DE2754072C2 - Herstellung von Einzellprotein - Google Patents
Herstellung von EinzellproteinInfo
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- DE2754072C2 DE2754072C2 DE19772754072 DE2754072A DE2754072C2 DE 2754072 C2 DE2754072 C2 DE 2754072C2 DE 19772754072 DE19772754072 DE 19772754072 DE 2754072 A DE2754072 A DE 2754072A DE 2754072 C2 DE2754072 C2 DE 2754072C2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Description
(1) große grampositive gekrümmte Stäbchen, Gruppe
Bacteria, Klasse Schlzomycetes, Ordnung Eubacteriales, Gattung Bacillus;
(2) große gramnegative Stäbchen der gleichen Gattung
und
(3) kurze gramnegative Stäbchen, Gruppe Bacteria, Klasse Schlzomycetes.
Diese gemischte thermophile Bakterienkultur (Kurzbezeichnung: »Mr«) besitzt zahlreiche vorteilhafte Eigenschaften.
Sie zeigt ein höheres Wachstum bei höheren
Temperaturen gegenüber den üblichen Temperaturen und ergibt bei geringerer Neigung zum Schäumen höhere
Zellausbeuten.
Diese gemischte Kultur ist thermophll, zeigt eine höhere Produktivität auf oxidierten Kohlenwasserstoffen,
Insbesondere niederen Alkoholen, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, wobei diese Ergebnisse bei Temperaturen
erhalten werden, bei denen a># anderen bekannten
Bakterienarten entweder relativ unproduktiv sind oder Oberhaupt nicht Oberleben können oder unproduktiv oder
unverträglich mit einem Nährboden auf Basis von oxl
dlerten Kohlenwasserstoffen sind.
Name
der Kultur
der Kultur
Bezeichnung
des Stamms
des Stamms
Hinierlegungsbezeichnung
H.TB-53
NRRL B-81S8
Die Bezeichnung NRRL B-8158 drückt aus, daß die gemischte thermophile Kultur beim United States
Department of Agriculture, Agricultural Research Service, North Central Region, Northern Regional Research
Center, 1815 North University Street, Peorla, Illinois 61604, U.S.A., hinterlegt worden Ist und die Bezeichnung
NRRL B-8158 erhalten hat.
'-5^072 '-:
jjj|9π%τ,Μ Rn
erhjjf njw^ingellpmtern in ^
^pleni-jfqbfiijJlfn^euerstr ymftfl AiTn m$
laß dfej Arirortfejunge'rtran; dfeI.Küf}lung; geringer SfRiJ-MSKpblSis^tT-urlff
Ener#equef|e vejf pnd^JJlfin Ο31ϊ-jlerje
KoWe"rlwflsseirätof{e, Insbesondere niedjfge AJkQ'.
lole'f Mlnl de^tliaptwpiefZiMetMBo!
, IXe bef der Erflnrtung^erwendettfgen^gcfiteBakie^en
^utllc^e Voheije'gegenöberder^firwendung
'on j'plnen thennopjiHen' BaJcteriegkuHuren, fOr^dfe YersSruiig
von Methapbl ode^ ähnl(c}jen Koih|ensiofFr und
ineiBlequellen. Zupäfchst^^tyes γοη -Vortell, daß ,eine
löheTfrZellau^ute'jjei-XeriraicIung^dergenifschteii ΚμΙ-ur
erhalten wftd. Die Zellausbeute wird^Kief deflnTert als
He Menge der Zellen In Gramm, die auf 100 Gramm der rerwendeten KohfenstpfT- und Energiequelle, wie^Metha-ιοί,
erzeugt wjFd/sDte höhere Zellausbeute Ist .von ganz
n-heblicher wirtschaftlicher Bedeutung.
Ein anderer Vorteil, cter gemischten Kultur im Ver-
;lelch zu einem reinen fcsrmophllen Bakterium ist in der
Tatsache zu sehen, daß die Schaumentwicklung bei der
;emlschten Kultur wesentlich niedriger Ist als bei reinen
CuItüren. Reine Kulturen neigen Im allgemeinen dazu,
;roße Mengen an Schaum während des Gärungsverfahens zu bilden. Die Schaumbildung kann zwar bei
>estimmten Apparaten vorteilhaft sein, km bei dem
järungsverfahren die Wärmeabführung zu erleichtern >der die erforderlichen Mengen an molekularem Sauer-
!toff fur ein aerobes Gärungsverfahren zur Verfügung zu
!teilen, doch sind zahlreiche Gäreinrichtungen so geplant
ind gebaut, daß sie große,Mengen an Schaum, wie er bei
Verwendung von reinen Stämmen von MIk- .»Organismen
luftritt, nicht bewältigen können. Di-. geringe Schaumnenge,
die mit der gemischten Kultur naci; der Erfinlung
auftritt, Ist deshalb ein deutlicher Vorteil.
Ein anderer Vorteil der gemischten Kultur Ist In der
Tatsache zu sehen, daß man zwangsläufig ein Einzellproein erhält, das eine Mischung von verschiedenen ZeI I aren
1st. Die Verteilung der Aminosäuren In dem Isolieren
Einzellprotein Ist deshalb vorteilhafter als bei Vervendung
einer einzigen reinen Kultur. Eine bessere Verellung
der Aminosäuren bedeutet aber, daß die Wahricheinlichkelt des Fehlens einer besonders essentiellen
\mlnosäure geringer ist.
Die gemischte thermophiie Kultur wurde gefunden bei Unlersuchungen, die die Entdeckung und Entwicklung
slner Vielzahl von Kulturen für mlkroblelle Umwandlungen
zum Gegenstand hat. Es wurde eine Bodenprobe 51 cm unter der Erdoberfläche oberhalb einer Dampftet'
tung In Bartlesvllle, Oklahoma, U.S.A. genommen. Zur
Isolierung von einigen getrennten oder bestimmten KuI-türen
wurden übliche Anreicherungsarbeitsweisen in Gegenwart von Methanol angewandt. Während dieser
Arbeiten, bet denen einige reine thermophiie Kulturen sollcrt wurden, wurde festgestellt, daß eine gemischte
Kultur von thermophilen Organismen von ungewöhnlleher
Beständigkeit In der Zusammensetzung gefunden worden war.
