DE2754072C2 - Herstellung von Einzellprotein - Google Patents

Description

(1) große grampositive gekrümmte Stäbchen, Gruppe Bacteria, Klasse Schlzomycetes, Ordnung Eubacteriales, Gattung Bacillus;

(2) große gramnegative Stäbchen der gleichen Gattung und

(3) kurze gramnegative Stäbchen, Gruppe Bacteria, Klasse Schlzomycetes.

Diese gemischte thermophile Bakterienkultur (Kurzbezeichnung: »M_r«) besitzt zahlreiche vorteilhafte Eigenschaften. Sie zeigt ein höheres Wachstum bei höheren Temperaturen gegenüber den üblichen Temperaturen und ergibt bei geringerer Neigung zum Schäumen höhere Zellausbeuten.

Diese gemischte Kultur ist thermophll, zeigt eine höhere Produktivität auf oxidierten Kohlenwasserstoffen, Insbesondere niederen Alkoholen, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, wobei diese Ergebnisse bei Temperaturen erhalten werden, bei denen a># anderen bekannten Bakterienarten entweder relativ unproduktiv sind oder Oberhaupt nicht Oberleben können oder unproduktiv oder unverträglich mit einem Nährboden auf Basis von oxl dlerten Kohlenwasserstoffen sind.

Diese gemischte Kultur wird wie folgt bezeichnet:

Name
der Kultur

Bezeichnung
des Stamms

Hinierlegungsbezeichnung

H.TB-53

NRRL B-81S8

Die Bezeichnung NRRL B-8158 drückt aus, daß die gemischte thermophile Kultur beim United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, North Central Region, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peorla, Illinois 61604, U.S.A., hinterlegt worden Ist und die Bezeichnung NRRL B-8158 erhalten hat.

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, IXe bef der Erflnrtung^erwendettfgen^gcfiteBakie^en ^utllc^e Voheije'gegenöberder^firwendung 'on j'plnen thennopjiHen' BaJcteriegkuHuren, fOr^dfe YersSruiig von Methapbl ode^ ähnl(c}jen Koih|ensiofF_r und ineiBlequellen. Zupäfchst^^tyes γοη -Vortell, daß ,eine löheTfrZellau^ute'jjei-XeriraicIung^dergenifschteii ΚμΙ-ur erhalten wftd. Die Zellausbeute wird^Kief deflnTert als He Menge der Zellen In Gramm, die auf 100 Gramm der rerwendeten KohfenstpfT- und Energiequelle, wie^Metha-ιοί, erzeugt wjFd/sDte höhere Zellausbeute Ist .von ganz n-heblicher wirtschaftlicher Bedeutung.

Ein anderer Vorteil, cter gemischten Kultur im Ver- ;lelch zu einem reinen fcsrmophllen Bakterium ist in der Tatsache zu sehen, daß die Schaumentwicklung bei der ;emlschten Kultur wesentlich niedriger Ist als bei reinen CuItüren. Reine Kulturen neigen Im allgemeinen dazu, ;roße Mengen an Schaum während des Gärungsverfahens zu bilden. Die Schaumbildung kann zwar bei >estimmten Apparaten vorteilhaft sein, km bei dem järungsverfahren die Wärmeabführung zu erleichtern >der die erforderlichen Mengen an molekularem Sauer- !toff fur ein aerobes Gärungsverfahren zur Verfügung zu !teilen, doch sind zahlreiche Gäreinrichtungen so geplant ind gebaut, daß sie große,Mengen an Schaum, wie er bei Verwendung von reinen Stämmen von MIk- .»Organismen luftritt, nicht bewältigen können. Di-. geringe Schaumnenge, die mit der gemischten Kultur naci; der Erfinlung auftritt, Ist deshalb ein deutlicher Vorteil.

Ein anderer Vorteil der gemischten Kultur Ist In der Tatsache zu sehen, daß man zwangsläufig ein Einzellproein erhält, das eine Mischung von verschiedenen ZeI I aren 1st. Die Verteilung der Aminosäuren In dem Isolieren Einzellprotein Ist deshalb vorteilhafter als bei Vervendung einer einzigen reinen Kultur. Eine bessere Verellung der Aminosäuren bedeutet aber, daß die Wahricheinlichkelt des Fehlens einer besonders essentiellen \mlnosäure geringer ist.

Die gemischte thermophiie Kultur wurde gefunden bei Unlersuchungen, die die Entdeckung und Entwicklung slner Vielzahl von Kulturen für mlkroblelle Umwandlungen zum Gegenstand hat. Es wurde eine Bodenprobe 51 cm unter der Erdoberfläche oberhalb einer Dampftet' tung In Bartlesvllle, Oklahoma, U.S.A. genommen. Zur Isolierung von einigen getrennten oder bestimmten KuI-türen wurden übliche Anreicherungsarbeitsweisen in Gegenwart von Methanol angewandt. Während dieser Arbeiten, bet denen einige reine thermophiie Kulturen sollcrt wurden, wurde festgestellt, daß eine gemischte Kultur von thermophilen Organismen von ungewöhnlleher Beständigkeit In der Zusammensetzung gefunden worden war.

Die gemischte thermophiie Kultur setzt sich aus drei verschiedenen Mikroorganismen zusammen. Die drei Baklerlentypen in der in ihrer Zusammensetzung beständlgen gemischten thermophilen Kultur sind 1. große grampositive gekrümmte Stäbehen, 2. große gramnegative Stäbchen und 3. kurze gramnegative Stäbchen.

