65⁰C durchgeführt werden, wobei Temperaturen von 50 bis 6O⁰C bevorzugt und eine Temperatur von etwa 55°C ganz besonders bevorzugt sind.

Die Züchtung wird in einem Medium durchgeführt, das ein wäßriges Mineralsalz, die Kohlenstoff- und Energiequelle, molekularen Sauerstoff und die Impfung der besonderen Bakterienart enthält.

Hohe Konzentrationen von einigen der beschriebenen Kohlenstoff- und Energiesubstraten wie Methanol oder Formaldehyd können das Wachstum der Mikroorganismen behindern oder sogar toxisch gegenüber den neuen Mikroorganismen sein. Relativ hohe Konzentrationen dieser Substrate sollten deshalb vermieden werden, so daß es vorteilhaft ist, die Substratkonzentration in dem Gärungsmedium bei einem Niveau von etwa 0,01 bis 5 Vol./Vol.-%, bevorzugt etwa 0,01 bis 0,5 Vol./Vol.-% zu halten, so daß die Mikroorganismen weder abgetötet noch in ihrem Wachstum behindert werden.

Dem Gärungsmedium kann Sauerstoff in beliebiger, durch die Mikroorganismen assimilierbarer Form zugeführt werden. Es ist zwar möglich, für diesen Zweck Verbindungen zu benutzen, die molekularen Sauerstoif abgeben, doch ist dies aus wirtschaftlichen Gründen in der Regel nicht von Interesse. Man zieht es vielmehr vor, den molekularen Sauerstoff in Form eines Gases, das molekularen Sauerstoff enthält, zuzuführen, wobei üblicherweise Luft bei atmosphärischem oder erhöhtem Druck oder mit Sauerstoff angereicherte Luft verwendet wird. Wie bereits eingangs ausgeführt wurde, wird ein Teil des erforderlichen Sauerstoffs durch das oxydierte Kohlenwasserstoffsubstrat geliefert. Trotzdem müssen weitere Mengen an molekularem Sauerstoff für das Wachstum der Mikroorganismen zugeführt werden, da die Assimilation des Substrats und das entsprechende Wachstum der Mikroorganismen ein Verbrennungsvorgang ist. Üblicherweise werden zwischen 0,1 und 10 (bevorzugt zwischen 0,7 und 2,5) Volumina von Luft von normalem Sauerstoffgehalt pro

Komponente

Minute dem Reaktor pro Volumen Flüssigkeit in der Gäreinrichtung zugeführt. Auf Sauerstoff bezogen liegen diese Bereiche bei 0,02 bis 2,1 und 0,14 bis 0,55.

Der bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendete Druck kann innerhalb eines weiten Bereiches ^ schwanken und man kann Drücke von 0,1 bis 100 Atm., bevorzugt 1 bis 30 Atm., benutzen. Besonders bevorzugt sind gegenüber dem atmosphärischen Druck leicht erhöhte Drücke, weil dabei das Verhältnis der Anlagekosten in Relation zu der Steigerung der Löslichkeit von m Sauerstoff durch Druckerhöhung günstig liegt. Allgemein läßt sich sagen, daß höhere Drücke als atmosphärischer Druck vorteilhaft sind, weil dadurch die Konzentration des in dem wäßrigen Gärungsmedium gelösten Sauerstoffs erhöht wird, wodurch andererseits das Wachstum der Mikroorganismen gesteigert wird. Erhöhte Drücke werden außerdem auch deshalb bevorzugt, weil bei höheren Züchtungstemperaturen die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem wäßrigen Medium abnimmt. Die Durchführung der Züchtung in einem schaumförmigen Medium hat den Vorteil, daß der Sauerstofftransfer, der für höhere Zelldichten und ein schnelles Wachstum erforderlich ist, gefördert wird.

Die bei der Erfindung verwendeten neuen Bazillusarten erfordern außer dem Sauerstoff und einer Kohlenstoff- und Energiequelle mineralische Nährstoffe und eine assimilierbare Stickstoffverbindung. Die Stickstoffverbindung kann eine beliebige stickstoffhaltige Verbindung sein, die in der Lage ist Stickstoff in einer Form abzugeben, die für die Verwendung im Stoffwechsel der jo Bazilllen geeignet ist. Für diesen Zweck kann eine Vielzahl von organischen Stickstoffverbindungen wie Proleine, Harnstoff und dergleichen benutzt werden, doch werden in der Regel aus wirtschaftlichen Gründen anorganische Stickstoffverbindungen benutzt. Geeignete anorganische Stickstoffverbindungen sind beispielsweise Ammoniak, Ammoniumhydroxyd, verschiedene Ammoniumsalze wie Ammoniumeitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphyrophosphat oder verschiedene ähnliche Verbindungen. Es kann auch 40 Komponente

gasförmiges Ammoniak verwendet werden, das man in

kleinen Mengen durch das wäßrige Züchtungsmedium hindurchleitet.