Die gemischte thermophiie Kultur setzt sich aus drei
verschiedenen Mikroorganismen zusammen. Die drei Baklerlentypen in der in ihrer Zusammensetzung beständlgen
gemischten thermophilen Kultur sind 1. große grampositive gekrümmte Stäbehen, 2. große gramnegative
Stäbchen und 3. kurze gramnegative Stäbchen.
Es- wurden verschiedene Versuche unternommen, um aus dieser gemischten Kultur die reinen Mlkroorganlsmen
zu Isolieren. So gaben z. B. Strichkulturen isolierte gpj?
weüj&keln
artfge; Versuchedaß e\tuttq\p„fi
weüj&keln
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anQJea|s Kphjenstpffv und,Enerdep
go" jfpnfite übenrascJiender>
iet werden, Derwiederholt
durchgeführt, ohne.
, Das.gejneJgsifneW^ctism^ 4\ψν gemähten Kultur
jo zeJgtMpFne syp^blotlsche' Bezjehupg zwischen dep drei
" Mlk|t»rg|n]5mej ag, Erichelfitjjpögjlch zu 5β|ξΐ, daß e|n
oder niedrere StöTfwechselproSukte a|s notwendiges Sub-
strat für das Wachstum dep" anderen. Mikroorganismen
r dient. Die genaue !«iatur^lieser Sjronwecfiselprodukt&ilst
z. Z_ nicht betfannt^Es' scheint jedoch moglichizu'setn,
daß ein öerartlges StofFwechselprodukt for den Mtkroorganismus,,
der es erzeugt* toxisch Ist, wodurch sich" die Notwendigkeit fandie Gegenwart eines weiteren MikroOrganismus
ergibt, um das toxische Stoffwechselprodukt zu verbrauchen, so daß der erste Mikroorganismus sein
Wachstum ungestört fortsetzen kann.
Ein weiterer Hinweis für eine symbiotische Beziehung ist in der Tatsache zu sehen, daß Garungen, bei denen
die gemischte thermophiie Bakterienkultur verwendet wird, wesentlich weniger Schaum unter typischen aeroben
Gärungsbedlngungeit bilden im Vergleich zu den Schaummengen, die normalpsweise unter äquivalenten
typischen aeroben Gärungsbedingungen bei Verwendung von reinen thermophilen Bakterien von der Gattung
Bacillus. Dies deutet an, daß die gemischte thermophiie Bakterienkultur die erwarteten großen Schaummengen
deshalb nicht erzeugt, weil ein extrazelluläres Produkt,
das wahrscheinlich eiweißartig ist, von mindestens einem der symbiotischen Mikroorganismen verbraucht wird,
wodurch die Gärungsmischung kontinuierlich von diesem schaumbildenden Material befreit wird.
Bei der Erfindung Ist die Kohlenstoff- und Energiequelle
bzw. das Substrat ein oxidierter Kohlenwasserstoff. Beispiele für solche oxidierten Kohlenwasserstoffe sind
*o Alkohole, Ketone, Ester, Äther, Säuren und Aldehyde,
die im wesentlichen wasserlöslich sind und bevorzugt bis zu 10 Kohlenstoffatome im Molekül enthalten.
T/plsche Beispiele für solche Verbindungen sind:
Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexa-
*S nol, 1,7-HeplaHdlol, 2-Heptanol, 2-Methyl-4-Pentanol,
Pentansäure, 2-Methylbutansäure, 2-Pentanol, 2-MethyI-4-Butanol,
i-Methyl-3-Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-l-Propanol,
2-MethyI-2-Propanol, 2-Propanol, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Formaldehyd, Azetal-
so dehyd, Propanal, Butanai, 2-Methylpropanol, Buttersäure,
2-Methylpropansäure, Pentansäure, Glutarsäure, Hexansäure, 2-Methylpentansäure, Heptandikarbonsäure,
Heptansäuie, 4-Heptanon, 2-Heptanon, Oktansäure, 2*
Äthylhexansäure, Glycerin, Äthylenglykol, Propylenglykol, 2-Propanon, 2-Butanon, Dläthylather, Methyläthylälher,
Dlmethylather, Di-n-Propyläther, n-Propyl-
dieser Stoffe.
oder andere Gase, wie Äthan, können oxidiert werden,
um Mischungen zu erhalten, die vorwiegend die entsprechenden
Alkohole und geringe Mengen an Ketonen,
6S Stoffatomen pro Molekül bevorzugt. Solche Alkohole
schließen lineare und verzweigte Alkohole ein, die prlmär, sekundär oder tertiär und einwertig oder mehrwertig
sein können.
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Glycerin, Ätpylenglykalj Propylenglykol «nrt Mischungen dayonr j - *■,*_« r , jt „ „V
Wegeji (hreri lefchten Zugänglichst, guten Löslichkeit
In Wasser Junft Ihres niederen Preises sind am meisten Alkonoje rillt 1 bjs 4 Kohlenstoffatomen Im.Moleküi
bevorzugt, insbesondere einwertige Alkohole dieser Art.
Ein z. Z, Im Handel erhältliches Material, das gelegentlich
a|s »Methyl"Fuel« (C*EN,. IJ, September 1973,
Seite 23) »Ist· be splettiajt fur die lnv5Hande| erhältlichen
Mischungen von Methanol und kontrollierten Prozent-Sätzen
an höheren Alkoholen, die bis zu etwa 4 Kohlenstoffatome
pro Molekül entfialteh. Derartige Mischungen
vo#_Alkoholen<sInd geeignete Substrate bei der Erfindung
%
Aerobe Gärungsverfahren und Einrichtungen zum Einführen von Sauerstoff In Gäningsmischungen sind In
der Technik gut bekannt. Im allgemeinen führt man den molekularen Sauerstoff der wäßrigen Gärungsmischung
zu. Indem man ein entsprechendes Volumen an Luft
oder an mit Sauerstoff angereicherter Luft oder Luft und reinem Sauerstoff getrennt durch das Gärungsgefäß leitet.