Es- wurden verschiedene Versuche unternommen, um aus dieser gemischten Kultur die reinen Mlkroorganlsmen zu Isolieren. So gaben z. B. Strichkulturen isolierte gpj?
weüj&keln
artfge; Versuchedaß e\tuttq\p„fi

anQJ_ea|s Kphjenstpffv und,Enerdep go" jfpnfite übenrascJiender> iet werden, Derwiederholt durchgeführt, ohne.

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^r dient. Die genaue !«iatur^lieser Sjronwecfiselprodukt&ilst

z. Z_ nicht betfannt^Es' scheint jedoch moglichizu'setn, daß ein öerartlges StofFwechselprodukt for den Mtkroorganismus,, der es erzeugt* toxisch Ist, wodurch sich" die Notwendigkeit fandie Gegenwart eines weiteren MikroOrganismus ergibt, um das toxische Stoffwechselprodukt zu verbrauchen, so daß der erste Mikroorganismus sein Wachstum ungestört fortsetzen kann.

Ein weiterer Hinweis für eine symbiotische Beziehung ist in der Tatsache zu sehen, daß Garungen, bei denen die gemischte thermophiie Bakterienkultur verwendet wird, wesentlich weniger Schaum unter typischen aeroben Gärungsbedlngungeit bilden im Vergleich zu den Schaummengen, die normalpsweise unter äquivalenten typischen aeroben Gärungsbedingungen bei Verwendung von reinen thermophilen Bakterien von der Gattung Bacillus. Dies deutet an, daß die gemischte thermophiie Bakterienkultur die erwarteten großen Schaummengen deshalb nicht erzeugt, weil ein extrazelluläres Produkt, das wahrscheinlich eiweißartig ist, von mindestens einem der symbiotischen Mikroorganismen verbraucht wird, wodurch die Gärungsmischung kontinuierlich von diesem schaumbildenden Material befreit wird.

Bei der Erfindung Ist die Kohlenstoff- und Energiequelle bzw. das Substrat ein oxidierter Kohlenwasserstoff. Beispiele für solche oxidierten Kohlenwasserstoffe sind

*o Alkohole, Ketone, Ester, Äther, Säuren und Aldehyde, die im wesentlichen wasserlöslich sind und bevorzugt bis zu 10 Kohlenstoffatome im Molekül enthalten.

T/plsche Beispiele für solche Verbindungen sind: Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexa-

*S nol, 1,7-HeplaHdlol, 2-Heptanol, 2-Methyl-4-Pentanol, Pentansäure, 2-Methylbutansäure, 2-Pentanol, 2-MethyI-4-Butanol, i-Methyl-3-Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-l-Propanol, 2-MethyI-2-Propanol, 2-Propanol, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Formaldehyd, Azetal-

so dehyd, Propanal, Butanai, 2-Methylpropanol, Buttersäure, 2-Methylpropansäure, Pentansäure, Glutarsäure, Hexansäure, 2-Methylpentansäure, Heptandikarbonsäure, Heptansäuie, 4-Heptanon, 2-Heptanon, Oktansäure, 2* Äthylhexansäure, Glycerin, Äthylenglykol, Propylenglykol, 2-Propanon, 2-Butanon, Dläthylather, Methyläthylälher, Dlmethylather, Di-n-Propyläther, n-Propyl-

Isopropyläther und Mischungen von zwei oder mehreren

dieser Stoffe.

Kohlenwasserstoffgase, wie natürliches Gas, Methan

oder andere Gase, wie Äthan, können oxidiert werden, um Mischungen zu erhalten, die vorwiegend die entsprechenden Alkohole und geringe Mengen an Ketonen,

Aldehyden, Äthern und Säuren enthalten. Im allgemeinen werden Alkohole mit 1 bis 7 Kohlen-

^6S Stoffatomen pro Molekül bevorzugt. Solche Alkohole schließen lineare und verzweigte Alkohole ein, die prlmär, sekundär oder tertiär und einwertig oder mehrwertig sein können.

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Wegeji (hreri lefchten Zugänglichst, guten Löslichkeit In Wasser Junft Ihres niederen Preises sind am meisten Alkonoje rillt 1 bjs 4 Kohlenstoffatomen Im.Moleküi bevorzugt, insbesondere einwertige Alkohole dieser Art.

Ein z. Z, Im Handel erhältliches Material, das gelegentlich a|s »Methyl"Fuel« (C*EN,. IJ, September 1973, Seite 23) »Ist· be splettiajt fur die lnv₅Hande| erhältlichen Mischungen von Methanol und kontrollierten Prozent-Sätzen an höheren Alkoholen, die bis zu etwa 4 Kohlenstoffatome pro Molekül entfialteh. Derartige Mischungen vo#_Alkoholen<sInd geeignete Substrate bei der Erfindung ^%

Aerobe Gärungsverfahren und Einrichtungen zum Einführen von Sauerstoff In Gäningsmischungen sind In der Technik gut bekannt. Im allgemeinen führt man den molekularen Sauerstoff der wäßrigen Gärungsmischung zu. Indem man ein entsprechendes Volumen an Luft oder an mit Sauerstoff angereicherter Luft oder Luft und reinem Sauerstoff getrennt durch das Gärungsgefäß leitet. Die Abgase können wiedergewonnen und Im Kreislaufgeführt werfen, um eine maximale Verwendung des Sauerstoffs zu erhalten. Dazu kann man zuerst das Kohlendioxid aus den -Abgasen abtrennen und dann die Kreislaufführung vornehmen. Im allgemeinen führt man 0,1 bis 10, bevorzugt 0,7 bis 2,5 Volumina Luft pro Minute zu der Gärungsmischung pro Volumen der wäßrigen Flüssigkeit In der Gärvorrichtung. In Sauerstoffmengen ausgedrückt entspricht dies 0,02 bis 2,1, bevorzugt 0,14 bis 0,55 Volumina Sauerstoff.