Der pH-Wert des wäßrigen Züchtungsmediums sollte in der Regel im Bereich von etwa 5 bis 9, bevorzugt etwa 6 bis 8 und besonders bevorzugt etwa 6 bis 7,5 liegen. Die Bazillusart NRRL B-8065 gedeiht am besten im pH-Bereich von etwa 6,2 bis 6,8 und die Bazillusart NRRL B-8066 im pH-Bereich von etwa 6,2 bis 6,5, wobei diese Angaben besonders für das »IM2«-Medium gelten. Da die optimalen pH-Bereiche der Mikroorganismen in Abhängigkeit von dem verwendeten Medium bekanntlich schwanken, sind in dieser Beziehung bei Änderung des Mediums auch Änderungen des optimalen pH-Bereiches möglich.

Wenn die Kohlenstoff- und Energiequelle ein Aldehyd ist und dieser Aldehyd in dem Züchtungsmedium in für den Mikroorganismus schädlichen Mengen vorhanden ist, kann die schädliche Wirkung des Aldehyds dadurch verhindert werden, daß das Substrat mit einer bo geeigneten Menge einer stickstoffhaltigen Verbindung, insbesondere Ammoniak, Ammoniumhydroxyd oder einer anderen Ammoniumverbindung behandelt wird. Dabei werden in der Regel 0,01 bis 10 Moläquivalente der stickstoffhaltigen Verbindung für jedes Mol b5 Aldehyd verwendet. Ein derartig behandeltes Substrat ist dann nicht nur die Kohlenstoff- und Energiequelle, sondern enthält auch die Stickstoffquelle teilweise oder

vollständig.

Um ein gutes Wachstum der Mikroorganismei sicherzustellen und die Assimilation der oxydiertei Kohlenwasserstoffe durch die Zellen zu gewälirleister sind noch mineralische Nährstoffe in dem Mediun außer den bereits genannten Stoffen erforderlich.

Zu derartigen mineralischen Nährstoffen gehörei Phosphate oder andere Phosphorverbindungen um Verbindungen vom Magnesium, Calcium, Natrium Mangan, Molybdän und Kupfer, die bevorzugt ii ionischer Form vorliegen sollen. Die nachstehende Auf stellung kann dazu verwendet werden, um die neuei Bazillusarten zu züchten, obwohl diese auch auf anderei als methanolhaltigen Substraten wachsen.

Medium IM2 (fest)

Menge

KH2PO4	2,0 g
K2HPO4	3.0 g
MgSO4 ■ 7 H2O	0,4 g
CaCl2 ■ 2 H2O	0,04 g
NaCI	0,1 g
(NH4)2SO4	2,0 g
Agar-Agar	15 g
Lösung der mineralischen	0,5 ml
Spurenelemente")
Destilliertes Wasser	1000 ml
Steriles Methanol¹¹), um zu ergeben	1,5 Vol.-

^a) Vergleiche nachstehende Aufstellung.

^b) Unmittelbar vor der Verwendung zugegeben.

Für flüssige Medien wird der Agar-Agar weggelassen.

Lösung der mineralischen Spurenelemente

Menge

CuSO₄ · 5 H2O

KJ MnSCM · H2O

Na2MoO4 · 2 H2O

H3BO3 ZnSO₄ · 7 H2O

FeCb · 6 H2O

Destilliertes Wasser

H2SO4 0,06 g
0,08 g
0,3 g
0,2 g
0,02 g
2.0 g
4,8 g
1000 g
3 ml

Es können auch andere Stoffe zugegeben werden, wi< Hefeextrakte, Vitamine, Biotin und andere Wachstums faktoren oder Stoffe, die in Spurenmengen bei dei Züchtung von Mikroorganismen bekannt sind.

Das Verfahren nach der Erfindung kann kontinuier lieh und diskontinuierlich durchgeführt werden, wöbe die kontinuierliche Arbeitsweise insbesondere in einen mit einer schaumförmigen Masse gefüllten Reaktoi besonders bevorzugt ist. Für die Herstellung von großer Mengen an Einzelprotein besitzt die kontinuierliche Arbeitsweise eine ganze Reihe von Vorteilen.