Die Abgase können wiedergewonnen und Im Kreislaufgeführt
werfen, um eine maximale Verwendung des Sauerstoffs zu erhalten. Dazu kann man zuerst das Kohlendioxid
aus den -Abgasen abtrennen und dann die Kreislaufführung vornehmen. Im allgemeinen führt man
0,1 bis 10, bevorzugt 0,7 bis 2,5 Volumina Luft pro Minute zu der Gärungsmischung pro Volumen der wäßrigen
Flüssigkeit In der Gärvorrichtung. In Sauerstoffmengen ausgedrückt entspricht dies 0,02 bis 2,1, bevorzugt
0,14 bis 0,55 Volumina Sauerstoff.
Bei dem Verfahren nach der Erfindung kann der Druck innerhalb eines großen Bereiches schwanken.
Typisch ist ein Druck im Bereich von 10,13 bis IO 132
kPa, bevorzugt 101,3 bis 3039 kPa und, z.Z. besonders «
bevorzugt, 101,3 bis 506,5 kPa. Drücke, die höher sind als der atmosphärische Druck sind bevorzugt, da derartige
Drücke den Gehalt an gelöstem Sauerstoff In dem wäßrigen Gäruragsmedium erhöhen, wodurch wiederum
ein schnelles mikroblelles Wachstum gefördert wird. Die «
erhöhten Drücke sind auch deshalb vorteilhaft, well bei
den höheren Temperaturen, die bei der thermophilen Gärung verwendet werfen, die Löslichkeit des Sauerstoffs
In dem wäßrigen Gärungsmedlum herabgesetzt wird.
Die Züchtung der gemischten Bakterienkultur wirf auf
dem oxidierten Kohlenwasserstoff bei einer Temperatur
Im Bereich von 45 bis 65* C durchgeführt werfen, wobei
für ein optimales Wachstum der Bereich von 50 bis 60° C besonders bevorzugt ist. Die Anwendung niedrigerer
Temperaturen führt zu einer Verlangsamung des Wachstums.
Zu hohe Konzentrationen von einigen der genannten Kohlenstoff- und Energiequellen, wie Methanol, können
für das Wachstum der gemischten Kultur der Mlkroorga- *>
nisffien inhibierend oder sagaf toxisch sein. Aus diesem
Grund sind sie zu vermelden.
Das Gärungsverfahren kann diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden. Ein kontinuierliches»
Verfahren ist besonders dann geeignet, wenn ein nledfiger
Alkohol, wie Methanoi oder Äthanol, als Kohlen· stoff- und Energiequelle verwendet wird, da die Zufuhr
solcher Ausgangsstoffe leicht kontrollierbar Ist. Ein dls-
:, dann teinn
Ip Mjsehung'mlt Wjasse'r^vepiinden ,\f\\i einer Sterllislerijng,'
pcjef,;iff Mfäohun.g- mjt, efnejn mineralischen
Medfunfuhd'einer, SterII|s|erHng zuführen, wobei auch
Kombinationen ,diesen ,yerschjedenen' Zuführungsverfahren
möglich sind. "Üblicherweise wird der oxidierte
Kohlenwasserstoff getrennt· zugeführt,^y/e\\ jdadurch die
Kontrolle seiner Konzentration Im^Gärgefäß erleichtert
wirf. Im allgemeinen sollte-die Konzentration des oxldleften^ohjenwasserstbffsjnxleq
GärgefäßJbei 2,5 bis· 35 Gew.-96,vbevdrzugt 10 bisf15 Gew'.-fctHegen, j
Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt In einem'
wäßrigen Wachstumsmedium, .^as em wäßriges Mineraisaizmedium,
die Kohlenstoff- üad Energiequelle, molekularen
Sauerstoff und eine Impfung der gemischten thermophilen Bakterienkultur enthält.
Das Wachstum der Mikroorganismen. kann bei der
Gärung durch Steuerung der Zuführung des oxidierten Kohlenwasserstoffs geregelt werfen. Die Zuführungsgeschwindigkeit der Kohlenstoff- und Energiequelle
sollte so eingestellt werfen, daß die dem Gärungsgefäß zugeführte Menge im wesentlichen gleich ist mit der
Geschwindigkeit des Verbrauchs durch die Mikroorganismen, so daß eine nennenswerte Anreicherung in dem
Gärgefäß, Insbesondere von Irgendwelchen toxischen Materialien, vermieden wird.
Man kann eine befriedigende Überwachung der Gärungsbedingungen auch durch Bestimmung des nicht
umgesetzten Ausgangsstoffs In dem Abgang aus dem Gärungsgefäß erreichen, wobei dieser Abgang zweckmäßigerweise
0 bis 0,2 Gew.-% des oxidiertet? Kohlenwasserstoffs
enthalten soll.
Die Verweilzelt der mikrowellen Zellen In dem Gärgefäß
Hegt bei einem kontinuierlichen Verfahren unter solchen
Bedingungen im allgemeinen In der Größenordnung
von 2 bis 4 Stunden, obwohl auch kürzere oder längere Verweilzeiten brauchbar sind.
Die bei der Erfindung verwendete gemischte thermophlle
Bakterienkultur bedarf für ihren Wachstum zusätzlich
zu der Kohlenstoff- und Energiequelle mineralische Nährstoffe und eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff.
Die Stickstoffquelle kann eine beliebige stickstoffhaltige
Verbindung sein, die in der Lage Ist, Stickstoff In
einer für den Stoffwechsel der Mikroorganismen verwendbaren Form abzugeben. Für diesen Zweck kann
zwar eine Vielzahl von organischen Stickstoffquellen verwendet werfen, wie Proteine und Harnstoff, doch werden
in der Rtfgel anorganische Stlcksteffquellen benutzt,
da Ihre Verwendung wirtschaftlicher und einfacher ist.
