DE2161164A1 - Verfahren zur mikrobiologischen Her stellung von Protein sowie Verwendung des Verfahrensproduktes - Google Patents

Description

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PATE NT ANWÄLTE München: Frankfurt/M.:

Dipl.-Chem.Dr.D.Thomsen Dip!.-Ing. W. Welnkauff Oipl.-Ing. H. Tiedtke (Fuchshohl 71)

Dipl.-Chem. G. Bühling Dipl.-Ing. R. Kinne Dipl.-Chem. Dr, U. Eggers

8000 München 2

Kaiser-Ludwig-Platz6 9. Dezember 1971

Imperial Chemical Industries Limited
London, Großbritannien

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Protein sowie Verwendung des Verfahrensproduktes

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Proteinmassen, welche zur Verwendung als Nahrungsmittelergänzung für menschlichen oder tierischen Verbrauch geeignet sind. 209839/1002

Mündlich· Abritten. fntbftonder· durch Telefon, bedürfen schriftlicher Beitltlgimg

Bei dem Versuch, die gegenwärtige Weltknappheit an Protein zu mildern, sind kürzlich einige mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Proteinmassen durch Wachsen von Mikroorganismen auf verschiedenen kohlenstoffhaltigen Substraten vorgeschlagen worden. Es ist wünschenswert, daß solche Verfahren billige und leicnt verfügbare kohlenstoffhaltige Substrate verwenden sollten, eine hohe Proteinproduktionsrate ergeben sollten, und daß die erzeugten Massen eine geeignete Aminosäurenverteilung besitzen sollten.

Studien der Bakterien haben gezeigt, daß Stämme einiger Gattungen in der Lage sind, Methanol als Kohlenstoffquelle für ihr Wachstum auszunutzen. Jedoch wurden die proteinhaltigen Produkte, welche durch das Wachstum dieser Stämme auf Methanol erzeugt werden, nicht gewonnen.

Nunmehr wurden einige methanolausnutzende Bakterienstämme von Gattungen isoliert, welche offenbar bisher unbekannt waren und welchen die Namen Pseudomonas methylotropha, Pseudomonas rosea, Microcyclus polymorphum und Hyphomicrobium variabile gegeben wurden. Diese sind in der Lage, auf Methanol zu wachsen und ergeben eine hohe Produktionsrate an Rohprotein unter Erzeugung von Proteinmassen mit annehmbaren Aminosäuregehalten.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Proteinmassen und/oder anderen Fermentierungsprodukten, beispielsweise Aminosäuren wie Lysin und Methionin, geschaffen,

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wobei das Verfahren darin besteht, daß man Bakterien, welche einem oder mehreren methanolausnutzenden Stämmen der Gattungen Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphism, Hyphomierobium variabile und Pseudomonas rosea angehören, wobei die Eigenschaften dieser Gattungen nachstehend beschrieben werden, in einem wäßrigen Kulturmedium aerob kultiviert, welches eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganische Nährstoffe aufweist, und daß man die Proteinmassen und/oder andere erzeugte Fermentierungsprodukte gewinnt.

Auch wird erfindungsgemäß ein proteinhaltiges Produkt aus getrockneten Zellen von Bakterien geschaffen, welche einem oder Hehreren methanolausnutzenden Stämmen der Gattungen Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea angehören, wobei die Eigenschaften dieser Gattungen nachstehend beschrieben werden.

Auch wird erfindungsgemäß eine menschliche oder tierische Nährmasse aus einem oder mehreren Nährmitteln und einer proteinhaltigen Nährmittelergänzung geschaffen, wobei die Nährmittelergänzung getrocknete Zellen von Bakterien aufweist, welche einem oder mehreren methanolausnutzenden Stämmen der Gattungen Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea angehören, wobei die Eigenschaften dieser Gattungen nachstehend beschrieben werden.

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ZIDI

Ebenfalls werden erfindungsgemäß methanolausnutzende Stämme von Bakterien geschaffen, welche den Gattungen Pseudomonas nethylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea angehören, wobei die Eigenschaften dieser Gattungen nachstehend beschrieben werden.

Repräsentative Kulturen geeigneter Stämme der neu isolierten Gattungen sind hinterlegt worden bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, Großbritannien, und es sind ihnen die folgenden NCIB-Zustimmungsnummern gegeben worden:

Pseudomonas methylotropha Stämme WKM-3, WKM-I, SA, SB, SD, SE, SF, AS"¹, MP4, F16/1, FlG/2, riPI/Sh/37/1 und 2J/D/37; bzw. NCIB-Nummern 10508-15 und 10592-96.

Microcyclus polymorphum Stamm Pia 5 - NCIB-Nr. 10516 Hyphomicrobium variable Stamm S/30/4 - NCIB-Nr. 10517 Pseudomonas rosea Stämme MA2/3, BDD/3, MA3D/1, MWUA, MP1D/2,

MP3D/2, MP1/2, MA2/2, 2OD, MAI/5, MA3D/3, BDD/2, MPl, ChD, WS, MP3; bzw. NCIB-Nummern 10597-10612.

Die mikrobiologischen Eigenschaften der neu isolierten Gattungen, bestimmt nach mikrobiologischen Standardtests, sind die folgenden:

A. Pseudomonas methylotropha

Die allgemeinen Eigenschaften dieser Gattungen sind:

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-δ-1. Mikroskopische Morphologie (beim Wachsen auf Methanol-Mineralsalz-Agarplatten, oder in Methanol-Mineralsalz-Medium) : Gestalt - gerade Stäbchen; Länge - 0,8 bis 1,5 ^u; Breite - 0,3 bis 0,5 ju; Aggregate - Zellen treten einzeln und in Paaren auf; Beweglichkeit - wenn anwesend- durch polare Geißeln; Gramfärbung - gramnegativ, ebenmäßige Färbung, jedoch wird Färbung oft nicht gut aufgenommen} Intracellulare Ablagerungsprodukte - poly-ß-hydroxybutyrat wird'nicht erzeugt; Endosporen - nicht erzeugt; Kapseln nicht erzeugt; extracellularer Schleim - etwas erzeugt.

2. Kolonienmorphologie

a) auf Metnanol-Mineralsalz-Agarplatten, 2 Tage bei 37^QC inkubiert. Gestalt - kreisörmig; Größe - 1-2 mm Durchmesser; Eriiebung - konvex; Oberfläche - glatt; Kante vollständig; Gefüge - granular;.Dichte - dicht; Pigment grau-weiß; Konsistenz - butterännlich; Emulgierbarkeit gewönnlich schwierig zu emulgieren.

b) auf Nähragar ( 2 Tage bei 37°C) - Wachstum ist gewöhnlich sehr mangelhaft, nur sichtbar als transparenter Schleier oder als winzige, nadelspitzartige Kolonien eines Durchmessers von weniger als 0,5 mm.

3. Physiologische und biochemische Tests

a) Wachstum in Nährbrühe - kein Wachstum oder sehr mangelhaftes Wachstum, hauptsächlich an der Oberfläche«

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b) Gelatinestich - kein Wachstum oder Verflüssigung.

c) Reduktion von Nitraten - Nitrate zu Nitriten reduziert.

d) Beziehung zu Sauerstoff - aerob.

e) Indolproduktion - schwach positiv, schwache Indolproduktion.

f) Temperaturbeziehungen - kein Wachstun bei 4°C oder 12°C, gutes Wachstum bei 30⁰C und 37°C.

g) Stoffwechsel von Kohlehydraten (Test nach Hugh & Liefson) - wenn Wachstum erfolgt, ist er oxydativ.

h) Lipaseproduktion (Hydrolyse von "Tween 80") - negativ.

i) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) - negativ.

j) Ureaseproduktion - variabel, gewöhnlich posititv.

k) Schwefelwasserstoffproduktion - negativ.

1) Citratausnutzung (Citrattest nach Koser) - negativ.

m) Methylrottest - negativ.

n) Test nach Voges-Proskauer - negativ.

o) Wachstum in LaJonus-Milch - mangelhaft, geringe Säureproduktion.

p) Fluoresceinproduktion (Kings-Medium A) - nicht erzeugt.

q) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) - nicht erzeugt,

r) Antibiotische Empfindlichkeit - empfindlich gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin und Tetracyclin, beständig gegenüber Penicillin, Novobiocin und Oleandomycin, veränderliche Empfindlichkeit gegenüber Erythromycin und SuIfafurazol.

s) Wachstum auf Blutagar - geringes Wachstum, keine Haemolyse.

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t) Oxydasetest (nach Kovac) - positiv.

Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen - Die Kohlenstoffquellen, welche von den einzelnen Stämmen einer gegebenen Gattung ausgenutzt werden, variieren in gewissem Ausmaß. Im vorliegenden Fall besitzen die meisten Stämme ein sehr eingeschränktes Ernährungsspektrum und wachsen auf vielen Kohlenstoffquellen nicht gut. Methanol und Fructose werden von allen Stämmen, auf welche in dieser Beschreibung speziell Bezug genommen wird, ausgenutzt. Nach einer Anpassungsperiode über einige Subkulturen, können andere Kohlenstoffquellen angewandt werden.

Die Stämme mit den NCIB-Nummern 10508-15 und 10592-96, sind einander ähnlich und dürften Stämme der gleichen Gattung sein. Die allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme sind diegleichen wie diejenigen, welche für die Gattungen beschrieben sind, mit den folgenden unterscheidenden Merkmalen:

Stamm WKM-3 (WCIB.10508)

Quelle - Ästuarschlick. Es werden ausgenutzt Acetat, Butyrat, Propionat, Pyruvat, Succinat und Adipat als alleinige Quellen von Kohlenstoff und Energie. Katalase negativ, beständig gegen Erythromycin, empfindlich gegen SuIfafurazol.

Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Quelle - Astuarschlick. Es werden ausgenutzt Acetat, Butyrat, Propionat, Pyruvat, Succinat, Glutarat und Adipat als alleinige Kohlenstoff/Energie-Quelle. Urease wird nicht erzeugt, Katalase negativ, beständig-segen Erythromycin und SuIfafurazol.

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Stamm SA (NCIB 10510)

Quelle - Abwassers chlanun. Beständig gegen Erythromycin und Sulfafurazol. Katalase posititv.

Stamm SB (NCIB 10511)

Quelle - Abwasserschlamm. Katalase positiv, empfindlich gegen Erythromycin und Sulfafurazol.

Stamm SD (NCIB 10512)

Quelle - Abwasserschlamm. Katalase positiv-. Beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm SE (NCIB 10513)

Quelle - Abwasserschlamm. Katalase positiv, empfindlich gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm SF (NCIB 1051t)

Quelle - Abwasserschlamm. Katalase positiv, Urease negativ, empfindlich gegen Sulfafurazol, beständig gegen Erythromycin.

Stamm ASl (NCIB 10515)

Quelle - Aktivschiamm. Katalase positiv, empfindlich gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm MPM- (NCIB 1059 2)

Quelle - Wasserstaubecken. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm F16/1 (NCI3 10593) Quelle - Teichschlamm. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm F16/2 (NCIB 10591)

Quelle - Teichwasser. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

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Stamm MPl/Sh/37/1 (NCIB 10595)

Quelle - Wasserstaubecken. Katalase negativ, beständig gegen SuIfafurazol und Erythromycin.
Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Quelle Flußwasser. Katalase positiv, Urease negativ, empfindlich gegen SuIfafurazol und Erythromycin.

Ähnliche Stämme wie die oben beschriebenen, können aus mannigfachen' unterschiedlichen natürlichen Quellen isoliert werden, zu welchen Quellen Erdboden, faulende Vegetation, Teichwasser und Flußwasser gehören. Zu geeigneten Isolierungstechniken für das Gewinnen solcher Stämme, zählen das Ausstreifen auf Methanol-Minerals alz-Agarplatten von der Probe und das Abnehmen angemessener Kolonien zur weiteren Reinigung, oder statische Anreicherung oder Schüttelanreicherung in flüssiger Kultur (mit oder ohne laufende Subkulturen) im Methanol-Mineralsalz-Medium. Das Isolieren kann bei Temperaturen von 25 bis 45°C vollzogen werden, wird jedoch vorzugsweise bei 37°C und bei pH-Werten von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise von 6,5 bis 7,2, vollzogen.

Identität von Stämmen der MCIB-Nummern 10508-15 und 10592-96 Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme, verweisen sie, gemäß Bergeyls Manual of Determinative Bacteriology (7. Ausgabe), Herausgeber Breed, Murray & Smith, veröffentlicht von Williams &Wilkins, Baltimore 195 7, in die Gattung Pseudomonas. Beim Folgen über den Leitweg zu den Species dieser Gattung, ist in Bergey's Manual keine Species beschrieben, welche die oben beschriebenen Eigenschaften aufweist. In der Literatur findet

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- ίο -

man keine Bezugnahme auf Bakterien mit ähnlichen Eigenschaften.

Daraus ist zu schließen, daß diese Stämme der Gattung Pseudomonas bisher unbekannt waren. Die Unterschiede zwischen diesen Stämmen sind hinreichend untergeordnet, daß sie als Stämme der gleichen Gattung zu betrachten sind (ähnliche Variation zwischen Stämmen einer gegebenen Gattung, findet man bei anderen Pseudomonasgattungen, wie durch das Werk von R.T. Stanier, N.V. Palleroni, &M. Dondoroff "The aerobic pseudomonas: a taxonomic study", Journal of General Microbiology 1966, Band 43, Seite 159 demonstriert wird). In dieser Beschreibung sind die neuen Gattungen als Pseudomonas methylotropha bezeichnet.

B. Microcyclus polymorphum, Stamm Pla5 (NCIB-Nr. 10516)

Dieser Mikroorganismus ist in seiner mikrobiologischen Eigenschaft sehr verschieden von Pseudomonas methylotropha und von den in der Literatur bekannten, methanolausnutzenden Bakterien.

1, Mikroskopische Morphologie;

a) Methanol-Mineralsalz-Hefeextrakt-Agarplatten nach

3 Tagen Inkubation bei 37°C: Schmale, sehr gekrümmte, gramnegative Stäbchen, welche sich während des Wachstums an den Enden vereinigen und geschlossene Ringe

ο von etwa 1,5 Mikron Durchmesser bilden. Die Breite to

⁸⁰ der Stäbchen beträgt etwa 0,3 bis 0,5 Mikron. Es sind ■^ auch pferdefußförmige Gestaltungen, welche sich an den

ο Enden nicht vereinigt haben, und gekrümmte Stäbchen

*° sichtbar. Nicht beweglich, keine sichtbaren Lagerungsgranulen, keine erzeugten Sporen, keine Bildung von

- li -

Kapseln oder schätzbaren Mengen an Schleim.

. b) Nähragar - 3 Tage Inkubation bei 37°C: gramnegative Stäbchen, etwas größer als sie auf Methanol-Mineralsalz-Hefeextrakt-Agar gewachsen sind. Die Stäbchen sind gerade oder gekrümmt, treten einzeln auf und scheinen im allgemeinen keine geschlossenen Ringe oder Pferdefußgestalt zu bilden.

2. Kolonienmorphologie

a) auf Methanol-Mineralsalz-Agar und Hefeextraktplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Gestalt - kreisförmig; Größe - weniger als 1 mm Durchmesser; Erhebung konvex; Oberfläche - glatt; Kante - vollständig; Dichte - durchscheinend; Farbe - kremfarbigs Konsistenz - butterähnlich; Emulgierbarkeit - leicht emulgiert.

b) auf Nähragarplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Gestalt - kreisförmig; Größe - 1 bis 3 mm Durchmesser; Erhebung - konvex; Oberfläche - glatt; Kanten - vollkommen; Dichte - dicht; Pigment - kremfarbig bis braun, nicht wasserlöslich; Konsistenz - butterähnlich; Emulgierbarkeit - schwierig zu emulgieren.

3. Physiologische und biochemische Eigenschaften

a) Wachstum in Nährbrühe - Wachstum ziemlich homogen mit etwas Sediment, jedoch kein Häutchen.

b) Gelatinestich - Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.

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- - 12 -

c) Reduktion von Nitraten - Nitrate zu Nitriten reduziert.

d) Indolproduktion - Indol wird erzeugt (schwach positiv).

e) Temperaturbeziehungen - kein Wachstum bei 1 C oder 42⁰C. Optimale Temperatur 37°C.

f) Beziehung zu Sauerstoff - aerob bis gelegentlich anaerob.

g) Stoffwechsel von Kohlehydraten (Test nach Hugh & Liefson) - oxydativ mit etwas erzeugter Säure.

h) Stoffwechsel von verschiedenen Kohlenstoffquellen - es werden die folgenden Kohlenstoffquellen (von den getesteten) von diesem Stamm ausgenutzt: Methanol, Äthanol, Propanol, Acetat, Pyruvat, Oxalat, Succinat* Glutarat, Sucrose, Lactose, Glucose, Mannit, Ribose, Ribit, Xylose, Fructose, Hexan, Hexadecan, Serin.

i) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80) - negativ.

j.) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) - negativ.

k) Ureaseproduktion - negativ.

1) Schwefelwasserstoffproduktion - negativ.

m) Citratausnutzung (Citrattest nach Koser) - negativ.

n) Methylrottest - negativ.

o) Test nach Voges Proskauer - negativ.

p) Wachstum in Lackmusmilch - Wachsen, etwas Alkali erzeugt.

q) Fluorescinproduktion (Kings-Medium A) - nicht erzeugt.

r) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) - nicht erzeugt.

s) Antibiotische Empfindlichkeit - empfindlich gegen Chloramphenicol, Stroptomycin und Tetracyclin, beständig gegen Penicillin, Erythromycin, Sulfafurazol, Novobiocin und Oleandomycin. ⁽

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t) Wachstum auf Blutagar - Wachstum, jedoch keine Haemolyse. u) Oxydasetest nach Kovac - positiv. v) Katalasetest - positiv.

**· Quelle - Flußschlick

Identität des Stammes Pia 5 (WCIB 10516) Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stammes sind so, daß er ein Glied der Gattung Microcyclus gemäß Sergey's Manual of Determinative Bacteriology ist. Nur eine Art dieser Gattung ist in Sergey's Manual beschrieben und der Stamm NCIB 10516 ist von dieser Art insofern unterschiedlich, daß NCIB 10516 kleiner ist, bei 37°C gut wächst, und einen Wachstumsfaktor erfordert. In der Literatur findet sich keine Bezugnahme auf eine Art von Microcyclus, welche die gleichen Eigenschaften besitzt wie der Stamm NCIB Io516. Daraus wird geschlossen, daß dieser Stamm einer bisher nicht bekannten Art angehört.

In dieser Beschreibung ist diese Art als Microcyclus polymorphum bezeichnet.

C. Hyphomicrobium sp. Stamm S/30M (NCIB-Nr. 10517)

Dieser Mikroorganismus unterscheidet sich beträchtlich von den oben beschriebenen Stämmen und von Bakterien, welche in der Literatur dafür bekannt sind, daß sie Methanol als Kohlenstoff quelle ausnutzen.

