DE2037763A1

DE2037763A1 - L-tryptophan - from bacillus substilis s-10

Info

Publication number: DE2037763A1
Application number: DE19702037763
Authority: DE
Inventors: Joseph Ernst Appiano Gentile Como; Pagani Hermes Sesto S. Giovanni Mailand; Thiemann (Italien). P
Original assignee: Gruppo Lepetit S.P.A., Mailand (Italien)
Priority date: 1970-07-30
Filing date: 1970-07-30
Publication date: 1972-02-03

Abstract

L-Tryptophan is produced in high yield by cultivating Bacillus subtilis S-10 (a 5-methyltryptophan-resistant, tryptophan-producing mutant) for 24-96 hrs. under aerobic conditions in a culture medium which contains an assimilable C source, an assimilable N source, mineral salts and, as L-tryptophan precursor, indole or anthranilic acid. Best yields are obtained when the cultivation is carried out in synthetic media.

Description

Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan. Process for the production of L-tryptophan.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von ;-Tryptophan durch Fermentation. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessert es Fermentationsverfahren, bei dem man L-Tryptophan in hohen, bisher nie durch wirtschaftlich brauchbare Verfahren erzielten Ausbeuten erhält. The present invention relates to the production of; -Tryptophan by fermentation. In particular, the invention relates to an improved fermentation process, in which one L-tryptophan in high, so far never by economically viable methods obtained yields.

L-ryptophan ist eine Substanz von großem Nährwärt als essentielle Aminosäure. Ihr Fehlen verursacht ernsthafte pathologische Zustände. Viele Jahre hindurch war es jedoch nicht möglich, L-Tryptophan in industriell verwertbaren Verfahren herzustellen. Die Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation wird noch nicht industriell druchgeführt, mit Ausnahme~einer begrenzten Anzahl von Fällen, und zwar vor allem deshalb, weil die Mikroorganismen die Aminosauren nicht; in bedeutenden Mengen speichern. 3ei einigen Amino -säuren wurde eine Speicherung durch Verwendung auxotroper Mutanten erzielt; im Falle von L-Tryptophan gelang diese Speicherung jedoch nie. Die Tatsache, daß die Mikroorganismen keine Aminosäuren speichern, wurde durch die Gegenwart von Rückkopplungsystemen erkält, die die Erzeugung von Aminosäuren auf die durch die Zellen geforderte Menge beschränken. L-ryptophan is a substance of great nutritional value than essential Amino acid. Their absence causes serious pathological conditions. Many years however, it was not possible to use L-tryptophan in industrially usable processes to manufacture. The production of amino acids through fermentation is not yet industrially, with the exception of ~ a limited number of cases, namely mainly because the microorganisms do not have the amino acids; in significant Save quantities. For some amino acids storage through use auxotropic mutants obtained; in the case of L-tryptophan, this storage succeeded but never. The fact that the microorganisms no amino acids save was caught cold by the presence of feedback systems that were generating of amino acids to the amount required by the cells.

Um ungehemmte Mutanten zu erhalten, das heißt, Mutanten, bei denen Il-Tryptophan die bei seiner Erzeugung be -teiligten enzymatischen Systeme nicht hemmt, wurden stämme isoliert, die gegenüber Tryptophanantimetaboliten beständig waren. (H.A. Adelberg, J. Bacteriol., Bd. 76, S. 326, 1958). To get uninhibited mutants, that is, mutants in which Il-tryptophan does not affect the enzymatic systems involved in its generation inhibits, strains were isolated which are resistant to tryptophan antimetabolites was. (H.A. Adelberg, J. Bacteriol., Vol. 76, p. 326, 1958).

Ferner wurde in früheren Veröffentlichungen und Patenten die Zugabe von Vorläufern zu den Fermentationsmedium beschrieben, so beispielsweise die Zugabe von traubensäure, Indol, Indolmilchsäure. Anthranilsäure; die durch diese Verfahren erzielten verbesserten Ausbeuten sind jedoch auf einer sehr geringen Prozentsatz beschränkt. Furthermore, in previous publications and patents the addition of precursors to the fermentation medium described, so for example the addition of grape acid, indole, indole lactic acid. Anthranilic acid; by this procedure However, the improved yields achieved are on a very low percentage limited.

Es wurde nun gefunden, daß man durch Fermentation eines durch Mutation von Bacillus subtilis erhaltenen Mikroorganismus sowie unter Verwendung eines Fermentationsmediums, das als Vorläufer Anthranilsäure oder Indol enthält, viel höhere Ausbeuten an L-Tryptophan erhält als bisher. It has now been found that fermentation by mutation microorganism obtained from Bacillus subtilis and using a fermentation medium, which contains anthranilic acid or indole as a precursor, much higher yields of L-tryptophan received than before.

Der durch Mutation des Bacillus subtilis erhaltene Mikroorganismus, der im vorliegenden die Abhürzungsbezeichnung S-10 erhält, kann L-Tryptophan in der herkömmlichen, fur die Fermentation von Mikroorganismen geeigneten medien erzeugen. Dieses Medium kann natürliche oder künstliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten. Es wure je -doch überraschenderweise festgestellt, daß höhere Ausbeuten an L-Tryptophan in den sogenannten synthetischen Nedien erzielt werden, in denen natürliche Substanzen, wie beispielsweise Pepton, Hefeextrakt. Rindfleischextrakt oder Maisquellwasser, fehlen. Dieses Ergebnis ist neu und stellt eines der Kennzeichen der vorliegenden Erfindung dar. Es ist tatsächlich bekannt, daß die synthetischen Medien wirtschaftlicher sind. Daher ist bei dem vorliegenden Verfahren die Kombination eines Mikroorganismus, der L-Tryptophan erzeugt, mit einem synthetischen preiswerten Medium von be -sonderem Vorteil im Hinblick auf die technische Herstellung. The microorganism obtained by mutating the Bacillus subtilis, which is given the abbreviation S-10 in the present case, L-tryptophan in conventional media suitable for the fermentation of microorganisms. This medium can be natural or artificial sources of carbon and nitrogen contain. It was found, however, surprisingly, that higher yields of L-tryptophan in the so-called synthetic media, in which natural substances such as peptone, yeast extract. Beef extract or corn steep water, miss. This result is new and represents is one of the characteristics of the present invention. Indeed, it is known that the synthetic media are more economical. Therefore, with the present Method combining a microorganism that produces L-tryptophan with a synthetic inexpensive medium of particular advantage in terms of technical Manufacturing.

Das in den nachstehenden Beispielen eingehender be -schriebene Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Mutante S-10 24-96 Stunden unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Sti ck stoffquell e, lebenswichtige Mineralsalze sowie Indol oder Anthranilsäure als Vorläufer enthält, bei einem pH-Wert zwischen etwa 5 und 8 und einer Temperatur zwischen 20 und 400C fermentiert. Nach Beendigung der Fermentation liegen die erzielten Ausbeuten in einem Bereich von 1500 bis 11000 /ml und mehr, je nach der Zusammensetzung des Ne -diums sowi e den ausgewählten Zeit- und Temperaturbedingungen. The procedure described in more detail in the examples below is characterized in that a strain of the mutant S-10 24-96 hours under aerobic conditions in a culture medium that is an assimilable piece of material e, contains essential mineral salts as well as indole or anthranilic acid as precursors, at a pH between about 5 and 8 and a temperature between 20 and 400C fermented. After the fermentation has ended, the yields achieved are in a range of 1500 to 11000 / ml and more, depending on the composition of the Ne -diums as well as the selected time and temperature conditions.

Die Mutante S-10 wurde unter Verwendung von 5-Methyltryptophan (5-MT), eines Tryptophanhomologen, das nicht in bakteriellen Proteinen enthalten ist, jedoch die Bildung der bei der Synthese von Tryptophan auftretenden Enzyme unterbindet, erhalten. The mutant S-10 was created using 5-methyltryptophan (5-MT), of a tryptophan homologue that is not found in bacterial proteins, however prevents the formation of the enzymes involved in the synthesis of tryptophan, obtain.

10 ml des synthetischen Mediums M 40, die 200 γ /ml 5-MT enthalten, wurden in eine Petrischale gegeben (Durch -messer : 9 mm). Anschließend wurde eine zweite Schicht aus 2,5 ml des gleichen Mediums, 2 ml einer Bakterien-Suspension von Bacillus subtilis und 0,5 ml einer 1000 γ /ml 5-MT enthaltenden Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei 280C zeigten sich Kolonien, die gegnüber 5-MT resistent sind, und von denen einige einen Hof aus Unterkolonien nichtresistenter Bakterien bildeten. Die Kolonien, die die Unterkolonie bildeten, sind Mutanten mit der Fähigkeit, L-Tryptophan in dem Kulturmedium zu speichern. Aus diesen resistenten Mutanten wird die Kultur S-10, welche für das erfindungsgemäße Ver -fahren verwendet wird, ausgewählt. 10 ml of the synthetic medium M 40 containing 200 γ / ml 5-MT, were placed in a Petri dish (diameter: 9 mm). Then a second layer of 2.5 ml of the same medium, 2 ml of a bacterial suspension from Bacillus subtilis and 0.5 ml of a solution containing 1000 γ / ml 5-MT admitted. After incubation at 280C, colonies were found that were resistant to 5-MT are, and some of which have a court of sub-colonies more non-resistant bacteria formed. The colonies that made up the sub-colony are mutants with the ability to Store L-tryptophan in the culture medium. These resistant mutants become the culture S-10, which is used for the method according to the invention, is selected.

Das synthetische Medium M-40 hat die nachstehende Zusammensetzung: KH2P04 0,1 g MgSO4#7H2O 0,05 g (NH4)2SO4 0,35 g Asparagin 0,15 g Glukose lg Leitungswasser auf 100 ml Beispiel 1: Eine S-10-Kultur wird von einem Schrägnährbodenagar gespült und zum Impfen von 100 ml eines Nährmediums der nachstehenden Zusammensetzung verwendet: Glukose 8g KH2PO4 0,1 g NgSO4. 7H20 0,05 g (NH4)2SO4 0,35 g Leitungswasser auf 100 ml Der durch Zugabe von NaOH auf 7,0 eingestellte pH-Wert geht nach der Sterilisation auf 6,7 zurück. Man läßt den Mikroorganismus 24 Stunden bei 280C wachsen und gießt ihn dann in 4 Liter eines Nährmediums der gleichen Zusammen -setzung, das sich in einem Fermentationsgefäßt aus Glas befindet. Das Fermentationsgefäß wird bei 28°C gehalten, mit 800 U/Min. gerührt und in einer Geschwindigkeit von 1 V/V/m belüftet. Der pH-Wert wird durch periodische Zugabe von sterilem Kalziumcarbonat gesteuert und bei 6,0-6,5 gehalten. The synthetic medium M-40 has the following composition: KH2P04 0.1 g MgSO4 # 7H2O 0.05 g (NH4) 2SO4 0.35 g asparagine 0.15 g glucose lg tap water to 100 ml Example 1: An S-10 culture is rinsed from an agar slant and used to inoculate 100 ml of a nutrient medium of the following composition: Glucose 8g KH2PO4 0.1g NgSO4. 7H20 0.05 g (NH4) 2SO4 0.35 g tap water to 100 ml The pH adjusted to 7.0 by adding NaOH goes after the sterilization back to 6.7. The microorganism is allowed to grow at 280 ° C. for 24 hours and is poured him then in 4 liters of a nutrient medium of the same composition, which is located in a fermentation vessel made of glass. The fermentation vessel is held at 28 ° C, at 800 rpm. stirred and at a speed of 1 V / V / m ventilated. The pH is adjusted by periodically adding sterile calcium carbonate controlled and held at 6.0-6.5.

Von der 24. Stunde an werden in stündlichen Zeitab -ständen 25 γ /ml Anthranilsäure zugegeben. Nach 72-stündiger Fermentation haben sich 1675 γ/ml L-Tryptophan gespeichert, die nach den herkömmlichen Holzkohleabsorptions-Elutionsverfahren isoliert werden. From the 24th hour onwards, 25 γ / ml of anthranilic acid was added. After 72 hours of fermentation there were 1675 γ / ml L-tryptophan is stored following the traditional charcoal absorption-elution process to be isolated.

Beispiel 2: Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wird unter Verwendung des gleichen Nährmediums wiederholt. Das mit dem Stamm S-10 beimpfte Fermentationsmedium wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 behandelt. Beginnend nach 24 Stunden und in stündlichen Zeitabständen werden 25 t/ml Anthranilsäure und 30 g/ml Ammoniumsulphat zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation haben sich 2686 7rXml L-Tryptophan gespeichert.Example 2: The procedure of Example 1 is carried out using of the same nutrient medium repeatedly. The fermentation medium inoculated with strain S-10 is treated under the same conditions as in Example 1. Starting after 24 hours and at hourly intervals, 25 t / ml anthranilic acid and 30 g / ml ammonium sulphate added. At the end of the fermentation, 2686 7rXml L-tryptophan stored.

Beispiel 3: Eine S-10-Kultur wird von einem Schrägnährbodenagar gespült und zum Impfen von 100 ml eines Nährmediums mit der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung verwendet. Nach 24 Stunden bei 2800 wird das Medium in ein Gefäß gegeben, das 4 Liter des gleichen Mediums enthält. Die Kultur wird bei 800 U/Min. gerührt und in einer Geschwindigkeit von 1 V/V/m belüftet. Nach 24 Stunden werden 5 % des Vorkultur; volumens in ein Gefäß gegeben, das ein Medium der naöh-- -stehenden Zusammensetzung enthält: Glukose 7g (NH4)2S04 0,7 g KH2PO4 0,2 g MgSO4#7H2O 0,5 g Leitungswasser auf 100 ml Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,7.Example 3: An S-10 culture is rinsed from agar slant and for inoculating 100 ml of a nutrient medium with the composition given in Example 1 used. After 24 hours at 2800, the medium is placed in a vessel containing the 4th Liters of the same medium. The culture is at 800 rpm. stirred and in ventilated at a speed of 1 V / V / m. After 24 hours, 5% of the preculture; volume in a vessel, which is a medium of the near-standing composition contains: Glucose 7g (NH4) 2S04 0.7 g KH2PO4 0.2 g MgSO4 # 7H2O 0.5 g tap water to 100 ml. After sterilization, the pH was 6.7.

Die Behandlungsbedingungen für die Kultur sind die gleichen wie für die Vorkultur, mit Ausnahme des pH-Werts, der durch Zugabe von CacO3 bei 5,8-6 gehalten wird. Nach 16-stündigem Wachstum wird als Vorläufer (precursor) Indol stündlich zu den Zeiten und in den Mengen zugegeben, die in der nachstehenden Tabelle angegeben werden. The treatment conditions for the culture are the same as for the preculture, with the exception of the pH value, which was kept at 5.8-6 by adding CacO3 will. After 16 hours of growth, indole becomes the precursor every hour added at the times and in the amounts indicated in the table below will.

Indol-Zugabe Stunden 16-19 100 20-24 150 25-31 125 32-42 100 43-45 150 48-62 100 68-69 100 80-86 60 Die Konzentration an L-Tryptophan in dem Medium zu den verschiedenen Stunden ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich. Indole addition hours 16-19 100 20-24 150 25-31 125 32-42 100 43-45 150 48-62 100 68-69 100 80-86 60 The concentration of L-tryptophan in the medium for the different hours can be seen from the following table.

Tryptophan-Probe Stunden γ/ml 16 57 24 1826 36 4460 48 6452 60 7444 72 9296 9064 96 10380 Tryptophan sample hours γ / ml 16 57 24 1826 36 4460 48 6452 60 7444 72 9296 9064 96 10380

Claims

Claims: 1. Process for the production of L-tryptophan, thereby characterized in that the mutant S-10 of Bacillus subtilis 24-96 hours under cultivates aerobic conditions in a culture medium containing an assimilable carbon source, an assimilable nitrogen source, mineral salts and as a precursor indole or Contains anthranilic acid.

2. The method according to claim 1, characterized in that the Cultivation is carried out in a synthetic medium.

3. The method according to any one of claims 1 and 2, characterized in that that the pH of the fermentation medium during the cultivation between about 5 and 8 holds.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that the fermentation is carried out at a temperature between 20 and 40 ° C, preferably between 25 and 300C.

5. The method according to claim 1, characterized in that the trunk S-10 is obtained by culturing a Bacillus subtilis in the presence of 5-methyltryptophan developed in a nutrient medium.