Sowohl beim diskontinuierlichen als auch beim konti nuierlichen Verfahren wird die gesamte Ausrüstung ein schließlich Reaktor, Leitungssystem und Kühleinrich tungen sterilisiert, wozu üblicherweise Dampf, z. B. vor 121°C, für einige Minuten, wie etwa 15 Minuten, ver

wendet wird. Der sterilisierte Reaktor wird mit einer Kultur der Mikroorganismen in Gegenwart aller erforderlichen Nährstoffe, einschließlich von Sauerstoff und der oxydierten Kohlenwasserstoffquelle geimpft.

Bei der kontinuierlichen Durchführung des Verfahrens wird, sobald die Kultur zu wachsen beginnt, die kontinuierliche Einführung von Sauerstoff, des Nährstoffmediums, der Stickstoffquelle, falls sie getrennt zugegeben wird, und des oxydierten Nährstoffes wie des Alkohols aufrechterhalten. Die Zugabegeschwindigkeit der verschiedenen Ströme kann variiert weiden, so daß ein so schnelles Wachstum wie möglich unter wirksamer Verwendung des oxydierten Kohlenwasserstoffs und eine maximale Ausbeute an Zellgewicht pro Gewicht der Kohlenstoff- und Sauerstoffquelle erhalten wird, r, Die Zuführungsgeschwindigkeii der Kohlenstoff- und Energiequelle sollte so eingestellt werden, daß die dem Gärungsgefäß zugeführten Mengen etwa gleich mit dem Verbrauch durch den Mikroorganismus sind. Dadurch wird eine Überfütterung der Mikroorganismen, insbesondere mit toxischen Materialien wie Alkoholen oder Aldehyden, die das Wachstum der Mikroorganismen inhibieren oder sie sogar töten können, vermieden. Befriedigende Betriebsbedingungen erkennt man in der Regel daran, daß in dem Abgang aus dem 2> Gärungsgefäß wenig oder keine Kohlenstoff- und Energiequelle vorhanden ist, obwohl man eine befriedigende Überprüfung auch dadurch erreichen kann, daß man den Gehalt an der Kohlenstoff- und Energiequelle in dem Abgang aus dem Gärungsgefäß überwacht und ihn bei jo einem gewünschten niedrigen Niveau, wie z. B. 0,1 bis 0,5 Vol./Vol.-°/o hak. Die Ströme der Ausgangsstoffe können selbstverständlich entweder anteilsweise oder kontinuierlich nach den jeweils gewünschten Bedingungen zugeführt werden.

Bei der Gärung sollten die erforderlichen Einrichtungen vorhanden sein, um die Zelldichte, pH, Gehalt an gelöstem Sauerstoff, Konzentration an Alkohol oder anderer Nährstoffquelle in dem Gärungsgefäß, Temperatur, Zuführungsgeschwindigkeit der Ausgangsstoffe ad und Endprodukte und dergleichen zu messen. Die dem Gärungsgefäß zugeführten Materialien werden bevorzugt vor ihrer Einführung sterilisiert. Wenn der sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoffnährstoff ein Material ist, das in der Lage ist andere Materialien zu sterilisieren, wie in manchen Fällen Methanol, Äthanol oder Formaldehyd, kann es vorteilhaft sein, diesen Ausgangsstoff anderen Strömen, wie den mineralischen Medien, in sterilisierenden Mengen zuzusetzen, um dadurch gleichzeitig mehrere Zielsetzungen zu er- μ reichen und die Sterilisierung der mineralischen Medien durch andere Maßnahmen, wie durch Erwärmen, zu vermeiden.