Bei dem Verfahren nach der Erfindung kann der Druck innerhalb eines großen Bereiches schwanken. Typisch ist ein Druck im Bereich von 10,13 bis IO 132 kPa, bevorzugt 101,3 bis 3039 kPa und, z.Z. besonders « bevorzugt, 101,3 bis 506,5 kPa. Drücke, die höher sind als der atmosphärische Druck sind bevorzugt, da derartige Drücke den Gehalt an gelöstem Sauerstoff In dem wäßrigen Gäruragsmedium erhöhen, wodurch wiederum ein schnelles mikroblelles Wachstum gefördert wird. Die « erhöhten Drücke sind auch deshalb vorteilhaft, well bei den höheren Temperaturen, die bei der thermophilen Gärung verwendet werfen, die Löslichkeit des Sauerstoffs In dem wäßrigen Gärungsmedlum herabgesetzt wird.

Die Züchtung der gemischten Bakterienkultur wirf auf dem oxidierten Kohlenwasserstoff bei einer Temperatur Im Bereich von 45 bis 65* C durchgeführt werfen, wobei für ein optimales Wachstum der Bereich von 50 bis 60° C besonders bevorzugt ist. Die Anwendung niedrigerer Temperaturen führt zu einer Verlangsamung des Wachstums.

Zu hohe Konzentrationen von einigen der genannten Kohlenstoff- und Energiequellen, wie Methanol, können für das Wachstum der gemischten Kultur der Mlkroorga- *> nisffien inhibierend oder sagaf toxisch sein. Aus diesem Grund sind sie zu vermelden.

Das Gärungsverfahren kann diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden. Ein kontinuierliches» Verfahren ist besonders dann geeignet, wenn ein nledfiger Alkohol, wie Methanoi oder Äthanol, als Kohlen· stoff- und Energiequelle verwendet wird, da die Zufuhr solcher Ausgangsstoffe leicht kontrollierbar Ist. Ein dls-

:, dann teinn

F| ajs getrennten Strom oder

Ip Mjsehung'mlt Wjasse'r^vepiinden ,\f\\i einer Sterllislerijng,' pcjef,;iff Mfäohun.g- mjt, efnejn mineralischen Medfunfuhd'einer, SterII|s|erHng zuführen, wobei auch Kombinationen ,diesen ,yerschjedenen' Zuführungsverfahren möglich sind. "Üblicherweise wird der oxidierte Kohlenwasserstoff getrennt· zugeführt,^y/e\\ jdadurch die Kontrolle seiner Konzentration Im^Gärgefäß erleichtert wirf. Im allgemeinen sollte-die Konzentration des oxldleften^ohjenwasserstbffsjnxleq GärgefäßJbei 2,5 bis· 35 Gew.-96,^vbevdrzugt 10 bis_f15 Gew'.-fctHegen, j

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt In einem' wäßrigen Wachstumsmedium, .^as em wäßriges Mineraisaizmedium, die Kohlenstoff- üad Energiequelle, molekularen Sauerstoff und eine Impfung der gemischten thermophilen Bakterienkultur enthält.

Das Wachstum der Mikroorganismen. kann bei der Gärung durch Steuerung der Zuführung des oxidierten Kohlenwasserstoffs geregelt werfen. Die Zuführungsgeschwindigkeit der Kohlenstoff- und Energiequelle sollte so eingestellt werfen, daß die dem Gärungsgefäß zugeführte Menge im wesentlichen gleich ist mit der Geschwindigkeit des Verbrauchs durch die Mikroorganismen, so daß eine nennenswerte Anreicherung in dem Gärgefäß, Insbesondere von Irgendwelchen toxischen Materialien, vermieden wird.

Man kann eine befriedigende Überwachung der Gärungsbedingungen auch durch Bestimmung des nicht umgesetzten Ausgangsstoffs In dem Abgang aus dem Gärungsgefäß erreichen, wobei dieser Abgang zweckmäßigerweise 0 bis 0,2 Gew.-% des oxidiertet? Kohlenwasserstoffs enthalten soll.

Die Verweilzelt der mikrowellen Zellen In dem Gärgefäß Hegt bei einem kontinuierlichen Verfahren unter solchen Bedingungen im allgemeinen In der Größenordnung von 2 bis 4 Stunden, obwohl auch kürzere oder längere Verweilzeiten brauchbar sind.

Die bei der Erfindung verwendete gemischte thermophlle Bakterienkultur bedarf für ihren Wachstum zusätzlich zu der Kohlenstoff- und Energiequelle mineralische Nährstoffe und eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff. Die Stickstoffquelle kann eine beliebige stickstoffhaltige Verbindung sein, die in der Lage Ist, Stickstoff In einer für den Stoffwechsel der Mikroorganismen verwendbaren Form abzugeben. Für diesen Zweck kann zwar eine Vielzahl von organischen Stickstoffquellen verwendet werfen, wie Proteine und Harnstoff, doch werden in der Rtfgel anorganische Stlcksteffquellen benutzt, da Ihre Verwendung wirtschaftlicher und einfacher ist. Unter den anorganischen stickstoffhaltigen Verbindungen sind z.Z. Ammoniak oder Ammoniumhydroxid besonders bevorzugt, Andere typische Verbindungen dieser Art sind Ammoniumsalze wie Ammoniumcarbonat, Arnrnonlufflclträt, Ammonlumphospbat, Ammoniumsulfat und Ammonlumpyrophösphat. Die Verwendung von gasförmigem Ammoniak Ist besonders zweckmäßig, da man es einfach durch das wäßrige Gärungsmedlum In den gewünschten Mengen hindurchleiten kann.

