JPS60251895A - ピロロキノリンキノンの製造方法 - Google Patents
ピロロキノリンキノンの製造方法Info
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- JPS60251895A JPS60251895A JP59107406A JP10740684A JPS60251895A JP S60251895 A JPS60251895 A JP S60251895A JP 59107406 A JP59107406 A JP 59107406A JP 10740684 A JP10740684 A JP 10740684A JP S60251895 A JPS60251895 A JP S60251895A
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- JP
- Japan
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- pseudomonas
- pqq
- pyrroloquinoline quinone
- methanol
- mold
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は細胞を用いて下記化学構造式（１）のピロロキ
ノリンキノン（以下ＰＱＱと略称する）を製造する方法
に関する。
ノリンキノン（以下ＰＱＱと略称する）を製造する方法
に関する。
従来技術
ＰＱＱはキノ酵素のアポ型酵素をボロ化して酵素を活性
化する能力を有し、メタノール資化性細菌のメタノール
脱水素酵素、酢酸菌のアルコール脱水素酵素、アルデヒ
ド脱水素酵素、グリセリン脱水素酵素又はグルコース脱
水素酵素などの補酵素として機能しているほか、動物、
植物及び微生物起源の銅を含むアミン酸化酵素、アミン
脱水素酵素及びコリン脱水素酵素又はカルボニル試薬で
阻害される他の多くの酸化還元酵素の補酵素として、生
理学的に重要な機能を有する物質である。
化する能力を有し、メタノール資化性細菌のメタノール
脱水素酵素、酢酸菌のアルコール脱水素酵素、アルデヒ
ド脱水素酵素、グリセリン脱水素酵素又はグルコース脱
水素酵素などの補酵素として機能しているほか、動物、
植物及び微生物起源の銅を含むアミン酸化酵素、アミン
脱水素酵素及びコリン脱水素酵素又はカルボニル試薬で
阻害される他の多くの酸化還元酵素の補酵素として、生
理学的に重要な機能を有する物質である。
更に他の酸化還元酵素や転移酵素の補酵素、例えばチア
ミンピロリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
１′、ニコチンアミトアデニンシヌクレメチド；１；ス
フエート、ピリドギザールボスフェー１〜、フラヒンア
デニンシヌクレオチド、フラピンモノヌクレオチドなと
は、それぞれ、ビタミンＢｌ、ニコチン酸、ビタミンＢ
６、ビタミンＢ２なとの型で＋ｎ取することが必須であ
る。これと同様に、ＰＱＱは重要な酵素反応の補酵素と
なって機能していることから未同定ではあるがＰＱＱも
ビタミン作用を有する極めて重要な物質であるといえる
。いずれにせよ、ＰＱＱは補酵素として酵素反応又は物
質代謝系を活性化するものであり、医薬品として重要な
役割を果す物質である。
ミンピロリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
１′、ニコチンアミトアデニンシヌクレメチド；１；ス
フエート、ピリドギザールボスフェー１〜、フラヒンア
デニンシヌクレオチド、フラピンモノヌクレオチドなと
は、それぞれ、ビタミンＢｌ、ニコチン酸、ビタミンＢ
６、ビタミンＢ２なとの型で＋ｎ取することが必須であ
る。これと同様に、ＰＱＱは重要な酵素反応の補酵素と
なって機能していることから未同定ではあるがＰＱＱも
ビタミン作用を有する極めて重要な物質であるといえる
。いずれにせよ、ＰＱＱは補酵素として酵素反応又は物
質代謝系を活性化するものであり、医薬品として重要な
役割を果す物質である。
従来、ＰＱＱの製造法としては有機化学的合成法が知ら
レテイル〔例えばＪＡＣ５，、１０３巻、５５９９〜５
６００頁（１９８１）参照〕。しかしながら、有機化学
的合成法には、合成反応が多段階から成るために製造に
時間を要し、異性体をはじめとする副生物の除去のため
に煩雑な操作を必要とし、またＰＱＱの収率も低いとい
う問題があった。
レテイル〔例えばＪＡＣ５，、１０３巻、５５９９〜５
６００頁（１９８１）参照〕。しかしながら、有機化学
的合成法には、合成反応が多段階から成るために製造に
時間を要し、異性体をはじめとする副生物の除去のため
に煩雑な操作を必要とし、またＰＱＱの収率も低いとい
う問題があった。
発明の目的及び構成
本発明者らはかかる従来のＰＱＱの合成法の問題点を排
除し、高純度のＰＱＱを簡単な操作で短時間かつ高収率
で経済的に製造できる方法を開発すべく鋭意研究をすす
めた結果、細胞、特に微生物を培養することによりＰＱ
Ｑを大量かつ経済的に供給することができることを見出
し、本発明をするに至った。