Die Art des verwendeten Gärungsgefäßes ist nicht wesentlich bei dieser Erfindung, obwohl bevorzugt ein Gärungsgefäß mit dem Gärungsmedium in Schaumform verwendet wird. Dadurch wird eine hohe Produktivität der reinen Kulturen mit den erfindungsgemäßen thermophilen Bazillusarten unter Verwendung eines oxydierten Kohlenwasserstoffes in bo einem kontinuierlichen Verfahren erzielt. Die reinen Kulturen haben bei den empfohlenen Gärungstemperaturen eine hohe Wachstumsrate und ergeben beständige Schaumsysteme. Es ist selbstverständlich erforderlich, die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen zu kontrollieren, um ein überschäumen des Gärur.gsgefäßes zu vermeiden, wodurch das Flüssigkeitsvolumen erniedrigt werden könnte und gewisse Ver luste auftreten könnten. Wenn nur möglich sollte die Zugabe von Antischaummitteln vermieden werden, da die Antischaummittel, wie z. B. die Silikone, den Gehalt an gelöstem Sauerstoff bei den empfohlenen hohen Temperaturen herabsetzen könnten und die Wachstumsgeschwindigkeit und die Produktivität der Mikroorganismen erniedrigen könnten oder sogar die Mikroorganismen abtöten könnten. Der mit den erfindungsgemäßen Bazillusarten erzeugte Schaum beeinträchtigt das Wachstum nicht und ist vorteilhaft für die Aufrechterhaltung der Mikroorganismen in einem System mit einem hohen Gehalt an gelöstem Sauerstoff. Für die Durchführung der Erfindung ist deshalb die Verwendung eines Gärungsgefäßes für die Gärung in Schaumform von Vorteil, weil dadurch der erhöhte Sauerstofftransfer erleichtert wird, der erforderlich ist, um eine hohe Zelldichte und ein schnelles Wachstum mit diesen thermophilen Mikroorganismen zu erreichen. Auf diese Weise wird das Einzellprotein mit den thermophilen Bazillusarten gemäß der Erfindung in Schäumform in wirksamster Weise hergestellt.

Die Durchführung der Gämng in einem mit Schaum gefüllten Gefäß ist besonders dann vorteilhaft, wenn große Gasmengen in engem Kontakt mit der flüssigen Phase gehalten werden sollen, so daß eine Umsetzung an relativ großen Grenzflächen stattfinden kann. Dadurch wird nicht nur d^;e Gärung als solche, sondern auch der Wärmeübergang verbessert und durch die gleichförmige Temperatur wird das Auftreten von überhitzten Stellen vermieden.

Zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung wird z. Zt. ein Gärungsgefäß bevorzugt, daß in F i g. 1 von Seite 37 der Zeitschrift »Process Biochemistry, June, 1972« gezeigt wird. Diesem Gefäß kann eine Leitung zum Einführen von einem Gas, das molekularen Sauerstoff enthält, hinzugefügt werden. Die Einführung dieses Gases kann an einem beliebigen geeigneten Punkt erfolgen, doch ist das Saugrohr gerade oberhalb der Mischeinrichtung bevorzugt, da die Saugwirkung der Mischeinrichtung dann mit Vorteil dazu verwendet werden kann, um die Einführung des sauerstoffhaltigen Gases in den Inhalt des Gefäßes zu unterstützen. Dieses Gärungsgefäß läßt sich mit hoher Wirksamkeit dazu verwenden, um seinen Inhalt im wesentlichen vollständig in Schaum oder eine Emulsion von niedriger Dichte umzuwandeln, wodurch eine hohe Geschwindigkeit des Sauerstoffüberganges erreicht wird.

Eine andere Art eines geeigneten Gärungsgefäßes ist der sogenannte »Airlift«-Vergärer, der in einem Aufsatz von Wang et al. in der Zeitschrift »Proceedings Eighth World Petroleum Congress«, Band 5, Seiten 149—156 (1971), veröffentlicht von Applied Science Publishers Ltd., London, England, beschrieben ist.

Ein weiteres geeignetes Gärungsgefäß ist ein Druckzyklus-Vergärer, wie er auf Seite 63 der Zeitschrift »Chemical Engineering«, 7. Januar 1974, beschrieben ist.

Schließlich ist noch der gut bekannte Vergärer geeignet, der einen Behälter mit einem Blattrührer und eine submerse Belüftungseinrichtung besitzt. Ein Vergärer dieser Art ist in der US-PS 29 83 652 beschrieben.

Sowohl die zellulären als auch die extrazellulären Produkte der Kultur der neuen Bazillusarten können bei dem Verfahren nach der Erfindung in üblicher Weise aufgearbeitet werden, Man kann die Zellen aus dem Abgang aus dem Gärungsgefäß durch Zentrifugieren, Filtrieren und ähnliche Maßnahmen abtrennen. Der zellfreie Abgang kann mit Aceton oder einem niedrigen Alkohol wie Methanol oder Äthanol behandelt werden,