Das pH der wäßrigen mikrowellen Gafungsfnischung Hegt Im allgemeinen Im Bereich von 5,5 bis 7,5, wobei

der Bereich von 6 bis 7 bevorzugt Ist. Die Zuführung von Ammoniak tragt dazu bei, um den gewünschten pH-Wert einzustellen, da sonst die Neigung zur Verschiebung des pH-Wertes des wäßrigen Mediums zum leicht sauren Bereich besteht. Selbstverständlich hangt der bevorzugte pH-Bereich fDr Mikroorganismen im allgemeinen In einem gewissen Ausmaß von dem verwendeten Medium ab, so daß bei Änderung des mineralischen Mediums eine Verschiebung des bevorzugten pH-Bereichs eintreten kann.

Außer Sauerstoff. Stickstoff und einer Kohlenstoff- und Energiequelle benötigen die Mikroorganismen zu Ihrem Wachstum bestimmte mineralische Nährstoffe, die dem Wachstumsmedium in den erforderlichen Mengen und Verhältnissen zugeführt werden müssen, um eine maximale Assimilation des oxidierten Kohlenwasserstoffs durch die Zellen bei der mlkroblellen Umwandlung zu erreichen.

Zu derartigen mineralisch«?·" Nährstoffen gehören eine Quelle für Phosphat oder eine andere Phosphorverbindung sowie Ionen von Magnesium, Calcium, Natrium, Mang2n, Molybdän und Kupfer. Ein Beispiel für ein mineralisches Nährstoffmedium, das hler als »FM-12« bezeichnet wird und das für das Gärverfahren geeignet Ist, Ist nachstehend angeführt. Dieses Medium enthält zusätzlich eine Lösung von Spurenelementen.

FM-12-Medium

Komponente

Menge

H3PO4 (85%)	2 ml
KCI	1 g
MgSO4 · 7H2O	1,5 g
CaCl2 · 2H2O	0,2 g
NaCl	0,1g
Lösung mineralischer
Spurenelemente	5 ml
destilliertes Wasser	zur Ergänzung
	auf 1 Liter

Lösung von mineralischen Spurenelementen Komponente

Menge

CuSO4 · 5H2O	0,06 g
KI	0,08 g
FeCl3 ■ 6H2O	4,80 g
MnSO4 ■ H2O	0,30 g
Na2MoO4 2H2O	0,20 g
ZnSO4-TH2O	2,00 g
HjBO3
H2SO+(konz.)	3 ml
destilliertes Wasser	zur Ergänzung
	auf 1 Liter

Es können auch andere Konzentrationen des mineralischen Mediums verwendet werden, und die Beispiele zeigen derartige Aosfuhrungsformen.

Sowohl bei dem diskontinuieriicnen ab auch bei dem kontinuierlichen Verfahren wird die gesaeite Einrichtung sterilisiert, wie der Reaktor oder dfe tifietrjrlchtimg, die Leitungen, die Einrichtungen fer dgt fättem/ftohrmit und die Kühlung α. dgl. Die Stcffflateipi« kann in flbltcher Weise durch Verwdung von Qampf von mindestens 121°C für mindestens einige Minuten, z.B. 15 Minuten, vor der Inbetriebnahme der Anlage erfolgen. Der sterilisierte Reaktor wird dann mit der Kultur In Gegenwart von allen erforderlichen Nährstoffen, einschließlich des molekularen Sauerstoffs und des oxidierten Kohlenwasserstoffs, geimpft.

Die Anlage kann so ausgestattet sein, daß Einrichtungen vorhanden sind, mit denen man die Zelldichte, das pH, den Gehalt an gelöstem Sauerstoff, die Konzentration an oxidiertem Kohlenwasserstoff in der Gärungsmischung, die Temperatur und die Zuführungsgeschwindigkeiten messen kann. Bei der z. Z. bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Ausgangsstoffe sterilisiert, bevor sie In das Gärungsgefäß eingeführt werden. Wenn der oxidierte Kohlenwasserstoff eine Verbindung Ist, die In der Lage Ist, andere Materlallen zu sterilisieren, wie beispielweise Äthanol oder Methanol, kann es vorteilhaft sein, diese Komponente anderen Strömen, wie z. B. den mineralischen Medien, in sterilisierenden

2" Mengen zuzusetzen, und dadurch eine getrennte Hltzesterllislerung zu vermelden.

Die Zugabe von Antischaummittel zu der Gärungsmischung Ist nicht erforderlich und sollte deshalb vermieden werden, da Antischaummittel wie Silikone nachteilig for den gelösten Sauerstoffgehalt bei den erwünschten hohen Gärungstemperaturen sein können und ein langsameres Wachstum der Organismen oder sogar Ihr Absterben zur Fp'ye haben können. Der durch die gemischte thermophlle Bakterienkultur erzeugte Schaum Ist für das Wachstum der Mikroorganismen nicht schädlich und trägt auf jeden Fall dazu bei, einen hohen Gehalt an gelöstem Sauerstoff In dem System aufrechtzuerhalten. Wie leicht verständlich Ist, werden durch die Schaumbildung große Grenzflächen für die Berührung zwischen Gas und Flüssigkeit gebildet. Dadurch kann die Gärung als solche verbessert werden und auch hinsichtlich des Wärmeüberganges, der Gleichförmigkeit und der Vermeidung der Überhitzung von einzelnen Stellen tritt eine Verbesserung ein.