除し、高純度のＰＱＱを簡単な操作で短時間かつ高収率
で経済的に製造できる方法を開発すべく鋭意研究をすす
めた結果、細胞、特に微生物を培養することによりＰＱ
Ｑを大量かつ経済的に供給することができることを見出
し、本発明をするに至った。
すなわち、本発明に従ったＰＱＱの製造方法は、プロタ
ミノバクタ−属もしくはバラコツカス属に属するピロロ
キノリンキノン生産能を有する菌、またはシュードモナ
スＡｍ−２，’シュードモナスＰ１−１、シュードモナ
スＰ２−２、シュードモナスＰ２−３およびシュードモ
ナスＮ１−１のいずれか一種の菌を栄養培地中で培養し
て培養物中にピロロキノリンキノンを生成せしめこれを
採取することから成る。
ミノバクタ−属もしくはバラコツカス属に属するピロロ
キノリンキノン生産能を有する菌、またはシュードモナ
スＡｍ−２，’シュードモナスＰ１−１、シュードモナ
スＰ２−２、シュードモナスＰ２−３およびシュードモ
ナスＮ１−１のいずれか一種の菌を栄養培地中で培養し
て培養物中にピロロキノリンキノンを生成せしめこれを
採取することから成る。
灸盟夕講廣友で効果の具体的説明
ＰＱＱの製造方法として細胞を培養してその培養液中に
ＰＱＱ（及びその類縁化合物）を生成蓄積せしめ、これ
を例えば抽出によって採取する方法としては、本発明者
による方法（特願昭５７− ｚ２ｏｓｓ号明細書）があ
るが、その後、より実用的な方法を開発すべく検副した
結果、本発明の菌を使用することによりＰＱＱＭ積量を
飛躍的に増大させることに成功したものである。
ＰＱＱ（及びその類縁化合物）を生成蓄積せしめ、これ
を例えば抽出によって採取する方法としては、本発明者
による方法（特願昭５７− ｚ２ｏｓｓ号明細書）があ
るが、その後、より実用的な方法を開発すべく検副した
結果、本発明の菌を使用することによりＰＱＱＭ積量を
飛躍的に増大させることに成功したものである。
本発明において使用することのできる微生物を以下に例
示する。
示する。
】、 バラコツカス デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃ
ｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ） ＩＦＯ１
３３０１２、プロタミノバクター ルヘル （Ｐｒｏｔａｍｉｍｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ ）
ＩＦｏ ３７０８３、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ） Ａ １ ２（微工研菌寄第７５９９号
） ４、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｐ １−１（微工研菌寄第７５９８号） ５、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｐ ２ ２（微工研菌寄第７６００号） ６、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｐ ２−３（微工研菌寄第７５９７号） ７、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｎ Ｌ １（微工研菌寄第７５９６号） これらのうち、３〜７の菌は本発明者により分離された
新菌種であり、その菌学的性質は以下の表の通りである
。
ｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ） ＩＦＯ１
３３０１２、プロタミノバクター ルヘル （Ｐｒｏｔａｍｉｍｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ ）
ＩＦｏ ３７０８３、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ） Ａ １ ２（微工研菌寄第７５９９号
） ４、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｐ １−１（微工研菌寄第７５９８号） ５、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｐ ２ ２（微工研菌寄第７６００号） ６、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｐ ２−３（微工研菌寄第７５９７号） ７、 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
Ｎ Ｌ １（微工研菌寄第７５９６号） これらのうち、３〜７の菌は本発明者により分離された
新菌種であり、その菌学的性質は以下の表の通りである
。
（Ｌ、１．下空欄）
以」−の菌学的性質を基準としてＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍ
ａｎｎｕａｌ ｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版（１９７４）の分類基