um etwa vorhandene extrazelluläre polymere Materialien auszufällen. Der zellfreie Abgang kann auch einer Lösungsmittelextraktion und/oder einer Basenextraktion unterworfen werden, um etwa gewünschte extrazelluläre Produkte wie Pigmente, Vitamine oder organische Säuren, die während der Gärung entstanden sind, zu gewinnen. Die mikrobiellen Zellen werden in der Regel durch Erwärmen oder durch chemische Mittel abgetötet und dieses kann vor oder nach der Abtrennung der Zellen aus dem Abgang des Gärungsgefäßes erfolgen. Die Bakterienzellen sind eine wertvolle Eiweißquelle für Menschen und Tiere. Für die menschliche Nahrung können die Zellen behandelt werden, um den Gehalt an Nukleinsäuren herabzusetzen, wogegen eine derartige Behandlung für Viehfutter nicht erforderlich zu sein scheint.

Beispiel I

Dieses Beispiel enthält zuerst einige Vergleichsversuche und dann ein Beispiel für die Durchführung der Erfindung.

Es wurden einige Kulturen von bekannten thermophilen Mikroorganismen aus zwei Hinterlegungsstellen besorgt. Bei diesen Hinterlegungsstellen handelt es sich um The United States Department of Agriculture, Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, USA and The American Type Culture Collection ATCC, Washington, D. G, USA. Diese Kulturen wurden in lyophilisiertem Zustand erhalten. Die Kulturen wurden auf ihr Wachstum bei 55°C in einer Vielzahl von verschiedenen Medien geprüft. Die Ergebnisse diese· Prüfungen sind in Tabelle 1 angegeben. Es wurden die folgenden Kulturen benutzt:

Medium IM2 ist das bereits beschriebene Medium mit der Ausnahme, daß es kein Agar-Agar enthält, da diese Versuche im flüssigen Medium durchgeführt wurden. NRRL Bl 102 wuchs auch auf der Nährlösung nicht.

ATCC 10744 wuchs in Gegenwart von Methanol nicht (Medium 2). Obwohl die anderen Kulturen in Gegenwart von Methanol wuchsen, waren sie offensichtlich nicht in der Lage, Methanol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle für ihr Wachstum zu verwenden. Wie der nachstehend angeführte Versuch nach der Erfindung zeigen wird, stehen diese negativen Ergebnisse in scharfem Gegensatz zu den Ergebnissen mit den besonderen Bazillusarten gemäß der Erfindung, die in der Lage waren, Methanol in wirksamer Weise als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu benutzen.

Zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung wurde eine Impfung von 500 ml einer wäßrigen Dispersion von Zellen der Kultur Nr. 72, NRRL B-8066 verwendet, die 24 Stunden auf dem Medium BH-M mit 1,5 Vol.-% Methanol gewachsen war. Die Zusammensetzung dieses Mediums war wie folgt:

Medium BH-M

-"' Komponente

Menge

KH₂PCm	2,0 g/l
K2HPO1	3,0 g/l
MgSG-4 ■ 7 H2O	0,4 G/l
CaCb ■ 2 H2O	0,04 g/l
(NH4)2SO4	2 g/l
Lösung der Spurenmineralien*)	10 ml/l

*) Die Lösung der Spurenmineralien hatte folgende Zu-Π sammensetzung:

Bacillus subtilis
Bacillus stearothermophilis
Bacillus stearothermophilis
Bacillus coagulans
Barillus coagulans
Bacillus licheniformis

Hinterlegungs-Nr.

ATCC 10774
ATCC 12987
NRRL B1102
NRRL BI103
NRRL Bl 168
NRRLBlOOl

Komponente

Menge

FeSO4 · 7 H2O
ZnSOi · 7 H2O
CuSO₄ · 5 H2O
MnSO₄ · H2O
H2SO4 (konz.)

0,11 g/l
0,03 g/l
0,02 g/l
0,02 g/l
1 ml/l

Tabelle I

Kultur Nr. Wachstum + oder - im Medium Nr.

1") 2^b) 3^C) 4'¹) 5^L)

NRRL
NRRL
ATCC
NRRL
NRRL
ATCC

BIOOl
Bl 103
12987
Bl 168
Bl 102
10774

Nährstofflösung (NL).

NL+10/0 Methanol. ή NL (1/2 Stärke)+1% Methanol.
^ll) NL (I/4 Stärke)+ t'Vb Methanol.
") ΙΜ2 Medium+ 0,5% Methanol.