Unter den anorganischen stickstoffhaltigen Verbindungen sind z.Z. Ammoniak oder Ammoniumhydroxid
besonders bevorzugt, Andere typische Verbindungen dieser Art sind Ammoniumsalze wie Ammoniumcarbonat,
Arnrnonlufflclträt, Ammonlumphospbat, Ammoniumsulfat
und Ammonlumpyrophösphat. Die Verwendung
von gasförmigem Ammoniak Ist besonders zweckmäßig, da man es einfach durch das wäßrige Gärungsmedlum In
den gewünschten Mengen hindurchleiten kann.
Das pH der wäßrigen mikrowellen Gafungsfnischung
Hegt Im allgemeinen Im Bereich von 5,5 bis 7,5, wobei
der Bereich von 6 bis 7 bevorzugt Ist. Die Zuführung von
Ammoniak tragt dazu bei, um den gewünschten pH-Wert einzustellen, da sonst die Neigung zur Verschiebung
des pH-Wertes des wäßrigen Mediums zum leicht sauren Bereich besteht. Selbstverständlich hangt der
bevorzugte pH-Bereich fDr Mikroorganismen im allgemeinen In einem gewissen Ausmaß von dem verwendeten
Medium ab, so daß bei Änderung des mineralischen Mediums eine Verschiebung des bevorzugten pH-Bereichs
eintreten kann.
Außer Sauerstoff. Stickstoff und einer Kohlenstoff- und Energiequelle benötigen die Mikroorganismen zu
Ihrem Wachstum bestimmte mineralische Nährstoffe, die
dem Wachstumsmedium in den erforderlichen Mengen und Verhältnissen zugeführt werden müssen, um eine
maximale Assimilation des oxidierten Kohlenwasserstoffs durch die Zellen bei der mlkroblellen Umwandlung
zu erreichen.
Zu derartigen mineralisch«?·" Nährstoffen gehören eine
Quelle für Phosphat oder eine andere Phosphorverbindung sowie Ionen von Magnesium, Calcium, Natrium,
Mang2n, Molybdän und Kupfer. Ein Beispiel für ein mineralisches Nährstoffmedium, das hler als »FM-12«
bezeichnet wird und das für das Gärverfahren geeignet Ist, Ist nachstehend angeführt. Dieses Medium enthält
zusätzlich eine Lösung von Spurenelementen.
FM-12-Medium
Menge
H3PO4 (85%) | 2 ml |
KCI | 1 g |
MgSO4 · 7H2O | 1,5 g |
CaCl2 · 2H2O | 0,2 g |
NaCl | 0,1g |
Lösung mineralischer | |
Spurenelemente | 5 ml |
destilliertes Wasser | zur Ergänzung |
auf 1 Liter |
Menge
CuSO4 · 5H2O | 0,06 g |
KI | 0,08 g |
FeCl3 ■ 6H2O | 4,80 g |
MnSO4 ■ H2O | 0,30 g |
Na2MoO4 2H2O | 0,20 g |
ZnSO4-TH2O | 2,00 g |
HjBO3 | |
H2SO+(konz.) | 3 ml |
destilliertes Wasser | zur Ergänzung |
auf 1 Liter |
Es können auch andere Konzentrationen des mineralischen
Mediums verwendet werden, und die Beispiele zeigen
derartige Aosfuhrungsformen.
Sowohl bei dem diskontinuieriicnen ab auch bei dem
kontinuierlichen Verfahren wird die gesaeite Einrichtung
sterilisiert, wie der Reaktor oder dfe tifietrjrlchtimg, die
Leitungen, die Einrichtungen fer dgt fättem/ftohrmit
und die Kühlung α. dgl. Die Stcffflateipi« kann in flbltcher
Weise durch Verwdung von Qampf von mindestens 121°C für mindestens einige Minuten, z.B. 15
Minuten, vor der Inbetriebnahme der Anlage erfolgen. Der sterilisierte Reaktor wird dann mit der Kultur In
Gegenwart von allen erforderlichen Nährstoffen, einschließlich des molekularen Sauerstoffs und des oxidierten
Kohlenwasserstoffs, geimpft.
Die Anlage kann so ausgestattet sein, daß Einrichtungen vorhanden sind, mit denen man die Zelldichte, das
pH, den Gehalt an gelöstem Sauerstoff, die Konzentration
an oxidiertem Kohlenwasserstoff in der Gärungsmischung, die Temperatur und die Zuführungsgeschwindigkeiten
messen kann. Bei der z. Z. bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die Ausgangsstoffe sterilisiert, bevor sie In das Gärungsgefäß eingeführt werden.
Wenn der oxidierte Kohlenwasserstoff eine Verbindung Ist, die In der Lage Ist, andere Materlallen zu sterilisieren,
wie beispielweise Äthanol oder Methanol, kann
es vorteilhaft sein, diese Komponente anderen Strömen, wie z. B. den mineralischen Medien, in sterilisierenden
2" Mengen zuzusetzen, und dadurch eine getrennte Hltzesterllislerung
zu vermelden.
Die Zugabe von Antischaummittel zu der Gärungsmischung
Ist nicht erforderlich und sollte deshalb vermieden werden, da Antischaummittel wie Silikone nachteilig
for den gelösten Sauerstoffgehalt bei den erwünschten
hohen Gärungstemperaturen sein können und ein langsameres
Wachstum der Organismen oder sogar Ihr Absterben zur Fp'ye haben können. Der durch die gemischte
thermophlle Bakterienkultur erzeugte Schaum Ist für das
Wachstum der Mikroorganismen nicht schädlich und trägt auf jeden Fall dazu bei, einen hohen Gehalt an gelöstem
Sauerstoff In dem System aufrechtzuerhalten. Wie leicht verständlich Ist, werden durch die Schaumbildung
große Grenzflächen für die Berührung zwischen Gas und Flüssigkeit gebildet. Dadurch kann die Gärung als solche
verbessert werden und auch hinsichtlich des Wärmeüberganges, der Gleichförmigkeit und der Vermeidung der
Überhitzung von einzelnen Stellen tritt eine Verbesserung ein.
Es Ist selbstverständlich möglich, bei der Gärung
harmlose schaumblldende Substanzen, wie bestimmte Detergenzlen, Insbesondere nlcht-ionlsche Detergenzlen,
zu verwenden, um eine zusätzliche Schaumbildung anzuregen, doch Ist dieses üblicherweise weder notwendig
noch erwünscht.
Die Isolierung der mlkroblellen Zellen kann In üblicher
Welse erfolgen, wie z. B. durch Ansäuern des Abgangs
aus der Gärung z. B. auf ein pH von etwa 4 und Erwärmen des angesäuerten Abgangs auf eine Temperatur, die
ausreichend zum Abtöten der Mikroorganismen, aber nicht hoch genug Ist, um das Proteinprodukt zu schlügen.
Eine derartige Temperatur Hegt beispielsweise bfJ
etwa 80° C, Der Abgang kann dann zentrifugiert, gewaschen
und zur Isolferäng der mitafoMejfefr Zeilen erneut
zentrifugiert werden. DTe Zellen können dann Behandelt
werden, um eine Auflösung hervorzurufen, so daß die
Isolierung des Proteins und anderer Materialien aus der Zelle beschleunigt wird. Bei der Gärung entstehen auch
einige erwünschte Nebenprodukte, die aus dem Abgang
aus dem Gäningsgefflfl isoliert werden können. Diese
extrazellularen Produkte können für die Wirtschaftlichkeit
des gesamten Verfahrens wichtig sein, da es sich zum Teil um wertvolle Produkte handelt wie Polysaccharide,
Aminosäuren wie Glutaminsäure, Enzyme und
Vitamine.
" quelle fur Menschen und Tiere. FDr dfe Verwendung als
menschliche Nahrung können die Zeilen noch behandelt
ίο
werden, um Ihren Gehalt an Nukleinsäuren herabzusetzen,
wogegen eine solche Behandlung bei tierischen Nährstoffen nicht erforderlich erscheint.
Pslsplcl I
Es wurde eine kontinuierliche Gärung unter Verwendung
der gemischten thermophllen Kultur gemäß der Erfindung durchgeführt. Ein 7-Llter-Gärgefäß, das mit
einer belüftungseinrichtung, einem Rührer, einer Einrichtung
zur Überwachung des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff und Einrichtungen für das Messen und die
Steuerung der Temperatur und des ρί-i-Wertes der
Oärungsmlschung ausgerüstet war, wurde mit etwa 500 ml einer Reaktionsmischung von einer vorherigen
Gärung mit der gemischten thermophllen Kultur und 10 ml Methanol zur Impfung beschickt. In den Reaktor
wurden außerdem 2 Liter des mineralischen Gärungsmediums FM-12 eingeführt.
rend Hjpsp« Versuchs gehalten, urid das pH wurde auf 6,2
bis 6.35 durch Zugabe der erforderlichen Ammonlumhydroxld-Lösung eingestellt. In das Gärgefäß wurde
außerdem Luft mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute während der Versuchsdauer eingeführt. Nach
6 Stunden wurde zusätzlich Im wesentlichen reiner Sauerstoff In das Gärgefäß mit der Geschwindigkeit von 0,5
Litern pro Minute eingeleitet. Die Sauerstoffzufuhr wurde auf 0,75 Liter pro Minute nach 118 Stunden, auf
1,5 Liter pro Minute nach 174 Stunden und auf 2 Liter pro Minute nach 190 Stunden erhöht.
Nach 22 Stunden wurde das mineralische MeJlum geän(*;rt In eine wäßrige Zusammensetzung, die 7,5
Vol.-% Methanol und zusätzlich das «FM-12« - Medium plus 0,75 g Kaliumchlorid, das Doppelte des normalen
Gehalts an mineralischen Spurenelementen, das Dreifache des normalen Mangangehalts (alles auf einer Pro-Llter-Basls),
aber kein Natriumchlorid enthielt. Nach 166 Stunden wurde das zugeführte Nährmedium geändert in
eine wäßrige Zusammensetzung, die 10 Vol.-* Metha-
nol, 2,5 ml Phosphorsäure (85*) pro Liter, 2g Kaliumchlorid
pro Liter, 1,75 g Magnesiumsulfat · 7H2O pro
Liter. 0,25 g Kalziumchlorid · 2H2O pro Liter, 20 ml Mangansulfat
■ H2O pro Liter als wäßrige Lösung (0,3 g/Liter)
und 35 ml der bereits charakterisierten Lösung von mineralischer.
Spurenelementen enthielt.
Die Zufuhrungsgeschwindigkeit des Mediums schwankte zwischen 700 ml pro Stunde bei 22 Stunden
bis 817ml pro Stunde bei 118 Stunden, 781 ml pro
to Stunde bei 166 Stunden und 763 ml pro Stunde bei 382 Stunden.
Es wurden Proben des Abganges aus dem Gärgefäß von Zelt zu Zelt entnommen, und die Zellen wurden aus
diesen Proben Isoliert. In der nachfolgenden Tabelle I wird der Zellgehalt als Trockengewicht der Zellen in
Gramm pro Liter und die errechnete Ausbeute angegeben. Die Tabelle enthält außerdem errechnete Werte für
die Produktivität in Gramm der Zellen pro Liter und pro Stunde.
2s Nach einer Versuchsdaücf voii eiwa 126 Stunden wurden
Proben der Gärmischung entnommen und für die Lyophlllslerung der mikrowellen Zellen nach bekannten
Arbeltswelsen vorbereitet. Diese lyophllislerten Proben wurden für die spätere Verwendung für einen Gärungsversuch
aulbewahrt. Sie dienten außerdem für die Hinterlegung bei der bereits genannten Stelle.