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1. Mikroskopische Morphologie; (7 Tage Wachstum bei 30⁰C auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Platten): gramunterschiedliche, kurze, kräftige Stäbchen mit spitzen Enden. Größe 0,6 bis 1,0 Mikron Breite und 1,0 bis 1,5 Mikron Länge. Jeder Mikroorganismus kann 1 Granul (oder gelegentlich mehrere) Poly-^-hydroxybutyrat enthalten. Die Stäbchen erzeugen schmale Fäden von 0,2 bis 0,3 Mikron Breite, welche in der Länge variieren, an deren Ende jedoch sich eine Tochterzelle entwickelt, welche gelegentlich unter Bildung einer getrennten Einheit sich abspaltet.

2. Kolonienmorphologie: (7 Tage Wachstum bei 30⁰C auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Platten): kleine Kolonien (1 bis 2 mm Durchmesser)j mit kreisförmiger Gestalt und einem vollkommenen Rand, konvex, glatt, opak, krerafarbig·

3. Physiologie

a) Beziehung zu Sauerstoff: aerob.

b) Temperaturbeziehungen: optimale Temperatur 30⁰C, wächst bei 37°C. Kein Wachstum bei H⁰C oder 42⁰C,

c) Wachstum in Nährbrühe - Wachstum homogen, kein Häutchen oder Sediment.

d) Gelatinestich - Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.

e) Reduktion von Nitraten - Nitrate nicht zu Nitriten reduziert.

f> Indolproduktion - Indol nicht erzeugt.

g) Stoffwechsel von Kohlehydraten (Test nach Hugh & Liefson) - oxydativ mit erzeugter Säure.

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h) Stoffwechsel von verschiedenen Kohlenstoffquellen die folgenden Kohlenstoffquellen (von den getesteten) werden ausgenutzt: Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Formiatj Acetat, Propionat, Butyrat, Pyruvat, Oxa-_ lat, Succinat, Glutarat, Adipat, Sucrose, Lactose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit, Xylose, Fructose, Naphthalin, Benzoat, Hexadecan.

i) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80) - negativ.

j) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) - negativ.

k) Ureaseproduktion - positiv.

1) Schwefelwasserstoffproduktion - negativ.

m) Citratausnutzung (Citrattest nach Koser) - negativ.

n) Methylrottest - negativ.

o) Test nach Voges - Proskauer - negativ.

p) Wachstum in Lackmusmilch - Wachstum, alkalische Reaktion, etwas klumpenbildend.

q) Fluoresceinproduktion (Kings-Medium A) - Fluorescein nicht erzeugt.

r) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) - Pyocyanin nicht erzeugt.

s) Antibiotische Empfindlichkeit - empfindlich gegen Penicillin, Chloramphenicol, Oleandomycin, Streptomycin, Tetracyclin.

t) Wachstum auf Blutagar - Wachstum, jedoch keine Haemolyse,

u) Oxydasetest nach Kovacs - positiv.

v) Katalasetest - positiv.

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-IB-

U. Quelle - faulendes Silofutter

Identität des Stammes MCIB 10517

Dieser Organismus kann leicht als ein Glied der Gattung Kyphomicrobium identifiziert werden, wie diese in Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology beschrieben ist, doch hinsichtlich des Größenunterschiedes, der variierenden Reaktion gegenüber der Gramfärbung und anderer oben aufgeführter Eigenschaften, unterscheidet sich dieser Stamm von der einen Art, welche in Bergey's Manual beschrieben ist. In der Literatur findet man keine Bezugnahme auf eine Art von Hyphomicrobium, welche die gleichen Eigenschaften wie NCIB 10517 besitzt. Es ist daher zu schließen, daß der Stamm NCIB 10517 einer bisher nicht bekannten Art angehört .

In dieser Beschreibung wird die neue Art als Hyphomicrobium variabile bezeichnet.

D. Pseudomonas rosea

Die allgemeinen Eigenschaften dieser Art sind:

1. Mikroskopische Morphologie: von Zellen, welche in MeOH-Mineralsalz-Medium gewachsen sind. Große, gramnegative, gerade oder leicht gekrümmte Stäbchen, 2-3 μ lang und 1 μ breit, welche einzeln auftreten. Die Stäbchen sind durch polare Geißeln beweglich. Poly-.^;-hydroxybutyrat wird erzeugt und intracellular gelagert unter Bildung eines oder mehrerer gesonderter Lagergranulen. Sporen, Schleim und Kapseln sind nicht offensichtlich.

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2. Kolonienmorphologie

a) auf Methanal-Mineralsalz-Ägarplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Kreisförmige Kolonien mit konvexer Erhebung. Durchmesser 1 bis 2 mm, Kante vollständig, Oberfläche glatt. Die Kolonien werden leicht emulgiert und ihre Konsistenz ist butterähnlich. Es wird ein lachsfarbenrosa bis rotes, wasserunlösliches Pigment erzeugt.

b) auf Nähragarplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Die Kolonienmorphologie ist die gleiche wie diejenige, welche für das Wachstum auf Methanol-Mineralsalz-Agar beschrieben ist mit der Ausnahme, daß die Nähragarkolonien gewöhnlich etwas kleiner sind als die Methanol-Minerals alz-Agar-Kolonien.

3. Physiologie

a) Wachstum in Nährbrühe (nach 3 Tagen Inkubation bei 37°C): hauptsächlich am Boden des Rohres.

b) Gelatinehydrolyse: Gelatine wird in 7 Tagen nicht hydrolysiert.

c) Nitratreduktion: Nitrate werden im allgemeinen nicht zu Nitrit reduziert, obgleich Nitrat eine annehmbare Stickstoffquelle bildet.

d) Indolproduktion: Indol wird nicht erzeugt.

e) Temperaturbeziehungen: Optimaltemperatur 37⁰C, bei t°C in 7 Tagen kein Wachstum ersichtlich, in 7 Tagen bei 42°C Wachstum.

f) Test nach Hugh & Leifson (Glucose als Kohlenstoffquelle)

- Wachstum oxydativ mit etwas erzeugtem Alkali. 2 09 839/10 02

g) Oxydasetest - Oxydase negativ.

h) Katalasetest - Katalase positiv.

i) Methylrottest - negativ.

j) Test nach Voges - Proskauer - negativ.

k) Lackmusmilch - Wachstum, jedoch keine Erzeugung von Säure oder Alkali.

1) Produktion von Fluorescein und Pyocyanin in Kings-Medium (A und B) - Wachstum_s jedoch kein Pigment erzeugt .

m) Antibiotische Empfindlichkeit (unter Anwendung von "Oxoid", Markierung "Multodisks") - beständig gegen Penicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, SuIfafurazol, Novobiocin und Oleandomycin; empfindlich gegen Streptomycin und Tetracyclin.

n) Wachstum auf Blutagar - Wachstum, jedoch keine Haemolyse.

o) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80) - negativ.

p) Lecithinaseproduktion - unterschiedliche Reaktion.

q) Ureaseproduktion - unterschiedliche Reaktion.

r) Schwefelwasserstoffproduktion - negativ.

s) Citratausnutzung - unterschiedliche Reaktion.

Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen. - Zwischen den einzelnen Stämmen tritt eine gewisse Variation auf, doch im allgemeinen werden die folgenden Verbindungen als einzige Kohlenstoff/Energiequellen ausgenutzt: Methanol, Äthanol, Propanol, Formiat, Acetat, Pyruvat, Succinat, Glucose, Fructose, Arginin und Serin. Die

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folgenden Verbindungen werden nicht allgemein als einzige Kohlenstoff/Energie-Quellen ausgenutzt: Butanol, Propionat, Butyrat, Adipat, Methylamin, Dimethylamin, Äthylamin, Lactose, Mannit, Ribit, Xylose, Naphthalin, Phenol, Benzoat, Hexan, Aspartat, Alanin und Glycin.

Die Stämme mit den NCIB-Nummern 10597-10612 sind einander ähnlich und dürften Stämme der gleichen Art sein. Die allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme sind diegleichen wie diejenigen, welche oben für die Arten beschrieben sind, jedoch mit den folgenden unterscheidenden Merkmalen:

Stamm MA2/3 (HCIB 10597)

Wächst langsam bei ¹J⁰C, ist empfindlich gegenüber Novobiocin, jedoch nicht gegen Streptomycin; Formiat, Oxalat, Mannose oder Ribose werden nicht ausgenutzt, jedoch werden Glutarat, Citrat, Sucrose und Glutamat ausgenutzt. Quelle: Schlick von Fabrikplätzen, Lecithinase positiv, Urease positiv. Stamm BDD/3 (NCIB 1059 8)

Wächst langsam bei 4⁰C, ist empfindlich gegen SuIfafurazol und Novobiocin, jedoch nicht gegen Streptomycin oder Tetracyclin. Citrat oder Pyruvat werden nicht ausgenutzt, jedoch werden Butanol, Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Alanin, Glycin und Glutamat ausgenutzt. Urease positiv, Lecithinase negativ, Quelle: Hühnerdung.

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Stamm MA3D/1 (NCIB 10599)

Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose und Glutamat werden ausgenutzt. Lecithinase positiv, Urease positiv. Quelle:

Schlick von Fabrikplätzen. Citrat wird nicht ausgenutzt.

Stamm MWU/f (NCIB 10600)

Wächst langsam bei 4°C und nutzt Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Alanin, Glycin und Glutamat aus. Lecithinase positiv, Urease positiv, Citrat wird nicht ausgenutzt. Quelle:

Sumpfwasser.

Stamm MPlD/2 (NCIB 10601)

Wächst langsam bei 4°C und ist empfindlich gegen Erythromycin.

Pyruvat wird nicht ausgenutzt, jedoch werden Oxalat, Citrat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Xylose, Alanin und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease positiv. Quelle:

Fabrikplat zs chlxck.

Stamm MP3D/2 (NCIB 10602)

Beständig gegen Tetracyclin; Citrat,, Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch wird Ribose ausgenutzt. Lecithijnase positiv, Urease negativ. Quelle:

Fabrikplatzschlxck.

Stamm HP1/2 (NCIB 10603)

Empfindlich gegen Streptomycin; Propanol, Formiat, Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Glutamat oder Arginin werden nicht ausgenutzt. Lecithinase negativ,Uredse positiv; Citrat wird ausgenutzt, Quelle: Fabrikplatzschlick.

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Stamm MA2/2 (NCIB 106OH)

Propanol, Formiat, Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Glutamat oder Arginin werden nicht ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ; Citrat wird ausgenutzt. Quelle:

Fabrikplatzschlick.

Stamm 20/D (NCIB 10605)

Empfindlich gegen Novobiocin; Propanol, Oxalat, Glutarat, frannose oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Sucrose, Citrat und Ribose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: faulende Pflanzen.

Stamm HAI/5 (NCIB 1Q6O6)

Empfindlich gegen Erythromycin; Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MA3 D/3 (NCIB 10607)

Empfindlich gegen Penicillin und Chloramphenicol; Butanol, Propanol, Formiat, Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Glutamat, Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat und Ribose ausgenutzt. Lecithinase positiv, Urease positiv.

Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Empfindlich gegen Novobiocin; Glutarat, Mannose oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Oxalat, Sucrose, Citrat, iiibose, Alanin und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease positiv. Quelle: Hühnerdung.

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Stamm MPl (NCIB 10609)

Dieser Stamm nutzt Acetat, Glutarat, Glutamat, Arginin oder Serin nicht aus, doch werden Oxalat, Citrat, Mannose, Mannit, Sucrose, Ribit, Ribose und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlxck. Stamm ChD (NCIB 10610)

Empfindlich gegen Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin und Oleandomycin. Formiat, Glutarat, Glutamat, Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat, Oxalat, Sucrose, Mannose, Mannit , Ribose, Ribit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: Hühnerdung,

Stamm WS (NCIB 10611)

Empfindlich gegen Novobiocin; Oxalat, Glutarat, Arginin, Serin oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat, Sucrose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase positiv, Urease positiv. Quelle: Waldboden* Stamm HP3 (NCIB 10612)

Empfindlich gegen Novobiocin; Äthanol, Glutarat, Sucrose, ilannose, Ribose, Arginin, Serin oder Glutamat,werden nicht ausgenutzt, doch werden Oxalat, Citrat, Mannit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlxck.

Identität der Stämme mit den NCIB-Nummern 10597-10612 Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme, verweisen diese in die Gattung Pseudomonas gemäß Bergey*s Manual of

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Determinative Bacteriology. Beim Folgen des Leitfadens zu den Arten dieser Gattung, ist in Bergey's Manual keine Art beschrieben, welche die oben beschriebenen Eigenschaften besitzt. Ähnliche Arten sind Pseudomonas (Vibrio), Extorquens und Protaminobakterium ruber. Bestimmte andere rosa pigmentierte, methanolausnutzende Bakterien, sind in der mikrobiologischen Literatur beschrieben worden, hauptsächlich Pseudomonas sp, Stamm AMI (Peel & Quayle, 1961, Biochem. J., 81, 465). Es wird nun von einschlägigen Fachleuten allgemein angenommen, daß Pseudomonas extorquens, Protaminobacter ruber, Pseudomonas sp Stamm AMl und andere ähnliche bekannte Stämme rosa pigmentierter, methanolausnutzender Bakterien, in Wirklichkeit unterschiedliche Stämme der gleichen Art sind (Stocks &McCleskey, 1964, J. Bacteriol. 88, 1065).

Die Stämme NCIB 10597-10612, unterscheiden sich charakteristisch von diesen bekannten Stämmen auf der Basis der folgenden Merkmaler

bekannte Pseudomonas extorquens- Stämme NCIB Stämme 10597-10612

Oxydasetest
Wachstum bei 42°C Optimale Temperatur Wachstum auf Methylamin

Wachstum auf Lactose

Wachstum auf Naphthalin

Koloniegröüe auf MethapeiU goo/inn^

schwach positiv	negativ
kein Wachstum	Wachstum
300C	37°C
Wachstum	kein Wachs
	tum
Wachstum	kein Wachs
	tum
Wachstum	kein Wachs
	tum

Salzagar (48 Stunden Wachstum)

Pigment

,(1 mm Durchmesser

tief rosa bis rot

1-2 mm Durchmesser

lachsfarben bis tief rosenrosa.

Daher wird geschlossen, daß die Stämme 10597-10612 einer bisher unbekannten Art angehören. Die Unterschiede zwischen diesen Stämmen sind hinreichend untergeordnet, daß die Stämme als Stämme der gleicnen Art zu betrachten sind (ähnliche Variationen zwischen Stämmen einer gegebenen Art findet man bei anderen Arten der Gattung Pseudomonas, wie durch die Arbeit von Stanier und Mitarbeitern (weiter oben zitiert) demonstriert wird.

In dieser Beschreibung sind die neuen Arten als Pseudomonas rosea bezeichnet.

Es ist zu berücksichtigen, daß andere Stämme mit den allgemeinen Eigenschaften der vier neuen, oben beschriebenen Arten, welche diesen Arten zugeordnet würden, welche jedoch leicht unterschiedliche Eigenschaften von den besc-hriebenen Stämmen aufweisen mögen, aus natürlichen Quellen isoliert werden können. Es ist beabsichtigt, daß die Verwendung solcher Stämme und die Verwendung irgendeiner Stammutation, welche sich von einem Glied der vier Arten ableitet, innerhalb des Rahmens der Erfindung liegt. Die erfindungsgemäßen Stämme sind in der Lage, auf Methanol zu wachsen und methanolischen Kohlenstoff in Zellkohlenstoff umzuwandeln.

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Die Tests, welche zur Identifizierung der Stämme angewandt wurden, werden nachstehend beschrieben:

1. Medien

Die Zusammensetzung des für die Tests verwendeten Methanol-Mineralsalz-Mediums, ist:

KH2PO4 .	1,4 g
Na2HPO4	2,1 g
(MH4)2SO4	0,5 g
HgSO4.7H2O	0,2 g
CaCl2	0,01 g
FeSO1+	0,005 g
MnSO4	0,003 g
Ma2MoO4-ZH2O	0,0025 g
destilliertes	Wasser 1,0 Liter
Methanol	5,0 ml.

Für das Wachstum von Hicrocyclus polymorphum, werden zu den obigen Medium 0,01% Hefeextrakt hinzugesetzt. Dieses Medium kann durca den Zusatz von 2% (Gewicht/Volumen) hochreinen Agars (beispielsweise Agar mit "Oxoid"-Markierung "I.D.") verfestigt werden.

2. Tests der Kohlenstoffquelle

Tests für die Ausnutzung der verschiedenen Kohlenstoff-» quellen werden in dem obigem Medium durchgeführt, wobei man anstelle des Methanols, 0,5% (Gewicht/Volumen) der zu testenden

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Kohlenstoffquelle hinzusetzt. Negative Ergebnisse dieser Tests zeigen an, daß kein sichtbares Wachstum des Testorganismus auf dieser bestimmten Konlenstoffquelle innerhalb 7-tägiger Inkubation bei 37°C erfolgt. Positive Ergebnisse zeigen an, daß definitives, sichtbares Wachstum des Organismus innerhalb von 7 Tagen erfolgt, und daß das Wachstum wiederum beim Verfolgen der Subkultur in diesem bestimmten Medium erfolgt.

Im Falle der Stämme von Pseudomonas methylotropha, kann eine Anpassungsperiode über etliche Subkulturen, zum Wachsen auf verschiedenen anderen Kohlenstoffquellen führen. Die oben für diese Stämme berichteten Ergebnisse beziehen sich auf Tests, welcne ohne eine vorherige Anpassung, wie sie in obigem Absatz angezeigt ist, durchgeführt wurden.

Die getesteten Kohlenstoffquellen sind: Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat, Pyruvat, Oxalat, Succinat, Glutarat, Adipat, Methylamin, Dimethylamin, A'thylamin, Sucrose, Lactose, Glucose, Mannose, Mannit, Ribose, Kibit, Xylose, Fructose, Naphthalin, Phenol, Benzoat, Kexan, Hexadecan, Aspartat, Alanin, Glycin, Glutamat, Arginin, Serin.

3. Andere Tests

Die für die folgenden Tests angewandten Methoden sind besenrieben in "Abstracts of Microbiological Methods" von V.B.D. Sherman, veröffentlicht von Wiley - Interscience, New York, 1969.

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i Oxidasetest - Methode von Kovacs.

ii Katalasetest - wie beschrieben in "Manual of Microbiological Methods", veröffentlicht für Soc. of American Bacteriologists von McGraw-Hill, 1957.

iii Nitratreduktionstest - dieser wird durchgeführt in dem oben beschriebenen Methanol-Mineralsalz-Medium mit der Ausnahme, daß Natriumnitrat (0,5 g/l) als Stickstoffquelle, anstelle von Ammoniumsulfat, verwendet wird. Mit dieser Ausnahme ist die Methode in Society of America Bacteriologists Manual of Microbiological Methods beschrieben.

iv. Gelatinehydrolyse - es wird die Modifizierung von Manuroy der Methode von Frazier angewandt.

v. Test nach Hugh & Liefson - es wird die Originalmethode von Hugh & Liefson angewandt.

xi. Lipaseproduktion - Hydrolyse von Tween 80 unter Verwendung der Methode von Sierra.

xii. Lecithinaseproduktion - es wird die Methode von Knights. Proom angewandt.

xiii. Ureaseproduktion - es wird die Methode von Koser angewandt, bestätigt durch die Methode von Monteverde und Mitarbeitern unter Verwendung des Buenos Aires-modifizierten Mediums, wie in "The Oxoid Manual" (3. Ausgabe), 1971, veröffentlicht von Oxoid Ltd., Southwark Bridge Road, London, SEI, beschrieben. xiv. Schwefelwasserstoffproduktion - es wird die Methode von Monteverde und Mitarbeitern angewandt, wie sie in "The Oxoid Manual" (3. Ausgabe) beschrieben ist.
xv. Citratausnutzung - es wird die Methode von Koser angewandt.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann als ansatzmäßiges Kulturverfahren, als einstufiges kontinuierliches Kulturverfahren, oder als mehrstufiges kontinuierliches Kulturverfahren durchgeführt v/erden. Das Verfahrensprodukt ist eine Proteinmasse, welche bakterielle Zellen zusammen mit anderen Fermentationsprodukten aufweist, beispielsweise Aminosäuren, organische Säuren, Nucleotide oder deren Derivate.

Geeignete Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs, können beispielsweise Kohlenwasserstoffe oder oxydierte Kohlenwasserstoffe, mehrwertige Alkohole, Kohlehydrate (beispielsweise Sucrose, Glucose, Fructose), Quellen polymerisierter Kohlehydrate (beispielsweise Stärke), oder natürlich vorkommende oder synthetische öle oder Fette sein. Die Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise ein oxydierter Konlenwasserstoff, wobei Alkohole wie Methanol, besonders geeignet sind. Wenn die Kohlenstoffquelle Methanol ist, so kann sie als Rohprodukt eines Methanolsyntheseverfahrens zugeführt werden.

Das Kulturmedium enthält vorzugsweise die Kohlenstoffquelle, beispielsweise Methanol, in Mengen zwischen 0,05 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,1 und 7,5 Gew.-%.

Das Kulturmedium enthält eine stickstoffhaltige Verbindung, welche geeignet Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz, beispiels-

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weise (NEL)₂SCL oder ein Nitrat, beispielsweise KNO₃, vorzugsweise Ammoniak oder ein Ammoniumsalz sein kann. Vorzugsweise liegt die stickstoffhaltige Verbindung im Medium in Mengen zwischen 0,001 Gew.-% und 3 Gew.-% elementaren Stickstoffs, insbesondere zwischen 0,01 und 1 Gew.-%, vor. Zusätzlich zu der stickstoffhaltigen Verbindung, enthält das Medium auch anorganische Quellen von Elementen wie Kalium, Phosphor, Schwefel und Magnesium. Diese Elemente können dem Medium einverleibt werden, indem man Verbindungen wie beispielsweise Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphate und Phosphorsäure hinzusetzt. Es ist bevorzugt, daß die anorganischen Verbindungen, welche diese Elemente enthalten, dem Medium in Mengen zugesetzt werden, welche ausreichend sind, um die folgenden gewichtsprozentigen Ionenkonzentrationen hervorzurufen:

K⁺ 0,01 bis 0,25

Mg²⁺ 0,001 bis 0,1

PO₁₊ ³" 0,01 bis 0,5

SO₁₁ ²" 0,01 bis 0,25.

Das Kulturmedium kann auch Spurenmengen von Ionen anderer metallischer Elemente enthalten wie beispielsweise Calcium, Kupfer, Eisen, Kobalt oder Mangan (welche dem Medium als Salze wie Chloride oder Sulfate zugesetzt werden können) und besonders Natrium, welches beispielsweise als Chlorid, Sulfat oder Phosphat zugesetzt werden kann, und zwar vorzugsweise in einer Menge, wel-

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ehe eine gewichtsprozentige Ionenkonzentration von 0,002 bis 0,06 liefert. Das Kulturmedium kann auch untergeordnete organische Nährmittel enthalten wie beispielsweise Hefeextrakt, ilaiseinweichlauge, Pepton, Vitamine, Aminosäuren oder Baumwollsamenmehl,

Ein geeignetes Kulturmedium (nachstehend als Medium I bezeichnet), besitzt die folgende Zusammensetzung (wobei die Konzentrationen in Gewicht je Liter angegeben sind, wenn nichts anderes vermerkt ist):

CH3OII	so4	20,0	g	g
H3PO1+	7HjO	0,0165 molar	g
(NH1+J2	7HjO	9,0	mg
MgSO4.	5HjO	1,05	mg
FeSO4.		5,0	mg
CuSO4.	4HjO	0,1	mg
H3B03	7HjO	0,07	mg
MnSO4.	4	0,5	mg
ZnSO4.	2HjO	0,5	mg
Na2MoO	6HjO	0,1	mg
CaCIj.		13,24	1 Liter
CoCIj.	0,1
Wasser	auf

In diesem Medium wird der pH-Wert für das Wachstum eingestellt, indem man ein l:l-Gemisch von 4-n K0H/4j-.n NaOH hinzusetzt.

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Bei kontinuierlichen Kulturverfahren, kann das Medium, in welches ein Organismus eingeimpft wird, so aufgebaut sein, daß die elementaren Nährmittel, beispielsweise Stickstoff, Phosphor, Magnesium oder Eisen, oder die Kohlenstoffquelle, in Bezug auf die anderen Bestandteile des Mediums, in solchen Mengen vorliegen können, daß sie das Wachstum beschränken. Von dieser Tatsache kann zum Regulieren des Wachstums einer Kultur Gebrauch gemacht werden.

Zum Anlaufenlassen eines kontinuierlichen Kulturprozesses, wird eine Impfung des zu verwendenden Organismus bzw. der zu verwendenden Organismen zu einem Medium hinzugesetzt, welches die Kohlenstoffquelle und andere Nährmittel enthält. Die Kultur läßt man als Ansatzkultur wachsen und überträgt sie im wesentlichen zu kontinuierlichen Kulturbedingungen, indem man beginnt, das Medium in eine Fermentiervorrichtung einzuführen. Während der Fermentierung verläßt das Medium kontinuierlich die Fermentiervorrichtung mit einer Geschwindigkeit, welche derjenigen ähnlich ist, mit welcher frisches Medium eintritt. Die Konzentration des wachstumsbeschränkenden Nährmittels wird stufenweise gesteigert, bis die Kultur sich in einem stetigen Zustand befindet und das Medium, welches in die Fermentiervorrichtung eintritt, für den Fermentierungsprozeß die gewünschte Zusammensetzung besitzt.

Das Begrenzende Nährmittel kann die Stickstoff- oder Phosphorquelle, oder, vorzugsweise, die Kohlenstoffquelle sein. Die

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Begrenzung kann auch zwischen zweien oder allen dreien dieser Nährmittel hin- und herschwanken.

Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mediums, in welchem die Fermentierung stattfindet, auf einer gewünschten Höhe gehalten, indem man stufenweise oder kontinuierlich ein geeignetes pH-Steuermittel hinzusetzt. Zu geeigneten Mitteln zählen Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, sekundäres Natriumphosphat und Ammoniak, entweder als solches oder in wäßriger Lösung. Gemische dieser pH-Steuermittel können angewandt werden. Zu anderen geeigneten pH-Steuermitteln zählen wäßrige Lösungen von Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure. Vorzugsweise steuert man den pH-Wert, sowohl bei ansatzweisen als auch bei kontinuierlichen Verfahren, innerhalb einer Hälfte der pH-Einheit der gewünschten pH-Größe, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 8,0, insbesondere von 5,8 bis 7,6.

Die optimale Wachstumstemperatur des erfindungsgemäßen Mikroorganismus variiert je nach dem angewandten Organismus und wird gewöhnlich innerhalb eines Grades der gewünschten Temperatur gesteuert, welche vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 20 bis 50⁰C liegt. Besonders geeignete Temperaturen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen innerhalb des Bereiches von 3¹+ bis 45°C.

Sowohl bei der ansatzweisen als auch bei der kontinuierlichen Kultivierung, kann der Partialdruck des im Kulturmedium aufge-

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lösten Sauerstoffs innerhalb des Bereichs von 3 mm bis 600 nun Hg, vorzugsweise von 30 mm bis 150 mm Hg, gesteuert werden. Der Teildruck des Konlendioxyds im abgehenden Gas wird innerhalb des Bereichs von 0 bis 150 mm Hg und vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 0 bis 40 mm Hg gehalten. Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter Anwendung jedes geeigneten Typs einer Fermentiervorrichtung durchgeführt werden. Eine sehr geeignete Fermentiervorrichtung zur Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens ist in der britischen Patentanmeldung 35 285/70 beschrieben. Die Proteinmasse bildet sich als Aufschlämmung in der Fermentiervorrichtung und wird abgetrennt nach Methoden wie Zentrifugieren und/oder Abfiltrieren und Ausflocken aus der flüssigen Pnase, welche andere Produkte enthält, beispielsweise gebildete Aminosäuren. Die Proteinmasse kann getrocknet werden und bildet eine Proteinergänzung zur Verwendung in menschlischen oder tierischen Nahrungsmitteln.

Wenn gewünscht, kann Protein aus der Proteinmasse extrahiert werden und das extrahierte Protein kann man als Ergänzung für menschliche oder tierische Nahrungsmittel verwenden.

Die Erfindung sei durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:

A. Püoudomonas methylotropha - Versuche mit ansatzmäioiger Kultur Beispiel 1

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Stamm WKM-3 (NCIB Io508)

3 Es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10 cm sterilen Salins zu einer Kultur des Mikroorganismus hinzusetzt, v/elcher auf 2-lethanol-Mineralsalz-Agar im Schrägrohr wächst (Zusammensetzung wie oben bei der Beschreibung der Stämme beschrieben). Eine Suspension der Zellen wird bereitet und die gesamte Suspension verwendet man zur Animpfung eines Saatkolbens (11 Erlenmeyer), welcher 100 cm des gleichen Mediums enthält. Der pPI-Wert dieses Mediums wird vor der Animpfung auf 6,8 eingestellt. Diese Saatkultur inkubiert man dann 36 Stunden auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C.

Diese Kultur wird dann verwendet, um eine Fermentiervorrichtung anzuimpfen, welche 2 1 des folgenden Mediums (Konzentrationen in Gewicht je 1 angegeben, falls nichts anderes angegeben ist) enthält:

H₃BO₃ 0,07 mg MnSO₁^HH₂O 0,5 mg ZnSO₄.7H₂O 0,5 mg Na₂MoO₁₊ 0,1 mg CaCl₂.2H₂O 13,24 mg CoCl₂.6H₂O 0,1 mg

Der pH-Wert dieses Mediums wird vor dem Animpfen auf 6,8 eingestellt. Nach dem Animpfen dieses Mediums mit der Saatkultur, wird die Kultur in der Fermentiervorrichtung bewegt und belüftet und zwar bei einer automatisch gesteuerten Kulturtempe-

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CH3OH	SO1+	0	5,0	g	g	g	g
H3PO1+	7H2	0	0,0165 molar	mg
(NH1+) 2	7H2	0	9,0
MgSO1+.	51I2	1,05
FeSO1+.		5,0
CuSO1+.		0,1

peratur von 37°C, wobei man·den pH-Wert der Kultur automatisch bei 6,8 steuert. Nach etwa 36-stündigem Wachstum, erfolgt ein weiteres Hinzusetzen von 5 g Methanol auf jeden 1 Kultur,
wonach ein weiteres Hinzusetzen von 5 g Methanol auf jeden 1 der Kultur nach 40-stündigem Wachstum, und ein schließliches Hinzusetzen von 5 g Methanol je 1 Kultur nach 44 Stunden erfolgt. Nach einer Gesamtdauer von 48 Stunden Fermentierung, werden die Zellen abgeerntet und getrocknet und es ergeben sich aus 2 1 Kultur 10,4 g getrockneter Zellen mit einem Gehalt an 6 5 Gew.-% Rohprotein (N χ 6,25).

Beispiel 2 Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt. Man erhält ^⁵ g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt (N x 6,25) der Zellen beträgt 68 Gew.-%.

Beispiel 3 Stamm SE (NCIB 10513)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt. Man erhält 10,6 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67 Gew.-%.

Beispiel 4 Stamm SF (NCIB 10514)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt. Man erhält 12,3 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt der Zellen

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(W χ 6,25) beträgt 62 Gew.-%.

Beispiel 5 Stamm AS-I (NCIB 10515)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt. Man erhält 11,6 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt (N x 6,25) der Zellen beträgt 67 Gew.-%.

Beispiel 6 Stamm AS-I (NCIB 10515)

Der Versuch wird im wesentlichen durchgeführt, wie dies in den Beispielen 1 und 5 beschrieben ist. Wenn die Fermentierung vollständig ist und nach dem Abernten der Zellen, wird die überstehende Flüssigkeit der Kultur auf Anwesenheit freier Aminosäuren in der überstehenden Flüssigkeit analysiert, wobei man eine automatische Aminosäuren-Analysiervorrichtung verwendet. Man findet die folgenden Aminosäuren in den angegebenen Mengen:

Glutaminsäure 135 mg/1 ·

Alanin 32 mg/1

Valin 111 mg/1

iso-Leucin 5 3 mg/1

Leucin 4-0 mg/1

Lysin 20 mg/1.

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Beispiel 7 Stamm MPtf (NCIB 10592)

Der Versuch wircl· in Schüttelkolbenkulturen wie folgt durchge-

führt: es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10 cm steriler Mineralsalzlösung zu einer Schrägkultur des Mikroorganismus hinzufügt, welcher auf Methanol, Mineralsalz-Agar (Zusammensetzung wie oben bei der Beschreibung der Stämme beschrieben) in Schrägrohren wächst. Es wird eine Suspension der Zellen bereitet und die gesamte Suspension verwendet man zum Animpfen eines 1-1 Erlenmeyer-Kolbens, welcher 200 cm der gleichen Methanol-Mineralsalzsubstanz (0,5%, Gewicht/Volumen, Methanol) enthält. Den pH-Wert dieses Mediums stellt man' vor dem Animpfen auf 6,8 ein. Dann inkubiert man diese Kultur 2H Stunden auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C. Die Zellen werden dann durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet, wobei sich 0,171 g Trockengewicht der

3
Zellen aus den 200 cm Kultur ergeben. Die Zellen enthalten 62 Gew.-% Rohprotein (ν χ 6,25).

Beispiel 8 Stamm F16/1 (NCIB 1059 3)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. Man erhält 0,222 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 66 Gew.-% (Nx 6,25).

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Beispiel 9 Stamm F16/2 (NCIB 1059*0

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. Man erhält 0,182 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt der Zellen (.NX 6,25) beträgt 69 Gew.-%.

Beispiel 10 Stamm HPl/Sh/37/1 (NCIB 10595)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. 0,270 g getrockneter Zellen werden erhalten. Der Proteingehalt der Zellen, (hf χ 6,25) beträgt 6"M- Gew.-%.

Beispiel 11 '

Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt. Man erhält 0,240 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 67 Gew.-% (N χ 6,25).

B. Pseudomonas methylotropha - Versuche mit kontinuierlicher Kultur
Beispiel 12

Stamm MPM- (NCIB Io592)

Man erzeugt eine Biomasse durch Kultivieren des Bakteriums in einem kohlenstoffbegrenzten kontinuierlichen Kultivierungsprozeß bei einer Temperatur von 40⁰C. Die Kultur wird belüftet und gerührt und den pH-Wert steuert man automatisch bei 6,8. Das Schäumen wird durch automatisch programmierte

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Zusätze von Siliconöl gesteuert. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt: Eine saatansatzkultur des Organismus läßt man anfangs wachsen, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Diese Saatkultur wird nach 24-stündigem Wachstum verwendet, um eine Fermentiervorrichtung anzuimpfen, welche 2,0 1 des Mediums II mit der folgenden Zusammensetzung enthält:

Methanol	2S04	.2H2	0	10,0	g/i	g/i
(NH1+)		.6H2	0	1,15	g/i	mg/1
H3PO1+	.7Hj		0	0,0066 molar	mg/1
MgSO1+	.7Hj			0,42	mg/1
FeSO1+	.5Hj		0	5,0	mg/1
CuSO1+		0	0,1	mg/1
H3BO3	.7Hj		0,07	mg/1
MnSO1+	.7H2	0	0,5	mg/1
ZnSO1+	Ha2MoO1+	0	0,5	mg/1
CaCl2	0,1
CoCl2	13,2
0,1

Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 6,8 eingestellt, indem man ein l:l-Gentisch von 4-n KOH:Hn NaOH hinzusetzt. Nach dem Animpfen des Mediums II mit der Saatkultur, wird die Kultur in der Fermentiervorrichtung bewegt und belüftet, wobei man die Temperatur der Kultur automatisch auf 4.0⁰C und den pH-Wert der Kultur automatisch auf 6,8 einregelt.

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Die Kultur läßt man als ansatzmäßige Kultur etwa 36 Stunden wachsen. In dieser Zeit ist das Methanol im Medium vom Mikroorganismus vollständig ausgenutzt und die Konzentration des Methanols im Medium ist nahezu 0. Zu dieser Zeit wird die Kultur kontinuierlich gemacht, indem man damit beginnt, der Kultur kontinuierlich Medium zuzuführen. Das Medium besitzt die gleiche Zusammensetzung wie das Medium II und man führt es in zwei Teilen in die Kultur ein. Der eine Teil weist die Mineralsalze auf und der andere ist Methanol in 50%-iger wäßriger Lösung. Die Zufuhrgeschwindigkeit des Mediums ist

—1 so, daß die Verdünnungsrate 0,1 Stunde beträgt. Die Kultur läßt man dann für etwa 24 Stunden wachsen, so daß sie ein stabiles, kohlenstoffbegrenztes stetiges Stadium erzielen kann. Die Zellen werden dann kontinuierlich gewonnen und getrocknet. Das Trockengewicht der Zellen im stetigen Zustand beträgt 1,1 g/l und die Zellausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,41 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen, ausgedrückt als wasserfreie Aminosäuren in Prozenten des Gesamtaminosäuregehaltes , ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 13 Stamm F16/1 (MCIB 10593)

Die Arbeitsweise des Beispiels 12 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Fermentierungstemperatur auf 37°C eingeregelt

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wird. Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,8 g je 1 und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,38 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols» Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 78 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel Ik Stamm F16/2 (NCIB 1Ο59Ό

Das Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht im stetigen Stadium beträgt 3,7 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol, betragt 0,37 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 76 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 15 Stamm MPl/Sh/37/1 (NCIB 1059 5)

Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Trockengewicht der Zellen im stetigen Stadium beträgt 3,7 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,37 g.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 76 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 16 Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

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Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,8 g je 1 und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,38 g getrockneter Zellen je g des ausgenutzten
Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 78 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der
Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 17

Stamm AS-I (NCIB Io515)'

Es wird Biomasse durch Kultivierung des Bakteriums in einem Kohlenstoffbegrenzten, kontinuierlichen Kultivierungsprozeß bei einer Temperatur von 37°C erzeugt. Die Kultur wird belüftet und bewegt und den pH-Wert regelt man automatisch auf einen Wert von 6,8 ein. Das Schäumen steuert man durch
automatisch programmierte Zusätze von Siliconöl. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt:

Saatkulturen des Organismus läßt man anfangs wachsen, wie dies im ersten Absatz des Beispiels 1 beschrieben ist,, um eine
Impfung von 0,5 g Trockengewicht je 1 zu schaffen. Diese
Saatkulturen werden dann zum Animpfen einer Fermentiervorrichtung verwendet, welche 2,0 1 des Mediums III der folgenden Zusammensetzung enthält:

CIIgOH 3,0 g/l

H₃PO₄ 0,009 9 molar

7H₂O 0,67 g/l

^ 0,03 mg/1

K₂SO₁₊ 2,5 mg/1

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	- 43 -	2H2O	5,0	mg/1	2161164
FeSO1+	.7H2O	6H2O	0,1	mg/1
CuSO4	.5H2O		0,07	mg/1
H3BO3		0,5	mg/1
MnSO1+	.7H2O	0,5	mg/1
ZnSO1+	.7H2O	0,1	mg/1
Na2MoO4	13,2	mg/1
CaCl2	0,1	mg/1
CoCl2

Den pH-Wert dieses Mediums stellt man durch gesteuertes Hinzusetzen von gasförmigem Ammoniak, auf 6,8 ein. Nach der Animpfung des Mediums III mit den Saatkulturen wird die Kultur in der Fermentiereinrichtung bewegt und belüftet, wobei man die Kulturtemperatur automatisch auf 37°C einregelt und den pH-Wert der Kultur automatisch steuert.

Die Kultur läßt man als ansatzmäßige Kultur etwa 1 Stunde wachsen. Zu dieser Zeit ist das Methanol im Medium durch die Mikroorganismen vollständig ausgenutzt und die Methanolkonzentration im Medium beträgt etwa 0. Zu dieser Zeit führt man Methanol der Kultur kontinuierlich mit langsam steigernder Geschwindigkeit zu, so daß die Kultur zu allen Zeiten durch die Konzentration des Methanols im Medium begrenzt wächst. Wenn die Rate der Methanolzufuhr etwa 10 g je 1 nach etwa 2 Stunden erreicht, so macht man die Kultur kontinuierlich, indem man damit beginnt, Medium kontinuierlich der Kultur zuzuführen. Das Medium besitzt die gleiche Zusammensetzung

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wie Medium III und wird in zwei Teilen in die Kultur eingeführt. Der eine Teil weist die Mineralsalze auf und der andere Teil ist Methanol als 50%-ige wäßrige Lösung. Die Zufuhrgeschwindigkeit des Mediums ist so, daß die Verdünnungsrate 0,1 Stunde beträgt. Die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol, beträgt 0,38 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 78 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 18 Stamm SE (NCIB 10513)

Das Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

Das.Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,5 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol, beträgt 0,35 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (Nx 6,25) von 81 Gew.-%, Der Aminosäuregehalt ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 19 Stamm WKM 1 (NCIB 10509)

Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht des stetigen Stadiums beträgt 2,7 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol, beträgt 0,27 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten, Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von

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88 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 20 Stamm SF (,NCIB 10514)

Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,4 g/l und die Zelienausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,34 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 7 7 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

C. Hicrocyclus polymorphium, Stamm Pj.a 5 (NCIB 10516)
Beispiel 21

Kontinuierliche Kultur

Das Beispiel 17 wird unter Verblendung des Stammes PIaS wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen mit der Ausnahme, daß ein kohlenstoffbegrenzendes, stetiges Stadium bei
einer Verdünnungsrate von 0,05 Stunden" erstellt wird. Zusätzlich enthält das Medium 0,05% Hefeextrakt der Bezeichnung "DIFCO".

Das Trockgengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 2,2 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,22 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die
getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (N χ 6,25)

209839/1002

von 8 7 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 22
Ansatzmäßige Kultur

Unter Verwendung des Stammes Pla5 wird ein Versuch durchgeführt, im wesentlichen wie er in Beispiel 1 beschrieben ist. Jedoch läßt man in diesem Falle die Saatkultur *t8 Stunden wachsen und beim Fermentieren erfolgen weitere Methanolzusätze zu verschiedenen Zeiten. Der erste Zusatz von weiteren 5 g Methanol je 1 Kultur erfolgt nach "+'8 Stunden, der zweite Zusatz nacn 56 Stunden und der letzte Zusatz nach 6¹I Stunden.

Die Zellen werden nach einer Gesamtfermentierungszeit von Stunden gewonnen Und getrocknet, v/obei sich 9,6 g aus den 2 1 Kultur ergeben. Der Proteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67,5 Gew.-% Protein.

D. Hyphomierobium variable, Stamm S/3Q/1 (NCIB 10517) Beispiel 23
Ansatzmäßige Kultur

Unter Anwendung des Stammes S/30/H wird ein Versuch durchgeführt, wie er im wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben ist. Jedoch läßt man bei diesem Versuch die Saatkultur 72 Stunden wachsen und beim Fermentieren erfolgen weitere Methanolzusätze zu verschiedenen Zeiten. Der erste Zusatz von weiteren 5 g

209839/1002

Methanol zu jedem 1 der Kultur erfolgt nach 5¹+ Stunden, der zweite Zusatz nach 6*l· Stunden und der letzte Zusatz nach 74 Stunden. Die Inkubationstemperatur beträgt in diesem Beispiel in allen Fällen 30⁰C. Die Zellen werden nach einer Gesamtfermentierungszeit von 96 Stunden gewonnen und getrocknet, und es ergeben sich aus den 2 1 Kultur 10,7 g getrocknete Zellen. Der Proteingehalt (N χ 6,25) der getrockneten Zellen beträgt 70 Gew.-%.

Beispiel 24 Kontinuierliche Kultur

Beispiel 17 wird unter Verwendung des Stammes S/30/4 wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen mit der Ausnahme, daS ein kohlenstoffbegrenztes, stetiges Stadium bei einer Verdünnungsrate von 0,05 Stunden"" mit einer Methanolkonzentration im einströmenden Medium von 5 g/l aufgestellt wird. Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 1,5 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,3 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt (N χ 6,,25) von 80 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

E. Pseudomonas rosea - Versuche mit ansatzmäßiger Kultur Beispiel 25 Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Der Versuch wird in Schüttelkolbenkulturen wie folgt durchge-

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3 führt: es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10 cm sterile Mineralsalzlösung zu einer Schrägkultur des Mikroorganismus hinzusetzt, welcher auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Schrägrohren (Zusammensetzung wie oben bei den Tests zur Identifizierung der Stämme beschrieben) wächst. Es wird eine Suspension der Zellen bereitet und die gesamte Suspension verwendet man zum Animpfen eines 1 1-Erlenmeyerkolbens, welcher 200 cm der gleichen Methanol-Mineralsalz-Substanz (0,5%, Gewicht/Volumen, Methanol) enthält. Den pH-Wert dieses

_k Mediums stellt man vor dem Animpfen auf 6,8 ein. Diese Kultur wird dann auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C, 24 Stunden inkubiert. Die Zellen werden dann durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet und es ergeben sich 0,227 g Zellen^Trockengewicht aus den 200 cm Kultur. Die Zellen enthalten 55 Gew.-% Rohprotein (N χ 6,25).

Beispiel 26 Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

Der Arbeitsgang des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,226 g Zellen.,Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 58 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 27 Stamm MA3D/1 (NCIB 10599)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erzielt 0,221 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 53 Gew.-% (N χ 6,25).

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Beispiel 28 Stamm MwIA (NCIB 10600)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,224 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 55 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 29 Stamm MPID/2 (NCIB 10601)

Die Arbeitsweise des Beispiels 2 5 wird wiederholt. Man erhält 0,202 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 54 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 30 Stamm MP3D/2 (NCIB 10602)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,207 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 56 6ew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 31 Stamm MP1/2 (NCIB 10603)

Die Arbeitsweise des Beispiels 2 5 wird wiederholt. Man erhält 0,200 g Trockengewicht der Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 54 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 32 Stamm MA2/2 (NCIB 10604)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält

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0,225 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 58 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 33 Stamm 20/D (NCIB 10605)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,220 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 57 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 34

Stamm IiAl/5 (NCIB 10606). Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,161 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 61 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 35 Stamm MA3D/3 (NCIB 10607)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,156 g Zellen-Trockengewicht, Der Proteingehalt der Zellen beträgt 63 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 36 Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,188 g Zellen-Trockengewicht. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 61 Gew.-% (N χ 6,25).

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Beispiel 37 Stamm MPl (NCIB 10609)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,217 g Trockengewicht der Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 59 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 38 Stamm ChD (NCIB 10610)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,210 g Trockengewicht der Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 64 Gew.—% (N χ 6,25).

Beispiel 39

Stamm WS (NCIB 10611) Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,250 g Treckengewicht an Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 64 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 40 Stamm MP3 (NCIB 10612)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,209 g Trockengewicht an Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 59 Gew.-% (N χ 6,25).

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F. Pseudomonas Rosea - Versuche mit kontinuierlicher Kultur Beispiel 41

Stamm MPl (NCIB 10609)

Beispiel 12 wird unter Verwendung des Stammes MPl wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen mit der Ausnahme, daß der Versuch bei 37⁰C durchgeführt wird, man die Kultur als ansatzweise Kultur 48 Stunden wachsen läßt, und, nachdem die Kultur kontinuierlich gemacht worden ist, man es ihr gestattet, für etwa 36 Stunden zu wachsen, um die Erzielung eines stabilen, stetigen Stadiums zu ermöglichen. Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,38 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf Methanol beträgt 0,338 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die Trockenzellen besitzen einen Rohproteingehalt von 6 8 Gew.-% (N χ 6,25) Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 42 Stamm MP3 (NCIB 10612·)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,5 3 g/l und die Zellenausbeute in Bezug auf das Methanol beträgt 0,35 3 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 69 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

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Beispiel 43
Stamm ChD (NCIB 10610)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,25 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf !•!ethanol, beträgt 0,325 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N κ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 44 Stamm WS (NCIB 10611)

Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,25 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,325 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 45 Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,16 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,316 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 72 Gew.-% (N χ 6,25).

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2161764

- 5t -

Beispiel 46 Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt.

Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,42 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,342 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N x 6,25).

Beispiel 47 Stamm HA3D/1 (NCIB 10599)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,30 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,330 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (H χ 6,25).

Beispiel 48 Stamm MW4/4 (NCIB 10600)

Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 2,94 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,294 getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% (N χ 8,25).

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Beispiel 49 Stamm MP1D/2 (NCIB 10601)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,71 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,371 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% CN χ 6,25).

Beispiel 50 Stamm MPl/2 (HCIB 10603)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Gewicht der trockenen Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,02 g je 1 und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,302 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten "Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 51 Stamm MA2/2 (HCIB 10604)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Gewicht der trocknen Zellen des stetigen Stadiums beträgt 2,71 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,271 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 6,25).

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2161184

■ - 56 -

Beispiel 52

Stamm 20/D (NCI3 10605)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,69 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Γ-fethanol, beträgt 0,36 9 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 67 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 5 3 Stamm MAl/5 (NCIB 10606)

Das Beispiel Ul wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Gewicht der trocknen Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,42 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf. Methanol, beträgt 0,342 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen' besitzen einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 54 Stamm MA3D/3 (NCIB 10607)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt.

Das Trockengewicht der Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,12 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,312 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N χ 6,25).

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Beispiel 55 Stamm BDD/2 (MCIB 10608)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt, Das Gewicht der trocknen Zellen des stetigen Stadiums beträgt 3,62 g/l und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, betragt 0,36 2 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N x 6,25).

Beispiel 56 Fütterungsversuch bei Hühnchen

Es wird ein Versuch unter Anwendung von drei Gruppen Hühnchen durchgeführt, Die ersten 10 Tage werden alle Gruppen mit "Promin"-Diät 1 gefüttert, bestehend aus Probe Sojabohnenmehl 21,7% (91% Rohprotein in der Diät), el. 1-Methionin 0,464%, Molken 2,5%, Mineralstoffe 6,75%, Vitamine 2,0%_s Äthoxychin 0,015%, Maisöl 8,0%, Dextrose 40,0%, Getreidestärke 18,391% und Glycin 0,2%. Für die nächsten 7 Tage wird die Diät 1 bei einer Gruppe fortgeführt, während die andere Gruppe mit den Diäten 2 und 3 gefüttert wird, welche aus "Promin"-Diät bestehen, in welchen getrocknete Proteinmasse von Pseudomonas methylotropha bzw. getrocknete Bäckerhefe eingesetzt wurde, um 25% des Rohproteins in der Diät zu bilden. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben:

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Ergebnisse

	Durchschnittliche	Durchschnittliche	(g)	150	Futterumwandlungs
Diät	Zunahme am	Nahrungsauf	160	verhältnis:
	Leb end gew icht	nahme	167	g Lebendgewicht zu
			nähme
	(α)	g Nahrungsaufnahme
1	87,6	0,585
2	95,3	O,S95
3	85,0	0,508

Wie ersichtlich, ist unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Masse, das erzielte Futterumwandlungsverhältnis vergleichsweise günstig gegenüber dem Futterumwandlungsverhältnis, welches man unter Verwendung der anderen gatesteten Proteinquellen erzielt.

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Tabelle I

Aminosäure·	wasserfreie Aminosäure in % des Gesamtgehalts an wasserfreier Aminosäure Beispiele Nr.	18	19	20	21	24
	17	11,3	11,5	12,0	8,5	11,1
Aspartxnsaure	11,1	5,1	5,5	5,1	4,4	4,7
Threonin	5,4	3,4	3,6	3,5	3,5	3,4
Serin	3,9	12,5	12,3	12,8	12,7	13,4
Glutaminsäure	12,3	3,9	5,3	4,2	5,8	5,1
Prolin	4,5	6,4	6,7	6,3	5,0	5,9
Glycin	5,7	8,1	8,3	7,8	7,7	7,0
Alanin	7,7	6,6	6,4	6,9	5,8	6,1
Valin	6,2	3,4	3,3	2,7	2,2	3,1
Methionin	3,5	5,6	5,6	5,8	5,5	5,0
Isoleucin	5,7	8,8	8,5	9,1	9,9	7,7
Leucin	9,0	4,2	4,2	3,6	5,6	4,5
Tyrosin	4,2	4,9	4,0	4,6	5,6	5,0
Phenylalanin	4,8	7,7	7,2	7,7	7,0	8,2
Ly s in	8,1	12,4	2,3	2,0	2,2	2,7
Histidin	2,4	5,7	5,1	5,9	8,5	7,1
Arginin	5,8	0,5	0,5	n,t#	n.t.	n.t.
Halbcystin	0,6	2,0	n.t.	n.t.	n.t.	n.t.
Tryptophan 1	n.t.	58,1	61,1	55,2	41,9	50,7
gesamte wasser freie Amino säuren in % der Trockensubstanz	56,4

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ίο

Tabelle I (Fortsetzung)

Aminosäure	wasserfreie' Aminosäure in % des Gesamtgehalts an wasserfreier Aminosäure Beispiele Nr.	15	16	13	41	42	43
Aspartinsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Lysin Histidin Arginin Halbcystin Tryptophan	12	10,5 5,5 4,4 12,5 5,2 ■ 5,2 7,8 1 6,0 3,0 ,5,2 8,5 .4,6 5,0 7',8' 2,7 6,1 0,6 1,6	10,9 6,0 4,7 12,3 5,2 5,3 8,2 6,0 2,8 4,6 8,7 4,8 4,5 7,3 2,3 6,1 0,7 n.t.	10,6 5,.9 4,2 11,5 5,4 5,5 7,5 6,5 3,3 5,2 8,3 4,8 4,8 7,5 2,5 6,3 0,6 n.t.	10,1 4,7 4,2 13,5 5,9 5,6 8,2 6,0- 2,4 4,ο 8,6 3,5 4,0 7,5 2,1 9,6 0,8 1,1	10,1 5,1 3,5 12,4 6,3 5,8 7,4 6,5 2,5 4,6 8,5 4,'l 5,0 7,3 2,4 8,1 0,8 1,6	10,0 5,3 4,3 12,5 5,6 5,6 7,3 6,5 3,0 j 5,3 j 8,6 4,2 4,4 7,5 2,5 7,1 0,7 1,5
gesamte wasser freie Amino säuren in % der Trockensubstanz	10,7 5,4 4,9 12,2 5,0 5,4 7,8 6,4 2,9 ■5,5 9,2 4,2 4,4 7,5 2,2 6,2 0,6 1,5	55,6	50,0	58,4	46,7	54,3	53,2
49,0

n.t. = nicht getestet

Aminosäuren bestimmt nach der herkömmlichen Kolonnenchromatograpnietechnik nach Moore & Stein. Halbcystin bestimmt als Cystinsäure nach Oxydation mit Peramexsensäure. Tryptophan analysiert unter Anwendung alkalischer Hydrolyse.

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Claims (9)

1. - 61 Patentansprüche

   MU Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen und/oder anderer Fermentierungsprodukte durch aerobes Kultivieren von Bakterien in einem wäßrigen Kulturmedium, welches eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganische Nährstoffe aufweist, und Gewinnen der Proteinmassen und/cder anderer erzeugter Fermentierungsprodukte, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien verwendet, welche einem oder mehreren methanolausnutzenden Stämmen der Arten Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea angehören, deren Eigenschaften vorstehend beschrieben wurden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   daß man Bakterien anwendet, welche einem oder mehreren der Stämme mit den NCIB-Nummern 10508 bis 10517 und 10592 bis 10612 angehören.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle einen Alkohol, insbesondere Methanol, verwendet.
4. 4. Verfanren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein solches verwendet, welches Ammoniak, ein Ammoniumsalz, Harnstoff oder ein Nitrat als Stickstoffquelle enthält.

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5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis U, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, welches anorganische Quellen an Phosphor, Schwefel, Magnesium und Kalium und/oder Natrium enthält.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, welches Ionen des Kalziums, Kupfers, Eisens, Kobalts oder Mangans enthält.
7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, welches die Kohlenstoff quelle in Mengen zwischen 0,05 und 10 Gew.-⁵u, insbesondere 0,1 und 7,5 Gew.-%; die Stickstoffquelle in Mengen zwischen 0,001 und 3 Gew.-%, insbesondere 0,01 und 1 Gew.-% elementaren Stickstoffs; und die anorganischen Quellen an Phosphor, Schwefel, Magnesium, Kalium und Natrium in solchen Mengen enthält, welche ausreichend sind, um die gewichtsprozentigen

   3- ' ²"

   Ionenkonzentrationen PO₁₊ 0,01 bis 0,5; SO₁₊ 0,01 bis 0,25; ■

   Hg²⁺ 0,001 bis 0,1; K⁺ 0,01 bis 0,25; und Na⁺ 0,002 bis 0,06 zu schaffen. · \
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet» daß man das Kultivieren bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 20 bis 50⁰C, insbesondere von 34 bis 45°C, bewirkt.

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9. 9. Verwendung des nach Anspruch 1 bis 8 hergestellten, proteinhaltigen Produktes in Form getrockneter Zellen als proteinhaltige -Nahrungsmittelergänzung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nährmitteln, zur Ernährung von Mensch und Tier.

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