Die charakterisierte Impfung wurde einem Gärungsgefäß zugeführt. Das Gärungsgefäß besaß Einrichtungen zum Rühren und zur Belüftung und enthielt zwei Liter eines mit Leitungswasser hergestellten Mediums folgender Zusammensetzung:

Die bei diesen Versuchen verwendete Nährstofflösung ist ein übliches Kulturmedium, das 3 g/Liter Rindfleischextrakt und 5 g/Liter Pepton enthüll. Das

FM-12-Medium

Komponente

Menge

H3PCM (85%)	2,0 ml
KCI	1,0 g
MgSCM · 7 H2O	1,5 g
CaCl2 · 2 H2O	0,2 g
NaCl	0,1 g
Lösung der Spurenmineralien*)	10,0 ml
Destilliertes Wasser	zum Auffüllen
	auf I Liter

*) Diese Lösung der Spurenmineralien hatte folgende Zusammensetzung:

Komponente

Menge

CuSO« ■ 5 H2O

FeCh · 6 H2O

MnSOi · H2O

Na2MoO4 · 2 H2O

ZnSO« ■ 7 H2O

H2SO1 (konz.)

Destilliertes Wasser

0,06

0,08

4.80

0,30 '

0,20

2,00

0.02

3 ml

zum Auffüllen

auf I Liter ^l(l

Komponente

Menge

K.H2PO4 2,0 g/l

K.2HPO4 3,0 g/l

MgSO4 · 7 H2O 0,4 g/l

CaCb ■ 2 H2O 0,04 g/l

NaCI 0,1 g/l

(NH4)2SO4 2,0 g/l

Lösung der Spurenmineralien*) 0,5 ml/l

*) Die Lösung der Spurenminoralien hatte folgende Zusammensetzung für einen Liter wäßrige Lösung:

b0

b5 Komponente

Menge

- 5 H2O

FeCb · 6 H2O

MnSOi ■ H2O

Na2MoO4 · 2 H2O

ZnSO4 ■ 7 H2O

HjBOs

H2SO4 (konz.)

0,06 g
0,08 g
4,80 g
0,30 g
OiOg
2,00 g
0,02 g
3 ml

Der Methanolgehalt lag zu Beginn bei 1,5% (V/V), das pH bei 6,7 und die Temperatur bei etwa 55°C. Die Rührgeschwindigkeit betrug etwa 1000 UpM und Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 Litern pro Minute eingeführt. Es wurde Ammoniumhydroxyd kontinuierlich zugegeben, um den pH-Wert im Bereich von etwa 6,7 bis 6,9 zu halten und um auch gleichzeitig eine Stickstoffquelle zur Verfugung zu stellen.

Nachdem ein gutes Wachstum der Impfung festgestellt worden war, wurde die kontinuierliche Zugabe eines Nährmediums mit einem Methanolgehalt von 5 Vol.-% aufgenommen und eine entsprechende Menge an Abgang wurde aus dem Gärungsgefäß abgezogen. Die Zuführungsrate der Nährstoffmischung schwankte 2-3 zwischen 150 und 800 ml/h im Verlauf des Versuches von etwa 500 Stunden. Die mittlere Verweilzeit der Zellen in dem Gärungsgefäß schwankte zwischen 2,4 und 5 Stunden. Aus dem Abgang aus dem Gärungsgefäß wurden von Zeit zu Zeit Proben entnommen, aus denen die Zellen abgetrennt, getrocknet, gewogen und einer Proteinanalyse unterworfen wurden. In diesen Proben aus dem Abgang wurden nur die Zellen aufgearbeitet, nicht jedoch die gelösten Bestandteile. Die Werte für die Zellkonzentration lagen bei etwa 12 g/l (trockene jj Zellen) im ersten Teii des Versuches (25 Stunden) bis 18 g/l bei 190 Stunden und etwa 24 g/l gegen das Ende des Versuches. Die Methanolumwandlung zu isolierbaren Zellen lag bei 44% des Einsatzes. Der Proteingehalt der Zellproben, die während des Versuches entnommen wurden, ist schon bei der vorstehenden Diskussion der Produktaufarbeitung behandelt worden.

Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die neue Bazillusart NRRL B-8066 kontinuierlich bei 55°C mit Methanol als Energie- und Kohlenstoffquelle kultiviert werden konnte. Außerdem wurde bereits vorher gezeigt, daß diese Bazillusart einen hohen Proteingehalt hat.

Beispiel 2

Es wurde ein weiterer Versueh unter Verwendung der Kultur NRRL B-8066 von Beispiel 1 durchgeführt. Bei diesem Versuch wurde das Gärgefäß mit 500 ml einer wäßrigen Dispersion der Kultur geimpft, die 26 Stunden auf dem 1M2-Medium plus 1,5 Volt.-% Methanol gewäwachen war.

IM2-Medium

Diese Impfung wurde in ein Gärgefäß der gleichen Art wie das von Beispiel 1 eingebracht. Das Gärgefäß enthielt 2 Liter des gleichen Mediums FM-12, wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß nur 5 ml pro Liter der vorstehenden Lösung der Spurenmineralien zu dem Medium zugegeben wurden.

Der Methanolgehalt war zu Beginn auf 1,5% (V/V) beschränkt, der pH-Wert lag bei etwa 7,1 und die Temperatur bei etwa 53°C. Während der ersten beiden Stunden wurde das Rühren und das eingeführte Luftvolumen langsam erhöht auf 800 UpM und 2 Liter pro Minute. Es wurde Ammoniumhydroxyd wie im Beispiel 1 zugegeben, um den pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,2 zu halten und gleichzeitig eine Stickstoffquelle zur Verfugung zu stellen.

Nachdem ein gutes Wachstum der Impfung in den ersten 24 Stunden beobachtet worden war, wurde die kontinuierliche Zugabe des Nährmediums mit einem Methanolgehalt von 7,5 Vol.-% und einem Gehalt an 0,05 g/l MnSO<f ■ H2O aufgenommen und ein entsprechendes Volumen wurde als Abgang aus dem Gärungsgefäß abgezogen. Die Zuführungsgeschwindigkeit für die Mischung des Nährstoffmediums betrug etwa 200 bis 400 ml/h während einer Versuchszeit von etwa 94 Stunden. Die mittlere Verweilzeit in dem Gärungsgefäß betrug etwa 3 bis 5 Stunden. Aus dem Abgang wurden von Zeit zu Zeit Proben entnommen, aus denen die Zellen isoliert, getrocknet und gewogen wurden. Die Proben aus dem Abgang wurden nur auf ihren Zellgehalt und nicht auf den Gehalt an löslichen Bestandteilen analysiert. Die Zellkonzentrationen lagen nach 24 Stunden zwischen 17 und 26 g/I (trockene Zellen). Die Methanolumwandlung in isolierbare Zellen betrug 43% des Einsatzes.

Auch diese Ergebnisse demonstrieren, daß mit der neuen Bazillusart eine gute Ausbeute an mikrowellen Zellen bei Verwendung von Methanol als einziger Quelle für Energie und Kohlenstoff und bei hohen Gärungstemperaturen erhalten wird.

Beispiel 3

Es wurde ein kontinuierlicher Gärungsversuch mit der Kultur 47 NRRL B-8065 durchgeführt.

Es wurde das gleiche Gärungsgefäß wie in den vorherigen Beispielen verwendet. Das Gärungsgefäß enthielt 2 Liter des FM-12-Mediums wie in Beispiel 2, doch wurde dieses Medium in diesem Fall mit entionisiertem Wasser angesetzt. Es wurden 500 ml einer wäßrigen Dispersion der Kultur 47 NRRL B-8065, die 11 Stunden auf dem gleichen IM2-Medium wie in Beispiel 2 mit 1,5 Vol.-% Methanol gewachsen waren, in das Gärungsgefäß eingeführt.

Der Methanolgehalt lag zu Beginn bei 1,5% (V/V), der pH-Wert zu Beginn bei etwa 6,45 und die Temperatur wurde bei etwa 54°C gehalten. Wie in den Beispielen 1 und 2 wurde Ammoniumhydroxyd zugegeben, um den pH-Wert bei etwa 6,3 bis 6,6 zu halten, wobei auch in

diesem Fall das Ammmoniumhydroxyd gleichzeitig die Stickstoffquelle war. Die Rührgeschwindigkeit und die Zuführgeschwindigkeit der Luft wurden allmählich bis auf 400 UpM und 0,5 I. her pro Minute im Verlauf von etwa 7 Stunden erhöht. Nach etwa 11 Stunden wurde die kontinuierliche Zugabe des mit Leitungswasser hergestellten Nährmediums FM-12, das 2,5 Vol.-°/o Methanol und zusätzlich 1 g/l KH2PO4, 1 g/l K2HPO4 und eine kleine Menge von Antischaummittel enthielt, aufgenommen. Nach 28 Stunden wurde die Ausgangslösung modifiziert, indem weiteres MnSC«4 - H2O zugegeben wurde, um seine Konzentration zu verdoppeln. Diese Änderung scheint in einem gewissen Umfang die Aufnahme von Sauerstoff durch die Zellen zu stimulieren. Die neuen Bazillusarten gemäß der Erfindung scheinen einen relativ hohen Bedarf an Mn ⁺ + für ein optimales Wachstum zu haben.

Während des Verlaufs von 101,5 Stunden wurden weitere Mengen an anderen Spurenmineralien zugegeben, doch schienen diese keinen stimulierenden Effekt auf das Zellwachstum zu haben. Außer Luft wurde dem Gärungsgefäß nach 28 Stunden Sauerstoff mit einer zunehmenden Geschwindigkeit von 0,12 bis 0,4 Liter pro Minute zugeführt. Die Rührgeschwindigkeit wurde entsprechend von 400 auf 800 UpM während dieses Zeitraumes erhöht. Aus dem Abgang wurden von Zeit zu Zeit Zellen entnommen, getrocknet und gewogen.

Die Ausgangsstoffe wurden dem Medium mit einer Geschwindigkeit von 300 ml/h bei 28 Stunden bis 850 ml/h bei 71 Stunden und 1070 ml/h bei 95 Stunden zugeführt. Die Verweilzeiten für die Zellen schwankten zwischen etwa 1,8 und 2,5 Stunden während der letzten 30 Stunden. Die Zellkonzentrationen schwankten zwischen etwa 7 und 10 g pro Liter (trockene Zellen) und die Methanolumwandlung in isolierbare Zellen betrug etwa 50% des Einsatzes.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Kultur Nr. 47 NRRL B-8065 ebenfalls mikrobielle Zellen in guter Ausbeute ergibt, wenn diese auf Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle bei relativ hohen Gärungstemperaturen wachsen.

Beispiel 4

Der Rohproteingehalt der Zellen der neuen Bazillusarten gemäß der Erfindung liegt im Bereich von etwa 70 bis 85 Gew.-%. Man erhält den Rohproteingehalt, indem man die Gew.-% N (nach K j e I d a h 1) der ge-

trockneten Zellen mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Die Hydrolyse der getrockneten Zellen mit anschließender Analyse der Aminosäuren durch Gas-Chromatographie zeigt, daß der Proteingehalt im Bereich von etwa 55 bis 70 Gew.-% liegt. Die Verteilung der Aminosäuren für eine Probe der Bakterienzellen der Kultur Nr. 72 NRRL B-8066 wird nachstehend gezeigt:

Wesentliche Aminosäure	g/100 g getrocknete Zellen
Leucin	5,52
Isoleucin	4,68
Lysin	5,36
Methionin	1,38
Cystin	0,05
Threonin	2,93
Phenylalanin	2,72
Tyrosin	2,00
Tryptophan	0,79
Valin	5,25
Nicht wesentliche Aminosäure	g/100 g getrocknete
	Zellen

Alanin	5,83
Arginin	2,93
Asparaginsäure	6,38
30 Glycin	3,76
Glutaminsäure	9,95
Histidin	1,18
Prolin	2,37
Serin	1,96
JO Summe	64,04
Summe wesentlicher	30,68
Aminosäuren

Aus dieser Aufstellung geht hervor, daß der Gehalt an schwefelhaltigen Aminosäuren, z. B. Cystin und Methionin, relativ niedrig ist. Einige Proben der Zellen von dieser Bazillusart haben einen Gehalt von 0,00 g Cystin pro 100 g getrocknete Zellen gezeigt. Diese Erscheinung ist für Einzellproteine nicht ungewöhnlich und lcann dadurch ausgeglichen werden, daß geeignete Mengen an synthetisch hergestelltem Cystin oder Methionin dem Einzellprotein zugefügt werden.

809 512/481

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von Einzellprotein durch eine Kultur von thermophilen Bakterien in einem wäßrigen Medium unter Verwendung von mineralischen Nährstoffen, einem oxydierten Kohlenwasserstoff als Kohlenstoff- und Energiequelle und einer unter den Bedingungen der aeroben Gärung assimilierbaren Stickstoffquelle und durch Aufarbeiten der erhaltenen Mikroorganismen als Einzellprotein, dadurchgekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus NRRL B-8065 oder Bacillus NRRL B-8066 einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur des Bacillus bei einer Gärungstemperatur im Bereich von 45 bis 65⁰C durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur im Bereich von 50 bis 60⁰C liegt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mit einer Manganverbindung während des Wachstums des Bacillus behandelt wird.