準により検索すると、いずれも■グラム陰性桿菌、■運
動性、■カタラーゼ、オ ）キシダーセ、ウレアーゼ活
性を有する、■′インド ）−ルを生成しない、■メタ
ノール、エタノールを資化する、■至適ｐＨ６，８〜７
．３、■至適温度３０℃ ［であることから、メタノー
ル資化性シュードモナス属菌であると同定した。シュー
ドモナス属に含まれる種について検索したが、これらと
一致する １公知の菌種を見出すことはできなかった。
ａｎｎｕａｌ ｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版（１９７４）の分類基
準により検索すると、いずれも■グラム陰性桿菌、■運
動性、■カタラーゼ、オ ）キシダーセ、ウレアーゼ活
性を有する、■′インド ）−ルを生成しない、■メタ
ノール、エタノールを資化する、■至適ｐＨ６，８〜７
．３、■至適温度３０℃ ［であることから、メタノー
ル資化性シュードモナス属菌であると同定した。シュー
ドモナス属に含まれる種について検索したが、これらと
一致する １公知の菌種を見出すことはできなかった。
本発明において使用される培養培地の炭素源と １して
は例えばメタノールが使用される。その濃度は０．１〜
５．０％、好ましくは０．５〜３％が良い結果を与える
。メタノールは培養前に全量加えておいてもよく、また
培養中に適宜添加して行っても １よい。
は例えばメタノールが使用される。その濃度は０．１〜
５．０％、好ましくは０．５〜３％が良い結果を与える
。メタノールは培養前に全量加えておいてもよく、また
培養中に適宜添加して行っても １よい。
窒素源としては、アミノ酸、核＃１類のほかに蛋白質加
水分解物、酵母エキス、コーンスティブリ 」カーのよ
うな有機態のものや、アンモニウム塩、肖酸塩などの無
機態のものを使用することができ０ 本発明方法は前記したように、メタノールを原４として
直接発酵法により培養液中にＰＱＱを生気蓄積させる方
法の他に、別途に培養して調製しｂ微生物細胞の洗浄細
胞懸濁液にＰＱＱ生合成のｍ躯体となりうる化合物、す
なわち、メタノール、Ｌタノールなどのアルコール類、
マニトール、フレクトース、グルコースなどの糖質とグ
ルタミン疫、アスパラギン酸、アラニン、千ロジン、ト
ーイなどのアミノ酸の混合物を加えて反応させ、反乙液
中に生成するＰＱＱを取得することもできる。
水分解物、酵母エキス、コーンスティブリ 」カーのよ
うな有機態のものや、アンモニウム塩、肖酸塩などの無
機態のものを使用することができ０ 本発明方法は前記したように、メタノールを原４として
直接発酵法により培養液中にＰＱＱを生気蓄積させる方
法の他に、別途に培養して調製しｂ微生物細胞の洗浄細
胞懸濁液にＰＱＱ生合成のｍ躯体となりうる化合物、す
なわち、メタノール、Ｌタノールなどのアルコール類、
マニトール、フレクトース、グルコースなどの糖質とグ
ルタミン疫、アスパラギン酸、アラニン、千ロジン、ト
ーイなどのアミノ酸の混合物を加えて反応させ、反乙液
中に生成するＰＱＱを取得することもできる。
本発明方法における培養は好気的条件下に、例しば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養するこヒができる。培
養条件は、特に限定ばないが、−間約に言えば、温度θ
〜４０℃、ｐＨ２〜９及び２０〜００時間程度の条件で
実施する。
攪拌や往復振盪方法によって培養するこヒができる。培
養条件は、特に限定ばないが、−間約に言えば、温度θ
〜４０℃、ｐＨ２〜９及び２０〜００時間程度の条件で
実施する。
培養液又は培養物からのＰＱＱの摂取方法は慣目方法に
従って行うことができる。例えば、イオノ交換クロマト
グラフィー、濃縮物のゲル濾過法、凍結乾燥物の溶媒抽
出法あるいはアフィニイティクロマトグラフィーなどが
できる。
従って行うことができる。例えば、イオノ交換クロマト
グラフィー、濃縮物のゲル濾過法、凍結乾燥物の溶媒抽
出法あるいはアフィニイティクロマトグラフィーなどが
できる。
ＰＱＱの補酵素活性の検定と、培養液中の生成物の濃度
の検定は、次のようにして行うことができる。キノ酵素
のアポ酵素の調製には、発明者らがすでに発表した方法
（Ｆε８ｓＬｅｔＬｅｒｓ＋ １３０巻、１７９〜１８
３頁、１９８１年）において使用したシュートモナスエ
ルギノサＩＦＯ３４４５のＤ−グルコース脱水素酵素活
性欠損変異株を用いることができる。
の検定は、次のようにして行うことができる。キノ酵素
のアポ酵素の調製には、発明者らがすでに発表した方法
（Ｆε８ｓＬｅｔＬｅｒｓ＋ １３０巻、１７９〜１８
３頁、１９８１年）において使用したシュートモナスエ
ルギノサＩＦＯ３４４５のＤ−グルコース脱水素酵素活
性欠損変異株を用いることができる。
本菌株ばＰＱＱ生成能を欠くが、その細胞膜中には通雷
のレヘルのアポＤ−グルコース脱水素酵素を生成蓄積し
ている。このような変異株より調製した細胞膜画分にＰ
ＱＱを含む培養液、反応液あるいは菌体抽出液を加える
ことによって、アポ酵素はボロ化され、Ｄ−グルコース
脱水素酵素活性か発現する。発現する酵素活性の強度が
、添加されたＰＱＱの量に比例関係を示すＰＱＱの濃度
域を、化学合成したＰＱＱを用いて測定し検量線を作成
することによって、培養液等の試料中に含まれるＰＱＱ
量をめる（第１図、検量線）。ＰＱＱを定量することは
、ＰＱＱを補酵素とする他の種類のキノ酵素からアポ酵
素を調製し、これにＰＱＱを添加することによって酵素
を活性化することで同様に行うことができる。また、Ｐ
ＱＱの定量は高速液体クロマトグラフィーによっても行
うことができる。
のレヘルのアポＤ−グルコース脱水素酵素を生成蓄積し
ている。このような変異株より調製した細胞膜画分にＰ
ＱＱを含む培養液、反応液あるいは菌体抽出液を加える
ことによって、アポ酵素はボロ化され、Ｄ−グルコース
脱水素酵素活性か発現する。発現する酵素活性の強度が
、添加されたＰＱＱの量に比例関係を示すＰＱＱの濃度
域を、化学合成したＰＱＱを用いて測定し検量線を作成
することによって、培養液等の試料中に含まれるＰＱＱ
量をめる（第１図、検量線）。ＰＱＱを定量することは
、ＰＱＱを補酵素とする他の種類のキノ酵素からアポ酵
素を調製し、これにＰＱＱを添加することによって酵素
を活性化することで同様に行うことができる。また、Ｐ
ＱＱの定量は高速液体クロマトグラフィーによっても行
うことができる。
中Ｖ
以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものではないことはいうまでもな
い。
らの実施例に限定するものではないことはいうまでもな
い。
実施例１
５００ ｍｌ容三角フラスコにメタノール１％、ＮａＮ
Ｏ３０，２％、（ＮＨ４）２Ｓｏ４０．２％、Ｋ２１１
ＰＯ４０，１％、ＭｇＳ％ｙ ７Ｈ２００，０２％、
Ｉ（ａＢＯ３０，００００５％、 Ｃｕ５Ｏ，ｙ ５Ｊ
Ｏ０，０００００４％、ＭｎＳＯ４・）ｌ、ｏ Ｏ−０
０００２％、（ＮＨ４）、 Ｍｏ０４０．００００２％
、ＺｎＳＯ４’ ７Ｉ（，００，００００４％、Ｃｏ
ＣＩｐ・２ Ｆｌ ｚＯＯ，００１５％、ＫＣＩ ０．
００４％、Ｐｅ５ｏ４’ ７１１２０ ０．０００１％
を含む培地（ｐＨ７，０） １００ ｍｌを加え、これ
にパラコツカス デニトリフィカンスＩＦＯ１３３０１
を接種して３０℃で１００〜１２０ｒｐｍで振盪培養し
た。
Ｏ３０，２％、（ＮＨ４）２Ｓｏ４０．２％、Ｋ２１１
ＰＯ４０，１％、ＭｇＳ％ｙ ７Ｈ２００，０２％、
Ｉ（ａＢＯ３０，００００５％、 Ｃｕ５Ｏ，ｙ ５Ｊ
Ｏ０，０００００４％、ＭｎＳＯ４・）ｌ、ｏ Ｏ−０
０００２％、（ＮＨ４）、 Ｍｏ０４０．００００２％
、ＺｎＳＯ４’ ７Ｉ（，００，００００４％、Ｃｏ
ＣＩｐ・２ Ｆｌ ｚＯＯ，００１５％、ＫＣＩ ０．
００４％、Ｐｅ５ｏ４’ ７１１２０ ０．０００１％
を含む培地（ｐＨ７，０） １００ ｍｌを加え、これ
にパラコツカス デニトリフィカンスＩＦＯ１３３０１
を接種して３０℃で１００〜１２０ｒｐｍで振盪培養し
た。
第２図はその培養経過を示したもので、菌の成育が対数
増殖期末期から定常期初期にあたる時期に培養液中のＰ
ＱＱの蓄積が最高になることを示している。第２図は、
培養中の培養液の一部を無菌的にとり出し、遠心分離し
て菌体を除去して得られる」二ン１ｆｔ０．１ｍｌを３
３マイクログラムのアポＩ）−グルコース脱水素酵素を
含む細胞膜画分に加え、室温で３０分放置して酵素をホ
ロ化させたのち、発現した酵素活性の強度から培養液中
のＰＱＱ濃度を算出してグラフに示したものであり、菌
の成育は６００ ｎｍでの吸光度で表示した。
増殖期末期から定常期初期にあたる時期に培養液中のＰ
ＱＱの蓄積が最高になることを示している。第２図は、
培養中の培養液の一部を無菌的にとり出し、遠心分離し
て菌体を除去して得られる」二ン１ｆｔ０．１ｍｌを３
３マイクログラムのアポＩ）−グルコース脱水素酵素を
含む細胞膜画分に加え、室温で３０分放置して酵素をホ
ロ化させたのち、発現した酵素活性の強度から培養液中
のＰＱＱ濃度を算出してグラフに示したものであり、菌
の成育は６００ ｎｍでの吸光度で表示した。
酵素活性をめるために、予めホロ化した上記の酵素液（
０，１１ｍ１）に５０ｍ１１）リスヒドロキシアミノメ
タン−塩＠緩衝？ｆＫ、ｐＨ８，７５、にアジ化ナトリ
ウムを２４ｍＭ含むもの１ｍｌ、６．７ｍＭ ２．６−
シクロロフエノールインドフエノール０．０４ｍ１．６
ｍＭフエナンンメトスルフエＩ−０，２ｍｌを加え、
反応液全量を水で２．９ ｍｌとし、２５℃で６００
ｎｍの吸光度変化を調べ、同様に調製した盲検との間で
吸光度に増減が生じないことを確認した。次いで８ｍＭ
アジ化ナトリウムを含む１Ｍグルコースを一方のキュベ
ｙ ｌ〜に０．１ ｍｌ加え、その時点以降の吸光度変
化をレコーダーで記録した。ボロ化の程度及びボロ酵素
の濃度と２．６−シクロロフエノールインドフエノール
の退色とがよい相関を示す。化学合成されたＰＱＱを用
いて、同様の操作によって得た第１図の検量線から各試
料中のＰＱＱ濃度を算出した。
０，１１ｍ１）に５０ｍ１１）リスヒドロキシアミノメ
タン−塩＠緩衝？ｆＫ、ｐＨ８，７５、にアジ化ナトリ
ウムを２４ｍＭ含むもの１ｍｌ、６．７ｍＭ ２．６−
シクロロフエノールインドフエノール０．０４ｍ１．６
ｍＭフエナンンメトスルフエＩ−０，２ｍｌを加え、
反応液全量を水で２．９ ｍｌとし、２５℃で６００
ｎｍの吸光度変化を調べ、同様に調製した盲検との間で
吸光度に増減が生じないことを確認した。次いで８ｍＭ
アジ化ナトリウムを含む１Ｍグルコースを一方のキュベ
ｙ ｌ〜に０．１ ｍｌ加え、その時点以降の吸光度変
化をレコーダーで記録した。ボロ化の程度及びボロ酵素
の濃度と２．６−シクロロフエノールインドフエノール
の退色とがよい相関を示す。化学合成されたＰＱＱを用
いて、同様の操作によって得た第１図の検量線から各試
料中のＰＱＱ濃度を算出した。
ＰＱＱが最高に生成される時点で培養を停止し、菌体を
除去して得られる培養液を予め０．００２ Ｍリン酸カ
リウム、ｐｌ＋７．０、で緩衝化しておいたＤＥＡＥセ
ファデックスＡ−２５カラム（生化学工業９１製）に吸
着させ、０．２ Ｍ ＫＣＩを含む同緩衝液によって不
純物を溶出させた後、０．６ Ｍ ＫＣＩを含む緩衝液
によって溶出されてくる両分にＰＱＱが含まれていた。
除去して得られる培養液を予め０．００２ Ｍリン酸カ
リウム、ｐｌ＋７．０、で緩衝化しておいたＤＥＡＥセ
ファデックスＡ−２５カラム（生化学工業９１製）に吸
着させ、０．２ Ｍ ＫＣＩを含む同緩衝液によって不
純物を溶出させた後、０．６ Ｍ ＫＣＩを含む緩衝液
によって溶出されてくる両分にＰＱＱが含まれていた。
得られたＰＱＱ画分を下記条件で液体クロマトグラフィ
ー分析を行ったところ、化学合成されたＰＱＱと両者は
ピークの保持時間（１３分）が一致していた。
ー分析を行ったところ、化学合成されたＰＱＱと両者は
ピークの保持時間（１３分）が一致していた。
機 器二日本分光製高速液体クロマ１−グラフ、）・ラ
イｌ−１−ター カラム： Ｈ’Ｗ−４ＯＳ （＋−ヨハール）溶Ｍｌｔ
ｌ＆：水−７−１＝ｌ−＝ＭＪル（１： １）検出器：
ＵＶ（２５４ｎｍ） 流速： １．０ ｍｌ／ ｍｉｎ 次に、ＰＱＱ画分から大量分取して、ＰＱＱを単離し、
ＰＱＱ３２５μｇを得た。
イｌ−１−ター カラム： Ｈ’Ｗ−４ＯＳ （＋−ヨハール）溶Ｍｌｔ
ｌ＆：水−７−１＝ｌ−＝ＭＪル（１： １）検出器：
ＵＶ（２５４ｎｍ） 流速： １．０ ｍｌ／ ｍｉｎ 次に、ＰＱＱ画分から大量分取して、ＰＱＱを単離し、
ＰＱＱ３２５μｇを得た。
実施例２． ３． ４． ５． ６及び７実施例１と同
様にして第３表に示した微生物を培養し、培養液中のＰ
ＱＱ量を定量した。
様にして第３表に示した微生物を培養し、培養液中のＰ
ＱＱ量を定量した。
第３表
実施例 培養時間（ｈｒ） ＰＱＱ量（μｇ／ｍり２
９４ ５．８ ３ ４５ ４．９ ４ ６０ ４．６ ５ ５０ １４．５ ６ ６０ ７．８ ７ ５０ ２６．１ 脚注 実施例２ニブロタミノバククー ルベルＩＰ０３７０Ｂ
実施例３：シュードモナス Ａ１−２ （微工研菌寄第７５９９号） 実施例４：シュードモナス Ｐｌ−１ （微工研菌寄第７５９８号） 実施例５：シュードモナス Ｐ２−２ （微工研菌寄第７６００号） 実施例６：シュードモナス Ｐ２−３ （微゛工研菌寄第７５９７号） 実施例７：シュードモナス Ｎ１−１ （微工研菌寄第７５９６号） 実施例８ ５ＯＮ容培養タンクに、実施例１で用いたのと同一の組
成の培地３０１を加え、これにシュードモナスＮ１−１
（微工研菌寄第７５９６号）を接種し、３０１／分の
通気及び５００ｒｐｍの攪拌条件下に通気培養した。培
地中のメタノールを追加してメタノール濃度を１％に維
持しながら、５０時間培養した。
９４ ５．８ ３ ４５ ４．９ ４ ６０ ４．６ ５ ５０ １４．５ ６ ６０ ７．８ ７ ５０ ２６．１ 脚注 実施例２ニブロタミノバククー ルベルＩＰ０３７０Ｂ
実施例３：シュードモナス Ａ１−２ （微工研菌寄第７５９９号） 実施例４：シュードモナス Ｐｌ−１ （微工研菌寄第７５９８号） 実施例５：シュードモナス Ｐ２−２ （微工研菌寄第７６００号） 実施例６：シュードモナス Ｐ２−３ （微゛工研菌寄第７５９７号） 実施例７：シュードモナス Ｎ１−１ （微工研菌寄第７５９６号） 実施例８ ５ＯＮ容培養タンクに、実施例１で用いたのと同一の組
成の培地３０１を加え、これにシュードモナスＮ１−１
（微工研菌寄第７５９６号）を接種し、３０１／分の
通気及び５００ｒｐｍの攪拌条件下に通気培養した。培
地中のメタノールを追加してメタノール濃度を１％に維
持しながら、５０時間培養した。
ＰＱＱ生成量は３０μｇ／ｍｌであった。
実施例９
実施例１において、メタノール濃度を変えて６４ｈｒ培
養を行った。
養を行った。
メタノール濃度 ＰＱＱ量（８ｇ７ｍ１）０、１ ０．
５ ０、２５ １．８ ０、５ ２．０ １．０ ４．５ ３、０ ３．６ 実施例ＩＯ 実施例１に示した培地と同組成の培地を用いてブロクミ
ノバクター ルベル ＩＰｏ ３７０Ｂの培養を行い、
得られた菌体を蒸留水で洗浄後、０Ｄ６００−１０、Ｏ
になるように菌体に蒸留水を加えてこれを洗浄細胞懸濁
液とした。
５ ０、２５ １．８ ０、５ ２．０ １．０ ４．５ ３、０ ３．６ 実施例ＩＯ 実施例１に示した培地と同組成の培地を用いてブロクミ
ノバクター ルベル ＩＰｏ ３７０Ｂの培養を行い、
得られた菌体を蒸留水で洗浄後、０Ｄ６００−１０、Ｏ
になるように菌体に蒸留水を加えてこれを洗浄細胞懸濁
液とした。
洗浄細胞懸濁液をＯＤ６ω＝１．０になるように０．１
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ａｌ１７．０゛）で希釈後に
メタノール濃度が１．０％、グルタミン酸濃度が０．６
％になるようにメタノール又はグルタミン酸を加えて３
０℃で反応を行った。生成したＰＱＱは実施例１と同様
に定量した。
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ａｌ１７．０゛）で希釈後に
メタノール濃度が１．０％、グルタミン酸濃度が０．６
％になるようにメタノール又はグルタミン酸を加えて３
０℃で反応を行った。生成したＰＱＱは実施例１と同様
に定量した。
結果を以下の第４表に示す。
第４表
添加物 ＰＱＱｉＪｉ度（Ｘｕｇ／ｍ１）６時間後 １
５時間後 メタノール ２．８’ ４．３ メタノール→− グルタミン酸 ４．、８ ３．８ な し ０．２ ０．６
５時間後 メタノール ２．８’ ４．３ メタノール→− グルタミン酸 ４．、８ ３．８ な し ０．２ ０．６
第１図は培養液等の試料中に含まれるＰＱＱの量をめる
検量線を示すグラフ図であり、図の縦軸は０．１６ ｍ
ｇの膜を用いた場合の６００ ｎｍにおける１分当りの
吸光度差（へ〇Ｄ釦。／分／ ０．１６ ｍｇ蛋白質）
を示し、横軸はＰＱＱモル濃度（ＸＩＯ”）を示す。 第２図は実施例１の培養経過を示すグラフ図であり、図
の横軸は培養時間（時間）を示し、左縦軸はＰＱＱｉＪ
１度（μｇ／ｍｌ）を示し、右縦軸は菌の成育を（ＯＤ
６００）で示したものであり、曲線（イ）はＰＱＱｉ度
、曲線（ロ）は菌の成育を示す。 特許出願人 宇部興産株式会社 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士 石 １） 敬 弁理士 山 口 昭 之 弁理士西山雅也 第１図 ×１０モルＰＱＱ。
検量線を示すグラフ図であり、図の縦軸は０．１６ ｍ
ｇの膜を用いた場合の６００ ｎｍにおける１分当りの
吸光度差（へ〇Ｄ釦。／分／ ０．１６ ｍｇ蛋白質）
を示し、横軸はＰＱＱモル濃度（ＸＩＯ”）を示す。 第２図は実施例１の培養経過を示すグラフ図であり、図
の横軸は培養時間（時間）を示し、左縦軸はＰＱＱｉＪ
１度（μｇ／ｍｌ）を示し、右縦軸は菌の成育を（ＯＤ
６００）で示したものであり、曲線（イ）はＰＱＱｉ度
、曲線（ロ）は菌の成育を示す。 特許出願人 宇部興産株式会社 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士 石 １） 敬 弁理士 山 口 昭 之 弁理士西山雅也 第１図 ×１０モルＰＱＱ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 ブロタミノバククー属もしくはバラコツカス属に
属するピロロキノリンキノン生産能を有する菌。またば
シュードモナスＡｌ−２、シュードモナスＰ１−１、シ
ュードモナスＰ２−２、シュードモナスＰ２−３および
シュードモナスＮ１−１のいずれか一種の菌を栄養培地
で培養して培養物中にピロロキノリンキノンを生成せし
め、これを採取することを特徴とするピロロキノリンキ
ノンの製造方法。 ２、 プロタミノパククー属もしくはバラコツカス属に
属するピロロキノリンキノン生産能を有する菌またはシ
ュードモナスＡ１−２、シュードモナスＰ１−１、シュ
ートモナスＰ２−２、シュードモナスＰ２−３およびシ
ュードモナスＮ１−１のいずれか一種の菌を栄養培地で
培養して得られる菌体を分離し、この菌体の存在下にア
ルコールまたは糖質とアンモニウム塩またはアミノ酸と
を反応させてピロロキノリンキノンを生成せしめること
を特徴とするピロロキノリンキノンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59107406A JPS60251895A (ja) | 1984-05-29 | 1984-05-29 | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
| EP85303651A EP0164943B1 (en) | 1984-05-29 | 1985-05-23 | Process for production of pyrrolo-quinoline quinone |
| DE8585303651T DE3582902D1 (de) | 1984-05-29 | 1985-05-23 | Verfahren zur herstellung von pyrrolochinolinchinon. |
| US07/357,668 US4994382A (en) | 1984-05-29 | 1989-05-26 | Process for production of pyrrolo-quinoline quinone |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59107406A JPS60251895A (ja) | 1984-05-29 | 1984-05-29 | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60251895A true JPS60251895A (ja) | 1985-12-12 |
| JPH0516833B2 JPH0516833B2 (ja) | 1993-03-05 |
Family
ID=14458335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59107406A Granted JPS60251895A (ja) | 1984-05-29 | 1984-05-29 | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4994382A (ja) |
| EP (1) | EP0164943B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60251895A (ja) |
| DE (1) | DE3582902D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61247397A (ja) * | 1985-04-24 | 1986-11-04 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5344768A (en) * | 1985-04-24 | 1994-09-06 | Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc. | Process for the preparation of pyrrolo-quinoline quinone |
| EP0206471B1 (en) * | 1985-04-24 | 1992-10-14 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for preparation of pyrrolo-quinoline quinone |
| US5236930A (en) * | 1989-11-13 | 1993-08-17 | Mitbushi Gas Chemical Company, Inc. | Oxazopyrroloquinolines and use of oxazopyrroloquinolines |
| JP3041840B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2000-05-15 | 東洋紡績株式会社 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
| DE4311464A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase |
| US5834231A (en) | 1996-10-24 | 1998-11-10 | Archer Daniels Midland Co. | Bacterial strains and use thereof in fermentation process for 2-keto-L-gulonic acid production |
| CN1317042A (zh) | 1998-09-11 | 2001-10-10 | 阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司 | 生产2－酮－l－古洛糖酸的细菌菌株 |
| US6656697B1 (en) * | 1998-09-28 | 2003-12-02 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US5902731A (en) * | 1998-09-28 | 1999-05-11 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| AU2001253162A1 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-23 | Archer-Daniels-Midland Company | Ketogulonigenium shuttle vectors |
| WO2001077348A2 (en) * | 2000-04-05 | 2001-10-18 | Archer-Daniels-Midland Company | Ketogulonigenium endogenous plasmids |
| WO2004008086A1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-01-22 | Strube, Inc. | Liquid level sensor using fluorescence in an optical waveguide |
| US7172890B2 (en) * | 2004-10-28 | 2007-02-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Inactivated enzyme variants and associated process and reagent system |
| US8362436B1 (en) | 2006-03-14 | 2013-01-29 | Advanced Precision Inc. | Electro-optic fluid quantity measurement system |
| KR101664608B1 (ko) | 2014-12-05 | 2016-10-10 | 주식회사 성운바이오 | 신규한 하이포마이크로비움속 미생물 및 이를 이용한 피로로퀴놀린 퀴논의 제조방법 |
| CN105294687B (zh) * | 2015-12-02 | 2016-11-16 | 郑州轻工业学院 | 离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法 |
| CN105624084B (zh) * | 2016-01-28 | 2019-04-16 | 福建师范大学 | 定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌 |
| KR102120670B1 (ko) | 2019-01-03 | 2020-06-10 | 주식회사 누베파마 | 돌연변이 균주를 이용한 항산화 물질 생산 방법 |
| CN110698472B (zh) * | 2019-09-11 | 2020-09-04 | 北大方正集团有限公司 | 一种吡咯喹啉醌的纯化方法 |
| CN112194658A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-01-08 | 内蒙古拜克生物有限公司 | 一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法 |
| CN113981021B (zh) * | 2021-05-21 | 2023-09-26 | 江苏一鸣生物科技有限公司 | 一种通过嗜氨副球菌发酵合成pqq的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1370892A (en) * | 1970-12-09 | 1974-10-16 | Ici Ltd | Microbiological production of protein |
| JPS59113896A (ja) * | 1982-12-17 | 1984-06-30 | Ube Ind Ltd | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
| EP0206471B1 (en) * | 1985-04-24 | 1992-10-14 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for preparation of pyrrolo-quinoline quinone |
-
1984
- 1984-05-29 JP JP59107406A patent/JPS60251895A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-23 DE DE8585303651T patent/DE3582902D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-23 EP EP85303651A patent/EP0164943B1/en not_active Expired
-
1989
- 1989-05-26 US US07/357,668 patent/US4994382A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61247397A (ja) * | 1985-04-24 | 1986-11-04 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
| JPH0510077B2 (ja) * | 1985-04-24 | 1993-02-08 | Mitsubishi Gas Chemical Co |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3582902D1 (de) | 1991-06-27 |
| US4994382A (en) | 1991-02-19 |
| EP0164943B1 (en) | 1991-05-22 |
| EP0164943A2 (en) | 1985-12-18 |
| EP0164943A3 (en) | 1987-12-09 |
| JPH0516833B2 (ja) | 1993-03-05 |
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