Es Ist selbstverständlich möglich, bei der Gärung harmlose schaumblldende Substanzen, wie bestimmte Detergenzlen, Insbesondere nlcht-ionlsche Detergenzlen, zu verwenden, um eine zusätzliche Schaumbildung anzuregen, doch Ist dieses üblicherweise weder notwendig noch erwünscht.

Die Isolierung der mlkroblellen Zellen kann In üblicher Welse erfolgen, wie z. B. durch Ansäuern des Abgangs aus der Gärung z. B. auf ein pH von etwa 4 und Erwärmen des angesäuerten Abgangs auf eine Temperatur, die ausreichend zum Abtöten der Mikroorganismen, aber nicht hoch genug Ist, um das Proteinprodukt zu schlügen. Eine derartige Temperatur Hegt beispielsweise bfJ etwa 80° C, Der Abgang kann dann zentrifugiert, gewaschen und zur Isolferäng der mitafoMejfefr Zeilen erneut zentrifugiert werden. DTe Zellen können dann Behandelt werden, um eine Auflösung hervorzurufen, so daß die Isolierung des Proteins und anderer Materialien aus der Zelle beschleunigt wird. Bei der Gärung entstehen auch einige erwünschte Nebenprodukte, die aus dem Abgang

aus dem Gäningsgefflfl isoliert werden können. Diese extrazellularen Produkte können für die Wirtschaftlichkeit des gesamten Verfahrens wichtig sein, da es sich zum Teil um wertvolle Produkte handelt wie Polysaccharide, Aminosäuren wie Glutaminsäure, Enzyme und

Vitamine.

Das erhaltene EtnzeUprpteiii ist eine wertvolle EiwelB-

" quelle fur Menschen und Tiere. FDr dfe Verwendung als menschliche Nahrung können die Zeilen noch behandelt

ίο

werden, um Ihren Gehalt an Nukleinsäuren herabzusetzen, wogegen eine solche Behandlung bei tierischen Nährstoffen nicht erforderlich erscheint.

Pslsplcl I

Es wurde eine kontinuierliche Gärung unter Verwendung der gemischten thermophllen Kultur gemäß der Erfindung durchgeführt. Ein 7-Llter-Gärgefäß, das mit einer belüftungseinrichtung, einem Rührer, einer Einrichtung zur Überwachung des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff und Einrichtungen für das Messen und die Steuerung der Temperatur und des ρί-i-Wertes der Oärungsmlschung ausgerüstet war, wurde mit etwa 500 ml einer Reaktionsmischung von einer vorherigen Gärung mit der gemischten thermophllen Kultur und 10 ml Methanol zur Impfung beschickt. In den Reaktor wurden außerdem 2 Liter des mineralischen Gärungsmediums FM-12 eingeführt.

Die Rührgeschwindigkeit wurde bei 1000 Upm wäh

rend Hjpsp« Versuchs gehalten, urid das pH wurde auf 6,2 bis 6.35 durch Zugabe der erforderlichen Ammonlumhydroxld-Lösung eingestellt. In das Gärgefäß wurde außerdem Luft mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute während der Versuchsdauer eingeführt. Nach 6 Stunden wurde zusätzlich Im wesentlichen reiner Sauerstoff In das Gärgefäß mit der Geschwindigkeit von 0,5 Litern pro Minute eingeleitet. Die Sauerstoffzufuhr wurde auf 0,75 Liter pro Minute nach 118 Stunden, auf 1,5 Liter pro Minute nach 174 Stunden und auf 2 Liter pro Minute nach 190 Stunden erhöht.

Nach 22 Stunden wurde das mineralische MeJlum geän(*;rt In eine wäßrige Zusammensetzung, die 7,5 Vol.-% Methanol und zusätzlich das «FM-12« - Medium plus 0,75 g Kaliumchlorid, das Doppelte des normalen Gehalts an mineralischen Spurenelementen, das Dreifache des normalen Mangangehalts (alles auf einer Pro-Llter-Basls), aber kein Natriumchlorid enthielt. Nach 166 Stunden wurde das zugeführte Nährmedium geändert in eine wäßrige Zusammensetzung, die 10 Vol.-* Metha-

Tabelle I

nol, 2,5 ml Phosphorsäure (85*) pro Liter, 2g Kaliumchlorid pro Liter, 1,75 g Magnesiumsulfat · 7H₂O pro Liter. 0,25 g Kalziumchlorid · 2H₂O pro Liter, 20 ml Mangansulfat ■ H₂O pro Liter als wäßrige Lösung (0,3 g/Liter) und 35 ml der bereits charakterisierten Lösung von mineralischer. Spurenelementen enthielt.

Die Zufuhrungsgeschwindigkeit des Mediums schwankte zwischen 700 ml pro Stunde bei 22 Stunden bis 817ml pro Stunde bei 118 Stunden, 781 ml pro

to Stunde bei 166 Stunden und 763 ml pro Stunde bei 382 Stunden.

Es wurden Proben des Abganges aus dem Gärgefäß von Zelt zu Zelt entnommen, und die Zellen wurden aus diesen Proben Isoliert. In der nachfolgenden Tabelle I wird der Zellgehalt als Trockengewicht der Zellen in Gramm pro Liter und die errechnete Ausbeute angegeben. Die Tabelle enthält außerdem errechnete Werte für die Produktivität in Gramm der Zellen pro Liter und pro Stunde.

2s Nach einer Versuchsdaücf voii eiwa 126 Stunden wurden Proben der Gärmischung entnommen und für die Lyophlllslerung der mikrowellen Zellen nach bekannten Arbeltswelsen vorbereitet. Diese lyophllislerten Proben wurden für die spätere Verwendung für einen Gärungsversuch aulbewahrt. Sie dienten außerdem für die Hinterlegung bei der bereits genannten Stelle.

Es wurden außerdem periodisch Proben aus der Gärungsmischung für die mikroskopische Untersuchung der mikrowellen Zellen zur Feststellung ihrer morphologlschen Struktur entnommen. Diese mikroskopische Untersuchung zeigte, daß die gemischte thermophlle Bakterienkultur aus einem großen grampositiven gekrümmten Stäbchen, einem großen gramnegativen Stäbchen und einem kleinen gramnegativen Stäbchen bestand. Gelegentlich wurde ein großes grampositives (nichtgekrümmtes) Stäbchen beobachtet, doch wurde angenommen, daß es sich hierbei um eine vorübergehende Variante des großen gekrümmten grampositiven Stäbchens handelt.

Zeit, h

Venveilzeit
Zeit, h

Zellen <■>
g/I

Feststoffe <^b>
g/l

Zellenausbeute <^c>
%

Produktivität (■·>
g/I/h

46	118	166	190	286	358
2,36	2,27	2,38	2,83	2,33	2,43
26,36	27,13	27,04	35,21	35,53	35,57
26,82	27,66	27,87	35,5	36,66	36,76
44,7	46,1	46,47	44,4	45,8	45,9

11,4

11,7

15,7

15,1

<·> Zur Ermittlung dieses Wertes wurde eine 10-ml-Probe aus dem Abgang des Reaktors über Nacht bei 100° C verdampft, und von dem Gewicht des Rückstands wurde das Gewicht der mineralischen Feststoffe, die in 10 mi des Mediums enthalten sind, abgezogen.

<*> Dieser Wert wurde erhalten* indem eine 100-ml-Prbbe des Abgangs aus dem Reaktor zentrifugiert wurde, die erhaltenen Feststoffe in destilliertem Wasser erneut suspendiert würden und diweSuspensioüenwiederzentrinigieitwünleimddieeHialfcnenFeststoffeübwNacttbieiiOÖ^C getrocknet wurden. :

<^c> Dieser Wert wurde erhalten durch Teilen der isolierten Feststoffe (g/l) durch das eingesetzte

Methanol (g/I) ■ 100.

■ w Dieser "Wert wurde erhalten durch Teilen der isolierten Feststoffe (g/l) durch die Verwejl· zeitfh). --·.:-■ ^: -' -

Beispiel 2

Nach etwa einem Monat wurde eine Probe der lyophlllslerten HTB-53 mikrowellen Kultur von dem Gärungsversuch von Beispiel I aseptisch In üblicher Welse geöffnet und einem als »IM2« bezeichneten Gärungsmedium, das zusätzlich 0,5* Methanol enthielt, zugegeben. Die Zusammensetzung des Mediums IM2 wird nachstehend angegeben.

IM2-Medlum

Komponente

Menge

KH₂PO₄
K₂HPO₄
MgSO₄- 7H₂O
CaClj· 2H₂O
NaCI
(NH₄J₂SO₄

Lösung von mineralischen
Spurenelementen

destilliertes Wasser

2,0	g
3,0	g
0,4	g
0,04	g
0,1	g
2,0	g
0,5	ml
zur	Ergänzung
auf	1 Liter

Tabelle II '·'

Zeit, h

Verweilzeit
Zeit, h

Zellen
g/l

Feststoffe
g/l

Zellausbeute

Produktivität
g/l/h

'" Die Werte
Tabelle I.

70 166 190 214

2,60 2,70 2,63 2,64

34,33 33,56 33,87 34,84

34,44 35,4 34,55 35,52

43.6 44,2 43,2 44.2

13,2 13,1 13,1 13.5

Men in gleicher Weise ermittelt wie bei

Ein mit der wiederbelebten lyophillsierten Kultur beschickter Reaktionskolben wurde durch Schütteln bei 55° C bebrütet. Nach 24 Stunden war ein Wachstum der Kultur zu beobachten, und es wurden 5 ml der Mischung in 100 ml des Mediums IM2, das zusätzlich 1,5 Vol.-% Methanol enthielt, übergeführt. Innerhalb 24 Stunden entwickelte sich ein gutes Wachstum, und es wurde dann eine dritte Überführung In das gleiche Medium In zwei Kolben vorgenommen, wobei jeder dieser Kolben 500 ml des IM2-Mediums und 1,5 Vol.-* Methanol enthielt. Bei dieser dritten Überführung wurden 100 ml der Kultur In jeden der beiden Kolben übergeführt. Man Heß nun die Kultur 32 Stunden wachsen, und dann wurde sie als Impfmaterial für eine kontinuierliche Gärung In der Vorrichtung von Beispiel : verwendet. Das Gärgefäß wurde mit 1000 ml des FM-12-Medlums und 1000 ml des Impfmaterials, dem 10 ml Methanol zugesetzt werden, beschickt. Die Temperatur wurde bei 55° C gehalten, und das pH wurde auf 6,25 bis 6,4 durch kontinuierliche Zugabe einer Ammoniumhydroxidlösung eingestellt. Zuerst wurde der Rührer mit einer Geschwindigkeit von 300 Upm betrieben, und Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Liter pro Minute eingeführt, wobei die Kultur Gelegenheit hatte, sich an das Gärgefäß zu gewöhnen. Nach 7 Stunden wurde mit der kontinuierlichen Einführung eines Wachstumsmediums begonnen, das die gleicht Zusammensetzung wie* das zuletzt charakterisierte Wachstumsmedium Im Beispiel 1 hatte. Zusätzlich wurde die Luftgeschwindigkeit erhöht auf 2 Liter pro Minute und die Rührgeschwindigkeit auf 1000 Upm. Nach 30 Stunden wurde die Luftgeschwindlgkelt reduziert auf 1,75 Liter pro Minute^ der Sauerstoff wurde auf 0,75 Liter pro Minute reduziert und auf I Liter pro Minute nach 54 Stunden erhöht und nach 198 Stunden auf 1,5 Liter erhöbt. Es wurden erneut Proben des Abgangs aus der Gärung von Zelt zu Zeit genommen, um den Zellgehalt in Gramm pro Liter, bezogen auf das Trockengewicht, am die Zeilansbeute und die Produktivität bei der Gärung zu ermitteln. Die erhaltener* Werte gehen aus der folgenden Tabelle Π hervor. 2Ö riUCii in uicäciTi ι an w'ürüci'i Wie uci uciäpici ι ΓπίΚΓΰ-skoplsche Untersuchungen an Proben der entnommenen mikrowellen Kultur durchgeführt. Es wurden erneut große grampositive gekrümmte Stäbchen und große und kleine gramnegative Stäbchen beobachtet. Nach einer Versuchsdauer von 238 Stunden kam das Wachstum der Kultur zu einem Ende durch den Versuch, auf eine höhere Alkoholkonzentration im Medium überzugehen.

Beispiel 3

In der folgenden Tabelle III sind analytische Daten enthalten, die die Im Beispiel 1 erhaltene mlkroblelle Kultur In Ihrer chemischen Zusammensetzung charakterisieren. Die weitere Tabelle IV enthalt eine Analyse der Aminosäuren, die aus einem anderen Gärversuch mit der gemischten thermophllen Bakterienkultur erhalten wurde. Zum Vergleich ist In diese Tabelle auch eine Analyse der Aminosäuren aus einem Versuch mit einem reinen thermophllen Mikroorganismus, der bei der eingangs beschriebenen Isolierung der thermophllen Mikro-Organismen aus der Bodenprobe gewonnen worden war.

Tabelle III

Chemische Analyse der mikrobiellen Zellen Zellen aus einem Versuch mit HTB-53

Rohes Protein ^(a\ Gew.-%

Asche, Gew.-%

Aminostickstoff, Gew.-%

Kohlenstoff, Gew.-%

Wasserstoff, Gew.-%

Stickstoff, Gew.-%
Phosphor, Gew.-%

Kalium, Gew.-%

Magnesium, Gew.-%

Kalzium, Gew.-%
Natrium, Gew.-%

Eisen, ppm
Zink, ppm
Mangan, ppm
itfipfer, ppm

« Stickstoffgehalt 03,7) - 6,25

85,63 9,19

13,4

44,7 6,79

13,7 1,71 0,91 0,26 0,1

<0,01

1300 55,8 126 20

Tabelle IV	Methanol gewachsenen	Nicht-essentielle Aminosäuren	5,65	Ihermophilen Bakterienkulturen:	Gemischte Kultur	5,76	Chemische
Aminosäurengehalt von aus	Produkts	Alanin	3,39		Vergleichswerte"1«' (HTB-42)	4,90	Vergleichswerte'"
Gramm pro loo Gramm des	Reine Kulturen	Arginin	6,50	Chemische		5,67
	(HTB-7)	Asparaginsäure	3,71		75	1,22	104
		Glycin	10,47	83	nicht	118
Essentielle Aminosäuren	5,37	Glutaminsäure	1,26	96	bestimmt	141
Leucin	4,56	Histidin	2,32	34	2,79	36
Isoleucin	5,54	Prolin	2,09	34	2,78	36
Lysin	1,50	Serin			2.72
Methionin	nicht	Essentielle Aminosäuren	30,88	90	0,89	88
Cystin	bestimmt	zusammen	66,27	80	5,46	88
	2,95	Aminosäuren zusammen	85,63	80		88
Threonin	2,68	Rohprotein		43	6,19	90
Phenylalanin	2,55		91	3,01	121
Tyrosin	0,60		6,26
Tryptophan	5,13		4,19
Valin		10,69
		1,22
	2,38
	1,75
	32,19
	67,88
	84,4

ι" Der chemische Vergleichswert ist bezoeen auf den Gehalt an essentiellen Aminosäuren von Ei als Basis »100« für das gleiche Gewicht von Protein.

¹²¹ Bezogen auf den Mittelwert von fünf Versuchen mit der reinen thermophiien Bakterienkultur.

Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß der Prozent- zeigen die chemischen Vergleichswerte, daß das Produkt satz der gesamten essentiellen Aminosäuren für das Pro- so von der gemischten Kultur vom Standpunkt der Ernähdukt der gemischten Kultur etwas höher Ist (47%) als das rung doppelt so gut ist als das Produkt aus der reinen Produkt aus der reinen Kultur (46%). Wenn außerdem Kultur, bezogen auf den nächsten niedrigsten chemldle essentiellen schwefelhaltigen Aminosäuren durch sehen Vergleichswert einer essentieller. Aminosäure.
Zugabe von synthetischem Methionin ergänzt werden.

Claims (1)

1. ,Fermentation von Offerten' Koh,!er>wa^erstoffeff als Kohlenstoff^uqd Energiequelle mlttejs MlKroorganlsmenbe! einer Tempfiratyf γόη 45b"|s"65"C In wpßrlgem MecJJum In Gegenwartie|per;St|cftstoffquelle und mineralischer Nährstoffe, sowie" Isolierung des Proteins einschließlich der anderenV-MaterialJen aus den erhaltenen Zellen, dadurch- gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus die Bäkterfenmischkültur NRRL B-8158 verwendet. > ' -

   Diese Erfindung betrifft das. Im Patentanspruch angegebene Verfahren. _t

   Im Rahmen der Bemühungen zur. Behebung der EiwelQknapphelt sind biosynthetische Versuche durchge- ^M führt worden, um auf biologischem Wege Einzellprotein durch das Wachstum von Mikroorganismen auf kohlenstoffhaltigen Substraten herzustellen.

   Die für solche Verfahren verwendeten Kohlenstoff- und Energiequellen sollten in großem Umfang und zu niedrigen Preisen zur Verfügung stehen und sollten gleichförmig und sicher In dem Sinneseln, daß sie keine schädlichen Rückstände in dem eiweißhaltigen Produkt nach der mikrowellen Umwandlung hinterlassen. Man hat schon Erdölkohlenwasserstoffe als Kohlenstoff- und ^Μ Energiequelle verwendet, doch traten hler In der Praxis Schwierigkelten auf, wie die mangelnde Löslichkeit dieses Rohstoffs in Wasser, ein hoher Verbrauch an Sauerstoff und angeblich auch Spuren von krebserregenden Stoffen, die mit den Erdölausgangsstoffen eingeführt ^x werden und an dem Proteinprodukt haften.

   Bei anderen Verfahren hat man oxidierte Kohlenwasserstoffderivate als Ausgangsstoffe verwendet, da diese Materlallen wasserlöslich sind und sich deshalb leichter handhaben lassen, so daß die mikrowellen Umwandlun- *° gen Im wesentlichen Im wäßrigen Medium durchgeführt werden. Solche Ausgangsstoffe sind leicht zugänglich, z. B. aus Erdöl, Erdgas, verschiedenen Verfahren zur Aufarbeitung von Abfallen, durch Umwandlung von Methan, aus der Vergärung von verschiedenen Getreide- ^4S arten und aus der trocknen Destillation von Holz. Solche oxidierten Kohlenwasserstoffe stehen In großem Umfang zur Verfügung und sind relativ billige Ausgangsstoffe für Gärungsverfahren. Gegenüber den Kohlenwasserstoffen besitzen die oxidierten Kohlenwasserstoffe bei ihrer Ver- ^x wendung als Ausgangsstoffe für die Gärung den Vorteil, daß der Sauerstoffbedarf wesentlich geringer Ist.

   Ein anderes schwieriges Problem, das der kommerziellen Verwendung der Verfahren zur Herstellung von Ein· zellprotein einschränkend entgegenstand, bestand in der ^5S Notwendigkeit, die Gärung bei Temperaturen von etwa 20 bis 50* C, bevorzugt nicht über etwa 35* C, durchzuführen. Mlkroblelle Umwandlungen! sind exotherme OxI-datlonsreakilonen, bei denen große Wärmemengen frei werden. Es muß deshalb aus dem Gärungsmedium kon- ^M tinuleflich und beständig die Warme abgeführt werden, well sonst die Gefahr einer überhitzung des Systems besteht, wodurch die Mikroorganismen abgetötet werden oder Ihr Wachstum eingeschränkt wird, so daß die Gärung nicht mit der gewünschten Effizienz verläuft.

   Bei vielen derartigen Verfahren hat man sich um die Verwendung von Hefen als Mikroorganismen bemuht. Die Hefezellen sind Im allgemeinen etwas größer als die te}le_T, d,a IrJJFZeIJeJ)'!!*! ^llgenje^^neJT jjOjjeien Gehalt ai'RoJpiqtefn haben, alsdir^He^Hen, Pje$ jst-(JaRMf z'yn}c|^ffl}Rre|][^dftß'dJe. Heje
   Anteil ajl <nlcttt- protelnartfgen/BaJ4nia|ejiattep |i| Ίΐΐτεη Zejjeft entjj^^pjjpie^Bakteriefl^ftrKn^be^nlcht nur efnen- beachtljch' höheren* Gehalt a^eojiten^ ijrotefnv sondern enthalten JflSftg auch höhere Anteile, tier; für die Ernähning,wjchtlgen. schwefelhaltigen*Aminosäuren und 'von'Lysln! «'**"■' ._v ·!' - - "

   Es bestellt deshalbcler Wunsch nach Bakterien, die ein i^ches/Wachstumjüid eine hohe Produktivität bei relativ' norien GärungstemperaVaren besitzen, Dt& Verwendung einer* Hohen Gärungstemperatur bedeutet, daß weniger Wärmejentfernt werden muß, daß ein geringerer apparativer¹ Aufwand.für: die Kühlung erfgryerllch Ist und daß'schlleßllch. geringere-Wärmemengen zugeführt werden müssen für die Sterilisation, die Koagulation und die Trennung. Von Interesse ist fernerhin, daß die Gefahr einer Kontaminierung mit anderen Mikroorganismen bet Verwendung von hohen Gärungstemperaturen stark reduziert winL Aus diesen Gründen ist es sehr erwünscht, thermophile oder thermotolerante Bakterien für die industrielle Herstellung von Einzellprotein zur Verfügung zu haben.

   Es wurde nun eine besonders vorteilhafte gemischte thermophile Bakterienkultur fur die Herstellung von Einzellprotein gefunden. Diese Bakterienkultur enthält folgende drei Bakterienarten: