DE2037763B - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren thetischen preiswerten Medium von besonderem Vorzur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan 15 teil im Hinblick auf die technische Herstellung,
durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in eine Bei der Durchführung des in den nachstehenden assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, Mine- Beispielen eingehender beschriebenen Verfahrens wird ralsalze und Indol oder Anthranilsäure enthaltenden der Bacillus subtilis S-IO, ATCC 21 336,24 bis 96Stun-Nährmedien hei hierfür üblichen pH-Werten und den unter aeroben Bedingungen in einem Kultur-Temperaturen. 20 medium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und L-Tryptophan ist eine Substanz von großem Nähr- Stickstoffquelle, lebenswichtige Mineralsalze sowie wert als essentielle Aminosäure. Ihr Fehlen verursacht Indol oder Anthranilsäure als Vorläufer enthält, bei ernsthafte pathologische Zustände. Viele Jahre hin- einem pH-Wert zwischen etwa 5 und 8 und einer durch war es jedoch nicht möglich, L-Tiyptophan in Temperatur zwischen 20 und 40⁰C fermentiert. Nach industriell verwertbaren Verfahren herzustellen. Die 25 Beendigung der Fermentation liegen die erzielten AusHerstellung von Aminosäuren durch Fermentation beuten in einem Bereich von 1500 bis 11 000 γ Tryptowird nur in einer begrenzten Anzahl von Fällen in- phan pro Milliliter Medium und mehr, je nach der dustriell durchgeführt, und zwar vor allem deshalb, Zusammensetzung des Mediums sowie den ausgeweil die Mikroorganismen die Aminosäuren nicht in wählten Zeit- und Temperaturbedingungen,
bedeutenden Mengen speichern. Bei einigen Amino- 30 Die Mutante Bacillus subtilis S-10, ATCC 21 336, säuren wurde eine Speicherung durch Verwendung wurde unter Verwendung von 5-Methyltryptophan auxotroper Mutanten erzielt. Die Tatsache, daß die (5-MT), einem Tryptophanhomologen, das nicht in Mikroorganismen keine Aminosäuren speichern, wurde bakteriellen Proteinen enthalten ist, jedoch die Bildung durch die Gegenwart von Rückkopplungssystemen der bei der Synthese von Tryptophan auftretenden erklärt, die die Erzeugung von Aminosäuren auf die 35 Enzyme in der Regel unterbindet, erhalten,
durch die Zellen geforderte Menge beschränken. 10 ml des synthetischen Mediums M-40 mit der Um ungehemmte Mutanten zu erhalten, d.h., nachstehenden Zusammensetzung, die 200y 5-MT Mutanten, bei denen L-Tryptophan die bei seiner pro Milliliter enthalten, wurden in eine Petrischale Erzeugung beteiligten enzymatischen Systeme nicht gegeben (Durchmesser: 9 mm). Anschließend wurde hemmt, wurden Stämme isoliert, die gegenüber 40 eine zweite Schicht aus 2,5 ml des gleichen Mediums, Tryptophanantimetaboliten beständig waren (H. A. 2 ml einer Bakterien-Suspension von Bacillus subtilis A d e 1 b e r g, J. Bacteriol., Bd. 76, 1958, S. 326). und 0,5 ml einer 1000 γ 5-MT pro Milliliter enthalten-Es sind auch bereits Verfahren zur Herstellung von den Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei 28⁰C L-Tryptopban durch aerobes Züchten von Mikro- zeigten sich Kolonien, die gegenüber 5-MT resistent Organismen in eine assimilierbare Kohlenstoff- und 45 sind und von denen einige einen Hof aus Unter-Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaltenden Nähr- kolonien nichtresistenter Bakterien bildeten. Diejenigen medien bei hierfür üblichen pH-Werten und Tempera· Kolonien, welche die Unterkolonie bildeten, sind Muturen bekannt, bei denen die Nährmedien auch Indol tanten mit der Fähigkeit, L-Tryptophan in dem Kulturoder Anthranilsäure als Vorläufer enthalten (USA.- medium zu speichern. Aus diesen resistenten Mutanten Patentschrift 2 999 051, britische Patentschrift 846 521 50 wird der Stamm Bacillus subtilis S-10, ATCC 21 336, und französische Patentschrift 1 437 998). Die bei welcher für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet diesen Verfahren erhaltenen Ausbeuten waren jedoch wird, ausgewählt,
noch nicht besonders gut. Das synthetische Medium M-40 hat die nachstehende

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Zusammensetzung:

bekannte biotechnische Herstellung von L-Tryptophan 55 ^u pQ _{0 1}

unter Anwendung von Indol oder Anthranilsäure als MpSO * 7 H η n'ns

Vorläufer so zu gestalten, daß höhere Ausbeuten als (NH ) SO 0 35 ε

bisher erhalten werden und eine industrielle Herstel- χ «,„„.iL·· * _n\ e

. .. .. , . . Asparagin 0,15 g

lung möglich ist. Glukose Ie

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch 60 Leituneswasser auf 100 ml

gelöst, daß man bei dem Verfahren zur biotechnischen Leitungswasser auf 100 ml

Herstellung von L-Tryptophan durch aerobes Züchten

von Mikroorganismen in eine assimilierbare Kohlen- Beispiel 1
stoff- und Stickstoffquelle, Mineralsalze und Indol oder

Anthranilsäure enthaltenden Nährmedien bei hierfür 65 Eine Kultur des Bacillus subtilis S-10, ATCC 21336, üblichen pH-Werten und Temperaturen den Mikro- wird von einem Schrägnährbodenagar gespült und Organismus Bacillus subtilis S-10, ATCC 21 336, ein- zum Impfen von 100 ml eines Nährmediums der nachsetzt, stehenden Zusammensetzung verwendet:

037763

Glukose , go

KH₄PO₁ 0,1g

MgS(V7H₂O 0,05g

(NH₄)^Q₄ 0,35g

Leitungswisser auf 100 ml

Der durch Zugabe von NaOH auf 7,0 eingestellte pH-Wert geht nach der Sterilisation auf 6.7 zurück Man läßt den Mikroorganismus 24 Stunden bei 28° C wachsen und gießt ihn dann in 41 eines Nähriaediums der gleichen Zusammensetzung, das sich in einem Fermentationsgefäß aus Glas befindet Das Fermentationsgefäß wird bei 28 ⁰C gehalten, mit 800Umdr./ Min. gerührt und in einer Geschwindigkeit von 1 V/V/Min, belüftet Der pH-Wert wird dtrch periodische Zugabe von sterilem Calciumcarbonat gesteuert und bei 6,0 bis 6,5 gehalten.

Von der 24. Stunde an werden in stündlichen Zeitabständen 25 y Anthranilsäure pro Milliliter zugegeben. Nach 72stündiger Fermentation haben sich 1675 y L-Tryptophan pro Milliliter gespeichert, die nach den herkömmlichen Holzkohleabsorptionselutionsverfahren isoliert werden.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wird unter Verwendung des gleichen Nährmediums wiederholt. Beginnend nach 24 Stunden und in stündlichen Zeitabständen, werden 25 y Anthranilsäure und 3Oy Ammoniumsulfat pro Milliliter zugegeben. Nach Beendigung der Fermentation haben sich 2686 y L-Tryptophan pro Milliliter gespeichert.

Beispiel 3

Eine Kultur des Bacillus subtilis S-10, ATCC 21336, wird von einem Schrägnährbodenagar gespült und zum Impfen von 100 ml eines Nährmediums mit der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung verwendet. Nach 24 Stunden, bei 28° C, wird das Medium in ein Gefäß gegeben, das 41 des gleichen Mediums enthält. Die Kultur wird bei 800 Umdr./Min. gerührt

und in einer Geschwindigkeit von 1 V/V/Mjn. belüftet Nach 24 Stunden werden 5% des Yoritulturvoiumens in ein Gefäß gegeben, das ein Medium der nachstehenden Zusammensetzung enthält:

Glukose ,..., Tg

(NHJ₂SO₄ 0,7g

KH₂PO₄ 0,2 g

MgSO₄-7H₂O 0,5g

Leitungswasser auf 100 ml

Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,7. Die Behandlungsbedingungen für die Kultur sind die gleichen wie für die Vorkultur, jedoch wird der pH-Wert durch Zugabe von CaCO₃ bei 5,8 bis gehalten. Nach 16stündigem Wachstum wird als Vorläufer Indol stundlich zu den Zeiten und in den Mengen zugegeben, die in der nachstehenden Tabelle angegeben werden.

Indolzugabe

16 bis 19 Stunden 100 y/ml

20 bis 24 Stunden 150 y/ml

25 bis 31 Stunden 125 y/ml

32 bis 42 Stunden 100 y/ml

43 bis 45 Stunden 150 y/ml

48 bis 62 Stunden 100 y/ml

68 bis 69 Stunden 100 y/ml

80 bis 86 Stunden 60 y/ml

Die Konzentration an L-Tryptophan in dem Medium zu den verschiedenen Stunden nach Beginn der Züchtung ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich.

Tryptophangehalt im Nährmedium

16 Stunden 57 y/ml

24 Stunden 1826 y/ml

36 Stunden 4460 y/ml

48 Stunden 6452 y/ml

60 Stunden 7444 y/ml

72 Stunden 9296 y/ml

84 Stunden 9064 y/ml

96 Stunden 10380 y/ml

L-Tryptophanherstellung aus Anthranilsäure oder Indol mit Hilfe verschiedener Mikroorganismen

I	U	III	IV	V	VI	VII
						°/o der theore
Mikroorga nismus	Versuch	Vorläufer	Menge des Vorläufers	L-Trypto phan erhalten	Verhältnis Spalte V zu Spalte IV	tischen, auf den Vorläufer bezoge nen Ausbeute an
						L-Tryptophan
ATCC 21 336	Beispiel 1	Anthra	1200 y/ml	1 675 y/ml	1,4	93
		nilsäure
ATCC 21 336	Beispiel 2	Anthra	1200 y/ml	2 686 y/ml	2,24	150
		nilsäure
ATCC 21 336	Beispiel 3	Indol	5695 y/ml	10 380 y/ml	1,82	104
NRRL 2583	USA.-Patentschrift	Indol	105 mg	154 mg	1,46	83
	2 999 051 Beispiel 3
ATCC12 783	britische Patentschrift	Indol*)	6g	10,4 g	1,73	99
	846 521 Beispiel 1
Micrococcus	französische Patent	Indol*)	1000 mg/1	1 700 mg/1	1,7	97
luteus 240-1	schrift 1 437 998,
	Beispiel 8
Micrococcus	französische Patent	Indol	1000 mg/1	1 600 mg/1	1,6	91
luteus 240-1	schrift 1 437 998,
	Beispiel 7
Micrococcus	französische Patent	Anthra	1000 mg/1	860 mg/1	0,86	57
luteus F-13	schrift 1 437 998	nilsäure
	Beispiel 1

* Als zweiter Vorläufer wurde dl-Serin eingesetzt.

5 6

In der vorstehenden Tabelle sind die theoretischen, daß bei einigen bekannten Verfahren neben Inauf den Vorläufer Indol oder Anthranilsäure bezo- dol beträchtliche Mengen dl-Serin als zweiter Vorgenen Ausbeuten des erfindungsgemäßen Verfahrens läufer eingesetzt wurden, so daß die tatsächliche den besten Ausbeuten bekannter Verfahren gegen- erreichte Ausbeute in diesen Fällen wesentlich gerinübergestellt. Dabei wurde unberücksichtigt gelassen, 5 ger ist.

Claims (1)

1. ι 2

   Dieser, durch Mutation des Bacillus subtilis erhaltene

   Patentanspruch: Mikroorganismus tem» ^--Tryptophan ia den her-

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von kömmlichen, für die t-Tryptophan-Fermentation von

   L-Tryptophan durch aerobes Züchten von Mikro- Mikroorganismen geeigneten Medien erzeugen. Dieses

   Organismen in eine assimilierbare Kohlenstoff- 5 Medium kann natürliche oder künstliche Kohlenstoff-

   und Stickstoffquelle, Mineralsalze und Indol oder und Stickstoffquellen erhalten. Höhere Ausbeuten an

   Anthranilsäure enthaltenden Nährmedien bei hier- L-Tryptophan werden jedoch in den sogenannten

   für üblichen pH-Werten und Temperaturen, da- synthetischen Medien erzielt, in denen natürliche

   durch gekennzeichnet, daß man den Substanzen, wie beispielsweise Pepton, Hefeertrakt,

   Bacillus subtilis S-IO, ATCC 21 336, einsetzt. io Rindfleischextrakt oder Maisquellwasser, fehlen. Da

   die synthetischen Medien wirtschaftlicher sind, ist

   _ bei dem vorliegenden Verfahren die Kombination des

   Bacillus subtilis S-ίθ, ATCC 21 336, mit einem syn-