Es wurden außerdem periodisch Proben aus der Gärungsmischung für die mikroskopische Untersuchung
der mikrowellen Zellen zur Feststellung ihrer morphologlschen Struktur entnommen. Diese mikroskopische
Untersuchung zeigte, daß die gemischte thermophlle Bakterienkultur aus einem großen grampositiven
gekrümmten Stäbchen, einem großen gramnegativen Stäbchen und einem kleinen gramnegativen Stäbchen
bestand. Gelegentlich wurde ein großes grampositives (nichtgekrümmtes) Stäbchen beobachtet, doch wurde
angenommen, daß es sich hierbei um eine vorübergehende Variante des großen gekrümmten grampositiven
Stäbchens handelt.
Zeit, h
Venveilzeit
Zeit, h
Zeit, h
Zellen <■>
g/I
g/I
Feststoffe <b>
g/l
g/l
Zellenausbeute <c>
%
%
Produktivität (■·>
g/I/h
g/I/h
46 | 118 | 166 | 190 | 286 | 358 |
2,36 | 2,27 | 2,38 | 2,83 | 2,33 | 2,43 |
26,36 | 27,13 | 27,04 | 35,21 | 35,53 | 35,57 |
26,82 | 27,66 | 27,87 | 35,5 | 36,66 | 36,76 |
44,7 | 46,1 | 46,47 | 44,4 | 45,8 | 45,9 |
11,4
11,7
15,7
15,1
<·> Zur Ermittlung dieses Wertes wurde eine 10-ml-Probe aus dem Abgang des Reaktors über
Nacht bei 100° C verdampft, und von dem Gewicht des Rückstands wurde das Gewicht der
mineralischen Feststoffe, die in 10 mi des Mediums enthalten sind, abgezogen.
<*> Dieser Wert wurde erhalten* indem eine 100-ml-Prbbe des Abgangs aus dem Reaktor zentrifugiert
wurde, die erhaltenen Feststoffe in destilliertem Wasser erneut suspendiert würden und
diweSuspensioüenwiederzentrinigieitwünleimddieeHialfcnenFeststoffeübwNacttbieiiOÖ^C
getrocknet wurden. :
<c> Dieser Wert wurde erhalten durch Teilen der isolierten Feststoffe (g/l) durch das eingesetzte
■ w Dieser "Wert wurde erhalten durch Teilen der isolierten Feststoffe (g/l) durch die Verwejl·
zeitfh). --·.:-■ : -' -
Nach etwa einem Monat wurde eine Probe der lyophlllslerten
HTB-53 mikrowellen Kultur von dem Gärungsversuch von Beispiel I aseptisch In üblicher Welse geöffnet
und einem als »IM2« bezeichneten Gärungsmedium, das zusätzlich 0,5* Methanol enthielt, zugegeben. Die
Zusammensetzung des Mediums IM2 wird nachstehend angegeben.
IM2-Medlum
Komponente
Menge
KH2PO4
K2HPO4
MgSO4- 7H2O
CaClj· 2H2O
NaCI
(NH4J2SO4
K2HPO4
MgSO4- 7H2O
CaClj· 2H2O
NaCI
(NH4J2SO4
Lösung von mineralischen
Spurenelementen
Spurenelementen
destilliertes Wasser
2,0 | g |
3,0 | g |
0,4 | g |
0,04 | g |
0,1 | g |
2,0 | g |
0,5 | ml |
zur | Ergänzung |
auf | 1 Liter |
Tabelle II '·'
Zeit, h
Verweilzeit
Zeit, h
Zeit, h
Zellen
g/l
g/l
Feststoffe
g/l
g/l
Zellausbeute
Produktivität
g/l/h
g/l/h
'" Die Werte
Tabelle I.
Tabelle I.
70 166 190 214
2,60 2,70 2,63 2,64
34,33 33,56 33,87 34,84
34,44 35,4 34,55 35,52
43.6 44,2 43,2 44.2
13,2 13,1 13,1 13.5
Men in gleicher Weise ermittelt wie bei
Ein mit der wiederbelebten lyophillsierten Kultur
beschickter Reaktionskolben wurde durch Schütteln bei 55° C bebrütet. Nach 24 Stunden war ein Wachstum der
Kultur zu beobachten, und es wurden 5 ml der Mischung in 100 ml des Mediums IM2, das zusätzlich 1,5 Vol.-%
Methanol enthielt, übergeführt. Innerhalb 24 Stunden entwickelte sich ein gutes Wachstum, und es wurde
dann eine dritte Überführung In das gleiche Medium In
zwei Kolben vorgenommen, wobei jeder dieser Kolben 500 ml des IM2-Mediums und 1,5 Vol.-* Methanol enthielt.
Bei dieser dritten Überführung wurden 100 ml der Kultur In jeden der beiden Kolben übergeführt. Man Heß
nun die Kultur 32 Stunden wachsen, und dann wurde sie als Impfmaterial für eine kontinuierliche Gärung In der
Vorrichtung von Beispiel : verwendet. Das Gärgefäß wurde mit 1000 ml des FM-12-Medlums und 1000 ml des
Impfmaterials, dem 10 ml Methanol zugesetzt werden, beschickt. Die Temperatur wurde bei 55° C gehalten, und
das pH wurde auf 6,25 bis 6,4 durch kontinuierliche Zugabe einer Ammoniumhydroxidlösung eingestellt.
Zuerst wurde der Rührer mit einer Geschwindigkeit von 300 Upm betrieben, und Luft wurde mit einer Geschwindigkeit
von 0,5 Liter pro Minute eingeführt, wobei die Kultur Gelegenheit hatte, sich an das Gärgefäß zu
gewöhnen. Nach 7 Stunden wurde mit der kontinuierlichen Einführung eines Wachstumsmediums begonnen,
das die gleicht Zusammensetzung wie* das zuletzt charakterisierte
Wachstumsmedium Im Beispiel 1 hatte. Zusätzlich wurde die Luftgeschwindigkeit erhöht auf
2 Liter pro Minute und die Rührgeschwindigkeit auf 1000 Upm. Nach 30 Stunden wurde die Luftgeschwindlgkelt
reduziert auf 1,75 Liter pro Minute^ der Sauerstoff
wurde auf 0,75 Liter pro Minute reduziert und auf I Liter pro Minute nach 54 Stunden erhöht und nach 198 Stunden
auf 1,5 Liter erhöbt. Es wurden erneut Proben des Abgangs aus der Gärung von Zelt zu Zeit genommen,
um den Zellgehalt in Gramm pro Liter, bezogen auf das
Trockengewicht, am die Zeilansbeute und die Produktivität
bei der Gärung zu ermitteln. Die erhaltener* Werte
gehen aus der folgenden Tabelle Π hervor. 2Ö riUCii in uicäciTi ι an w'ürüci'i Wie uci uciäpici ι ΓπίΚΓΰ-skoplsche
Untersuchungen an Proben der entnommenen mikrowellen Kultur durchgeführt. Es wurden erneut
große grampositive gekrümmte Stäbchen und große und kleine gramnegative Stäbchen beobachtet. Nach einer
Versuchsdauer von 238 Stunden kam das Wachstum der Kultur zu einem Ende durch den Versuch, auf eine
höhere Alkoholkonzentration im Medium überzugehen.
In der folgenden Tabelle III sind analytische Daten enthalten, die die Im Beispiel 1 erhaltene mlkroblelle
Kultur In Ihrer chemischen Zusammensetzung charakterisieren. Die weitere Tabelle IV enthalt eine Analyse der
Aminosäuren, die aus einem anderen Gärversuch mit der gemischten thermophllen Bakterienkultur erhalten
wurde. Zum Vergleich ist In diese Tabelle auch eine Analyse der Aminosäuren aus einem Versuch mit einem
reinen thermophllen Mikroorganismus, der bei der eingangs
beschriebenen Isolierung der thermophllen Mikro-Organismen aus der Bodenprobe gewonnen worden war.
Chemische Analyse der mikrobiellen Zellen Zellen aus einem Versuch mit HTB-53
Rohes Protein (a\ Gew.-%
Asche, Gew.-%
Aminostickstoff, Gew.-%
Kohlenstoff, Gew.-%
Wasserstoff, Gew.-%
Stickstoff, Gew.-%
Phosphor, Gew.-%
Phosphor, Gew.-%
Kalium, Gew.-%
Kalzium, Gew.-%
Natrium, Gew.-%
Natrium, Gew.-%
Eisen, ppm
Zink, ppm
Mangan, ppm
itfipfer, ppm
Zink, ppm
Mangan, ppm
itfipfer, ppm
« Stickstoffgehalt 03,7) - 6,25
85,63 9,19
13,4
44,7 6,79
13,7 1,71 0,91 0,26 0,1
<0,01
1300 55,8 126 20
Tabelle IV | Methanol gewachsenen | Nicht-essentielle Aminosäuren | 5,65 | Ihermophilen Bakterienkulturen: | Gemischte Kultur | 5,76 | Chemische |
Aminosäurengehalt von aus | Produkts | Alanin | 3,39 | Vergleichswerte"1«' (HTB-42) | 4,90 | Vergleichswerte'" | |
Gramm pro loo Gramm des | Reine Kulturen | Arginin | 6,50 | Chemische | 5,67 | ||
(HTB-7) | Asparaginsäure | 3,71 | 75 | 1,22 | 104 | ||
Glycin | 10,47 | 83 | nicht | 118 | |||
Essentielle Aminosäuren | 5,37 | Glutaminsäure | 1,26 | 96 | bestimmt | 141 | |
Leucin | 4,56 | Histidin | 2,32 | 34 | 2,79 | 36 | |
Isoleucin | 5,54 | Prolin | 2,09 | 34 | 2,78 | 36 | |
Lysin | 1,50 | Serin | 2.72 | ||||
Methionin | nicht | Essentielle Aminosäuren | 30,88 | 90 | 0,89 | 88 | |
Cystin | bestimmt | zusammen | 66,27 | 80 | 5,46 | 88 | |
2,95 | Aminosäuren zusammen | 85,63 | 80 | 88 | |||
Threonin | 2,68 | Rohprotein | 43 | 6,19 | 90 | ||
Phenylalanin | 2,55 | 91 | 3,01 | 121 | |||
Tyrosin | 0,60 | 6,26 | |||||
Tryptophan | 5,13 | 4,19 | |||||
Valin | 10,69 | ||||||
1,22 | |||||||
2,38 | |||||||
1,75 | |||||||
32,19 | |||||||
67,88 | |||||||
84,4 | |||||||
ι" Der chemische Vergleichswert ist bezoeen auf den Gehalt an essentiellen Aminosäuren von Ei als Basis »100« für das
gleiche Gewicht von Protein.
121 Bezogen auf den Mittelwert von fünf Versuchen mit der reinen thermophiien Bakterienkultur.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß der Prozent- zeigen die chemischen Vergleichswerte, daß das Produkt
satz der gesamten essentiellen Aminosäuren für das Pro- so von der gemischten Kultur vom Standpunkt der Ernähdukt
der gemischten Kultur etwas höher Ist (47%) als das rung doppelt so gut ist als das Produkt aus der reinen
Produkt aus der reinen Kultur (46%). Wenn außerdem Kultur, bezogen auf den nächsten niedrigsten chemldle
essentiellen schwefelhaltigen Aminosäuren durch sehen Vergleichswert einer essentieller. Aminosäure.
Zugabe von synthetischem Methionin ergänzt werden.
Zugabe von synthetischem Methionin ergänzt werden.
Claims (1)
- ,Fermentation von Offerten' Koh,!er>wa^erstoffeff als Kohlenstoff^uqd Energiequelle mlttejs MlKroorganlsmenbe! einer Tempfiratyf γόη 45b"|s"65"C In wpßrlgem MecJJum In Gegenwartie|per;St|cftstoffquelle und mineralischer Nährstoffe, sowie" Isolierung des Proteins einschließlich der anderenV-MaterialJen aus den erhaltenen Zellen, dadurch- gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus die Bäkterfenmischkültur NRRL B-8158 verwendet. > ' -Diese Erfindung betrifft das. Im Patentanspruch angegebene Verfahren. tIm Rahmen der Bemühungen zur. Behebung der EiwelQknapphelt sind biosynthetische Versuche durchge- M führt worden, um auf biologischem Wege Einzellprotein durch das Wachstum von Mikroorganismen auf kohlenstoffhaltigen Substraten herzustellen.Die für solche Verfahren verwendeten Kohlenstoff- und Energiequellen sollten in großem Umfang und zu niedrigen Preisen zur Verfügung stehen und sollten gleichförmig und sicher In dem Sinneseln, daß sie keine schädlichen Rückstände in dem eiweißhaltigen Produkt nach der mikrowellen Umwandlung hinterlassen. Man hat schon Erdölkohlenwasserstoffe als Kohlenstoff- und Μ Energiequelle verwendet, doch traten hler In der Praxis Schwierigkelten auf, wie die mangelnde Löslichkeit dieses Rohstoffs in Wasser, ein hoher Verbrauch an Sauerstoff und angeblich auch Spuren von krebserregenden Stoffen, die mit den Erdölausgangsstoffen eingeführt x werden und an dem Proteinprodukt haften.Bei anderen Verfahren hat man oxidierte Kohlenwasserstoffderivate als Ausgangsstoffe verwendet, da diese Materlallen wasserlöslich sind und sich deshalb leichter handhaben lassen, so daß die mikrowellen Umwandlun- *° gen Im wesentlichen Im wäßrigen Medium durchgeführt werden. Solche Ausgangsstoffe sind leicht zugänglich, z. B. aus Erdöl, Erdgas, verschiedenen Verfahren zur Aufarbeitung von Abfallen, durch Umwandlung von Methan, aus der Vergärung von verschiedenen Getreide- 4S arten und aus der trocknen Destillation von Holz. Solche oxidierten Kohlenwasserstoffe stehen In großem Umfang zur Verfügung und sind relativ billige Ausgangsstoffe für Gärungsverfahren. Gegenüber den Kohlenwasserstoffen besitzen die oxidierten Kohlenwasserstoffe bei ihrer Ver- x wendung als Ausgangsstoffe für die Gärung den Vorteil, daß der Sauerstoffbedarf wesentlich geringer Ist.Ein anderes schwieriges Problem, das der kommerziellen Verwendung der Verfahren zur Herstellung von Ein· zellprotein einschränkend entgegenstand, bestand in der 5S Notwendigkeit, die Gärung bei Temperaturen von etwa 20 bis 50* C, bevorzugt nicht über etwa 35* C, durchzuführen. Mlkroblelle Umwandlungen! sind exotherme OxI-datlonsreakilonen, bei denen große Wärmemengen frei werden. Es muß deshalb aus dem Gärungsmedium kon- M tinuleflich und beständig die Warme abgeführt werden, well sonst die Gefahr einer überhitzung des Systems besteht, wodurch die Mikroorganismen abgetötet werden oder Ihr Wachstum eingeschränkt wird, so daß die Gärung nicht mit der gewünschten Effizienz verläuft.Bei vielen derartigen Verfahren hat man sich um die Verwendung von Hefen als Mikroorganismen bemuht. Die Hefezellen sind Im allgemeinen etwas größer als die te}leT, d,a IrJJFZeIJeJ)'!!*! ^llgenje^^neJT jjOjjeien Gehalt ai'RoJpiqtefn haben, alsdir^He^Hen, Pje$ jst-(JaRMf z'yn}c|^ffl}Rre|][^dftß'dJe. Heje
Anteil ajl <nlcttt- protelnartfgen/BaJ4nia|ejiattep |i| Ίΐΐτεη Zejjeft entjj^^pjjpie^Bakteriefl^ftrKn^be^nlcht nur efnen- beachtljch' höheren* Gehalt a^eojiten^ ijrotefnv sondern enthalten JflSftg auch höhere Anteile, tier; für die Ernähning,wjchtlgen. schwefelhaltigen*Aminosäuren und 'von'Lysln! «'**"■' .v ·!' - - "Es bestellt deshalbcler Wunsch nach Bakterien, die ein i^ches/Wachstumjüid eine hohe Produktivität bei relativ' norien GärungstemperaVaren besitzen, Dt& Verwendung einer* Hohen Gärungstemperatur bedeutet, daß weniger Wärmejentfernt werden muß, daß ein geringerer apparativer1 Aufwand.für: die Kühlung erfgryerllch Ist und daß'schlleßllch. geringere-Wärmemengen zugeführt werden müssen für die Sterilisation, die Koagulation und die Trennung. Von Interesse ist fernerhin, daß die Gefahr einer Kontaminierung mit anderen Mikroorganismen bet Verwendung von hohen Gärungstemperaturen stark reduziert winL Aus diesen Gründen ist es sehr erwünscht, thermophile oder thermotolerante Bakterien für die industrielle Herstellung von Einzellprotein zur Verfügung zu haben.Es wurde nun eine besonders vorteilhafte gemischte thermophile Bakterienkultur fur die Herstellung von Einzellprotein gefunden. Diese Bakterienkultur enthält folgende drei Bakterienarten:
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19772754072 DE2754072C2 (de) | 1977-12-05 | 1977-12-05 | Herstellung von Einzellprotein |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19772754072 DE2754072C2 (de) | 1977-12-05 | 1977-12-05 | Herstellung von Einzellprotein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2754072A1 DE2754072A1 (de) | 1979-06-13 |
DE2754072C2 true DE2754072C2 (de) | 1983-05-05 |
Family
ID=6025320
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19772754072 Expired DE2754072C2 (de) | 1977-12-05 | 1977-12-05 | Herstellung von Einzellprotein |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2754072C2 (de) |
-
1977
- 1977-12-05 DE DE19772754072 patent/DE2754072C2/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NICHTS-ERMITTELT |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2754072A1 (de) | 1979-06-13 |
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---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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Free format text: DIE BEZEICHNUNG LAUTET RICHTIG: HERSTELLUNG VON EINZELLPROTEIN |
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8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: HITZMANN, DONALD OLIVER, BARTLESVILLE, OKLA., US |
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D2 | Grant after examination | ||
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8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |