DE2037763C - Verfahren zur biotechnischen Her Stellung von I Tryptophan - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Her Stellung von I TryptophanInfo
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Description
Glukose 8 g
KH2PO4 0,1g
MgSO4-TH2O 0,05g
(NH(MSO4 0,35g
Der durch Zugabe von NaOH auf 7,0 eingestellte pH-Wert geht nach der Sterilisation auf 6,7 zurück
Man läßt den Mikroorganismus 24 Stunden, bei 28° C wachsen und gießt ihn dann in 41 eines Nähnnediums
der gleichen Zusammensetzung, das sich in einem Fermentationsgefäß aus Glas befindet. Das Fennentationsgefäß wird bei 28° C gehalten, mit 800 Umdr./
Min. gerührt und in einer Geschwindigkeit von lV/V/Mki. belüftet Der pH-Wert wird durch
periodische Zugabe von sterilem Calciumcarbonat gesteuert und bei 6,0 bis 6,5 gehalten.
Von der 24. Stunde an werden in stündlichen Zeitabständen 25 y Anthranilsäure pro Milliliter zugegeben.
Nach 72stündiger Fermentation haben sich 1675 y L-Tryptophan pro Milliliter gespeichert, die nach den
herkömmlichen Holzkohleabsorptionselutionsverfahren isoliert werden.
Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wird unter Verwendung des gleichen Nähnnediums wiederholt. Beginnend nach 24 Stunden und in stündlichen Zeitabständen, werden 25 γ Anthranilsäure und 3Oy
Ammoniumsulfat pro Milliliter zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation haben sich 2686 y
L-Tryptophan pro Milliliter gespeichert.
Eine Kultur des Bacillus subtilis S-IO, ATCC 21336,
wird von einem Schrägnährbodenagar gespült und zum Impfen von 100 ml eines Nähnnediums mit der
im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung verwendet. Nach 24 Stunden, bei 28 0C, wird das Medium
in ein Gefäß gegeben, das 41 des gleichen Mediums enthält. Die Kultur wird bei 800 Umdr./Min. gerührt
und in einer Geschwindigkeit von 1 V/V/Min, belüftet. Nach 24 Stunden werden 5e/0 des Vorkulturvolumens in ein Gefäß gegeben, das ein Medium der
nachstehenden Zusammensetzung enthält:
Glukose 7 g
(NHJ2SO4 0,7g
KH2PO4 0,2g
MgSO4-7HtO 0,5g
Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,7. Die Behandlungsbedingungen für die Kultur sind
die gleichen wie für die Vorkultur, jedoch wird der pH-Wert durch Zugabe von CaCO, bei 5,8 bis
is gehalten. Nach 16stündigem Wachstum wird als Vorläufer Indol stundlich zu den Zeiten und in den
Mengen zugegeben, die in der nachstehenden Tabelle angegeben werden.
16 bis 19 Stunden 100 y/ml
20 bis 24 Stunden 150 y/ml
25 bis 31 Stunden 125 y/ml
32 bis 42 Stunden 100 y/ml
43 bis 45 Stunden 150 y/ml
*5 48 bis 62 Stunden 100 y/ml
68 bis 69 Stunden 100 y/ml
80 bis 86 Stunden 60 y/ml
zu den verschiedenen Stunden nach Beginn der
16 Stunden 57 y/ml
24 Stunden 1826 y/ml
36 Stunden 4460 y/ml
48 Stunden 6452 y/ml
60 Stunden 7444 y/ml
72 Stunden 9296 y/ml
84 Stunden 9064 y/ml
96 Stunden 10380y/ml
| L-Tryptophanherstellung aus Anthranilsäure oder | II | III | Indol mit Hilfe verschiedener Mikrcorganismen | V | VI | VII |
| I | IV | °/o der theore | ||||
| Versuch | Vorläufer |
!.-Trypto
phan |
Verhältnis
Spalte V zu |
tischen, auf den
Vorläufer bezoge |
||
|
Mikroorga-
njcrniiG |
Menge des
Vorlaufp»re |
erhalten | Spalte IV | nen Ausbeute an | ||
| ν Ui iciui ei 9 | L-Tryptophan | |||||
| Beispiel 1 | Anthra- | 1675 y/ml | 1.4 | 93 | ||
| ATCC 21 336 | Beispiel 2 |
nusaurc
Anthra |
1200 y/ml | 2 686 y/ml | 2,24 | 150 |
| ATCC 21 336 | nilsäure | 1200 y/ml | ||||
| Beispiel 3 | Indol | 10 380y/mI | 1,82 | 104 | ||
| ATCC 21 336 | USA.-Patentschrift | Indol | 5695 y/ml | 154 mg | 1,46 | 83 |
| NRRL 2583 | 2 999 051 Beispiel 3 | 105 mg | ||||
| britische Patentschrift | Indol·) | 10,4 g | 1,73 | 99 | ||
| ATCC 12 783 | 846 521 Beispiel 1 | 6g | ||||
| französische Patent | Indol*) | 1 700 mg/I | 1.7 | 97 | ||
| Micrococcus | schrift 1 437 998, | 1000 mg/1 | ||||
| luteus 240-1 | Beispiel 8 | |||||
| französische Patent | Indol | 1 600 mg/1 | 1.6 | 91 | ||
| Micrococcus | schrift 1 437 998, | 1000 mg/1 | ||||
| luteus 240-1 | . Beispiel 7 | |||||
| französische Patent | Anthra | 860 mg/1 | 0,86 | 57 | ||
| Micrococcus | schrift 1 437 998 | nilsäure | 1000 mg/1 | |||
| luteus F-13 | Beispiel 1 | |||||
In der vorstehenden Tabelle sind die theoretischen, auf den Vorläufer Indol oder Anthranilsäure bezogenen Ausbeuten des erfindungsgemäßen Verfahrens
den besten Ausbeuten bekannter Verfahren gegen
übergestellt. Dabei wurde unberücksichtigt gelassen, 5 ger ist
daß bei einigen bekannten Verfahren neben Indol beträchtliche Mengen dl-Serin als zweiter Vorläufer
eingesetzt wurden, so daß die tatsächliche erreichte Ausbeute in diesen Fällen wesentlich gerin-
Claims (1)
- Patentanspruch · Dieser, durch Mutation des Bacillus subtilis erhaltene' Mikroorganismus kann L-Tryptophan in den her-Verfabren zur biotechnischen Herstellung von köinmlichen, für die L-Tryptophan-Fermentation vonL-Tryptophan durch aerobes Züchten von Mikro- Mikroorganismen geeigneten Medien erzeugen. DiesesOrganismen in eine assimilierbare Kohlenstoff- S Medium kann natürliche oder künstliche Kohlenstoff-und Stickstoffquelle, Mineralsalze und Indol oder und Stickstoffquellen erhalten. Höhere Ausbeuten anAnthranilsäure enthaltenden Nährmedien bei hier- L-Tryptophan werden jedoch in den sogenanntenfür üblichen pH-Werten und Temperaturen, da- synthetischen Medien erzielt, in denen natürlichedurch gekennzeichnet, daß man den Substanzen, wie beispielsweise Pepton, Hefeextrakt,Bacillus subtilis S-IO, ATCC 21 336, einsetzt. io Rindfieischextrakt oder Maisquellwasser, fehlen. Dadie synthetischen Medien wirtschaftlicher sind, isti bei dem vorliegenden Verfahren die Kombination desBacillus subtilis S-IO, ATCC 21 336, mit einem syn-Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren thetischen preiswerten Medium von besonderem Vorzur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan 15 teil im Hinblick auf die technische Herstellung,
durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in eine Bei der Durchführung des in den nachstehenden assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, Mine- Beispielen eingehender beschriebenen Verfahrens wird ralsalze und Indol oder Anthranilsäure enthaltenden der Bacillus subtilis S-IO5ATCC 21 336,24 bis 96Stun-Nährmedien bei hierfür üblichen pH-Werten und de» unter aeroben Bedingungen in einem Kultur-Temperaturen, ao medium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- undL-Tryptophan ist eine Substanz von großem Nähr- Stickstoffquelle, lebenswichtige Mineralsalze sowie wert als essentielle Aminosäure. Ihr Fehlen verursacht Indol oder Anthranilsäure als Vorläufer enthält, bei ernsthafte pathologische Zustände. Viele Jahre hin- einem pH-Wert zwischen etwa 5 und 8 und einer durch war es jedoch nicht möglich, L-Tiyptophan in Temperatur zwischen 20 und 400C fermentiert. Nach industriell verwertbaren Verfahren herzustellen. Die »$ Beendigung der Fermentation liegen die erzielten AusHerstellung von Aminosäuren durch Fermentation beuten in einem Bereich von 1500 bis 11 000 yTryptowird nur in einer begrenzten Anzahl von Fällen in- phan pro Milliliter Medium und mehr, je nach der dustrieU durchgeführt, und zwar vor allem deshalb, Zusammensetzung des Mediums sowie den ausgeweil die Mikroorganismen die Aminosäuren nicht in wählten Zeit- und Temperaturbedingungen,
bedeutenden Mengen speichern. Bei einigen Amino- 30 Die Mutante Bacillus subtilis S-10, ATCC 21 336, säuren wurde eine Speicherung durch Verwendung wurde unter Verwendung von 5-MethyItryptcphan auxotroper Mutaaten erzielt. Die Tatsache, daß die (5-MT). einem Tryptophanhomologen, das nicht in Mikroorganismen keine Aminosäuren speichern, wurde bakteriellen Proteinen enthalten ist, jedoch die Bildung durch die Gegenwart von Rückkopplungssystemen der bei der Synthese von Tryptophan auftretenden erklärt, die die Erzeugung von Aminosäuren auf die 35 Enzyme in der Regel unterbindet, erhalten,
durch die Zellen geforderte Menge beschränken. 10 ml des synthetischen Mediums M-40 mit derUm ungehemmte Mutanten zu erhalten, d. h., nachstehenden Zusammensetzung, die 200 γ 5-MTMutanten, bei denen L-Tryptophan die bei seiner pro Milliliter enthalten, wurden in eine PetrischaleErzeugung beteiligten enzymatischen Systeme nicht gegeben (Durchmesser: 9 mm). Anschließend wurdehemmt, wurden Stämme isoliert, die gegenüber 40 eine zweite Schicht aus 2,5 ml des gleichen Mediums,Tryptophanantimetaboliten beständig waren (H. A. 2 ml einer Bakterien-Suspension von Bacillus subtilisA d e 1 b e r g, J. Bacteriol., Bd. 76, 1958, S. 326). und 0,5 ml einer 1000 γ 5-MT pro Milliliter enthalten-Es sind auch bereits Verfahren zur Herstellung von den Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei 280C L-Tryptophan durch aerobes Züchten von Mikro- zeigten sich Kolonien, die gegenüber 5-MT resistent Organismen in eine assimilierbare Kohlenstoff- und 45 sind und von denen einige einen Hof aus Unter-Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaltenden Nähr- kolonien nichtresistenter Bakterien bildeten. Diejenigen medien bei hierfür üblichen pH-Werten und Tempera· Kolonien, welche die Unterkolonie bildeten, sind Muturen bekannt, bei denen die Nährmedien auch Indol tanten mit der Fähigkeit, L-Tryptophan in dem Kulturoder Anthranilsäure als Vorläufer enthalten (USA.- medium zu speichern. Aus diesen resistenten Mutanten Patentschrift 2 999 051, britische Patentschrift 846 521 50 wird der Stamm Bacillus subtilis S-10, ATCC 21 336, und französische Patentschrift 1 437 998). Die bei welcher für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet diesen Verfahren erhaltenen Ausbeuten waren jedoch wird, ausgewählt,
noch nicht besonders gut. Das synthetische Medium M-40 hat die nachstehendeDer Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Zusammensetzung:bekannte biotechnische Herstellung von L-Tryptophan ss wu pQ q 1 „unter Anwendung von Indol oder Anthranilsäure als MeSO · 7H O 005 βVorläufer so zu gestalten, daß höhere Ausbeuten als /j^jj \\jq * 0*35 „bisher erhalten werden und eine industrielle Herstel- Asparagin4 · 015 glung möglich ist. Glukose l'gDiese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch 60 Leitungswasser" Z/. V. V. Z/. Z/. Z.auf 100ml
gelöst, daß man bei dem Verfahren zur biotechnischen
Herstellung von L-Tryptophan durch aerobes Züchtenvon Mikroorganismen in ch~ assimilierbare Kohlen- Beispiel 1
stoff- und Stickstoffquelle, Mineralsalze und Indol oderAnthranilsäure enthaltenden Nährmedien bei hierfür 65 Eine Kultur des Bacillus subtilis S-10, ATCC 21336, üblichen pH-Werten und Temperaturen den Mikro- wird von einem Schrägnährbodenagar gespült und Organismus Bacillus subtilis S-10, ATCC 21 336, ein- zum Impfen von 100 ml eines Nährmediums der nachsetzt, stehenden Zusammensetzung verwendet:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19702037763 DE2037763C (de) | 1970-07-30 | Verfahren zur biotechnischen Her Stellung von I Tryptophan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19702037763 DE2037763C (de) | 1970-07-30 | Verfahren zur biotechnischen Her Stellung von I Tryptophan |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2037763A1 DE2037763A1 (en) | 1972-02-03 |
| DE2037763C true DE2037763C (de) | 1973-04-19 |
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