JPH0516833B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明は細胞を用いて下記化学構造式（）の
ピロロキノリンキノン（以下PQQと略称する）
を製造する方法に関する。 従来技術 PQQはキノ酵素のアポ型酵素をホロ化して酵
素を活性化する能力を有し、メタノール資化性細
菌のメタノール脱水素酵素、酢酸菌のアルコール
脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グリセリン
脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素などの補酵
素として機能しているほか、動物、植物及び微生
物起源の銅を含むアミン酸化酵素、アミン脱水素
酵素及びコリン脱水素酵素又はカルボニル試薬で
阻害される他に多くの酸化還元酵素の補酵素とし
て、生理学的に重要な機能を有する物質である。
更に他の酸化還元酵素や転移酵素の補酵素、例え
ばチアミンピロリン酸、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフエート、ピリドキサールホスフエ
ート、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビ
ンモノヌクレオチドなどは、それぞれ、ビタミン
B1、ニコチン酸、ビタミンB6、ビタミンB2など
の型で摂取することが必須である。これと同様
に、PQQは重要な酵素反応の補酵素となつて機
能していることから未同定ではあるがPQQもビ
タミン作用を有する極めて重要な物質であるとい
える。いずれにせよ、PQQは補酵素として酵素
反応又は物質代謝系を活性化するものであり、医
薬品として重要な役割を果す物質である。 従来、PQQの製造法としては有機化学的合成
法が知られている〔例えばJACS.、103巻、5599
〜5600頁（1981）参照〕。しかしながら、有機化
学的合成法には、合成反応が多段階から成るため
に製造に時間を要し、異性体をはじめとする副生
物の除去のために煩雑な操作を必要とし、また
PQQの収率も低いという問題があつた。 発明の目的及び構成 本発明者らはかかる従来のPQQの合成法の問
題点を排除し、高純度のPQQを簡単な操作で短
時間かつ高収率で経済的に製造できる方法を開発
すべく鋭意研究をすすめた結果、細胞、特に微生
物を培養することによりPQQを大量かつ経済的
に供給することができることを見出し、本発明を
するに至つた。 すなわち、本発明に従つたPQQの製造方法は、
プロタミノバクター属もしくはパラコツカス属に
属するピロロキノリンキノン生産能を有する菌、
またはシユードモナスA1−２、シユードモナス
P1−１、シユードモナスP2−２、シユードモナ
スP2−３およびシユードモナスN1−１のいずれ
か一種の菌を栄養培地中で培養して培養物中にピ
ロロキノリンキノンを生成せしめこれを採取する
ことから成る。 発明の構成及び効果の具体的説明 PQQの製造方法として細胞を培養してその培
養液中にPQQ（及びその類縁化合物）を生成蓄積
せしめ、これを例えば抽出によつて採取する方法
としては、本発明者による方法（特願昭57−
22038号明細書）があるが、その後、より実用的
な方法を開発すべく検討した結果、本発明の菌を
使用することによりPQQ蓄積量を飛躍的に増大
させることに成功したものである。 本発明において使用することのできる微生物を
以下に例示する。 １ パラコツカス デニトリフイカンス
（Paracoccus denitrificans）IFO13301 ２ プロタミノバクター ルベル
（Protamimobacter ruber）IFO3708 ３ シユードモナス（Pseudomonas）A1−２
（微工研菌寄第7599号） ４ シユードモナス（Pseudomonas）P1−１（微
工研菌寄第7598号） ５ シユードモナス（Pseudomonas）P2−２（微
工研菌寄第7600号） ６ シユードモナス（Pseudomonas）P2−３（微
工研菌寄第7597号） ７ シユードモナス（Pseudomonas）N1−１
（微工研菌寄第7596号） これらのうち、３〜７の菌は本発明者により分
離された新菌種であり、その菌学的性質は以下の
表の通りである。

【表】

【表】

【表】 − なし
以上の菌学的性質を基準としてBergey′s
Mannual of Determinative Becteriology第８
版（1974）の分類基準により検索すると、いずれ
もグラム陰性稈金、運動性、カタラーゼ、
オキシダーゼ、ウレアーゼ活性を含有する、イ
ンドールを生成しない、メタノール、エタノー
ルを資化する、至適PH6.8〜7.3、至適温度30
℃であることから、メタノール資化性シユードモ
ナス属菌であると同定した。シユードモナス属に
含まれる種について検索したが、これらと一致す
る公知の菌種を見出すことはできなかつた。 本発明において使用される培養培地の炭素源と
しては例えばメタノールが使用される。その濃度
は0.1〜5.0％、好ましくは0.5〜３％が良い結果を
与える。メタノールは培養前に全量加えておいて
もよく、また培養中に適宜添加して行つてもよ
い。 窒素源としては、アミノ酸、核酸類のほかに蛋
白質加水分解物、酵母エキス、コーンステイブリ
カーのような有機態のものや、アンモニウム塩、
硝酸塩などの無機態のものを使用することができ
る。 本発明方法は前記したように、メタノールを原
料として直接発酵法により培養液中にPQQを生
成蓄積させる方法の他に、別途に培養して調製し
た微生物細胞の洗浄細胞懸濁液にPQQ生合成の
前駆体となりうる化合物、すなわち、メタノー
ル、エタノールなどのアルコール類、マニトー
ル、フルクトース、グルコースなどの糖質とグル
タミン酸、アスパラギン酸、アラニン、チロシ
ン、ドーパなどのアミノ酸の混合物を加えて反応
させ、反応液中に生成するPQQを取得すること
もできる。 本発明方法における培養は好気的条件下に、例
えば通気撹拌や往復振盪方法によつて培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一
般的に言えば、温度０〜40℃、PH２〜９及び20〜
100時間程度の条件で実施する。 培養液又は培養物からのPQQの摂取方法は慣
用方法に従つて行うことができる。例えば、イオ
ン交換クロマトグラフイー、濃縮物のゲル濾過
法、凍結乾燥物の溶媒抽出法あるいはアフイニイ
テイクロマトグラフイーなどができる。 PQQの補酵素活性の検定と、培養液中の生成
物の濃度の検定は、次のようにして行うことがで
きる。キノ酵素のアポ酵素の調製には、発明者ら
がすでに発表いた方法（FEBS Letters、130巻、
179〜183頁、1981年）において使用したシユール
ドモナスエルギノサIFO3445のＤ−グルコース脱
水素酵素活性欠損変異株を用いることができる。
本菌株はPQQ生成能を欠くが、その細胞膜中に
は通常のレベルのアポＤ−グルコース脱水素酵素
を生成蓄積している。このような変異株より調製
した細胞膜画分にPQQを含む培養液、反応液あ
るいは菌体抽出液を加えることによつて、アポ酵
素はホロ化され、Ｄ−グルコース脱水素酵素活性
が発現する。発現する酵素活性の強度が、添加さ
れたPQQの量に比例関係を示すPQQの濃度域を、
化学合成したPQQを用いて測定し検量線を作成
することによつて、培養液等の試料中に含まれる
PQQ量を求める（第１図、検量線）。PQQを定量
することは、PQQを補酵素とする他の種類のキ
ノ酵素からアポ酵素を調製し、これにPQQを添
加することによつて酵素を活性化することで同様
に行うことができる。また、PQQの定量は高速
液体クロマトグラフイーによつても行うことがで
きる。 実施例 以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものではないこ
とはいうまでもない。 実施例 １ 500ml容三角フラスコにメタノール１％、
NaNO₃0.2％、（NH₄）₂SO₄0.2％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O0.02％、H₃BO₃0.00005％、
CuSO₄・5H₂O0.000004％、MnSO₄・H₂O0.00002
％、（NH₄）₂MoO₄0.00002％、ZnSO₄・
7H₂O0.00004％、CoCl₂・2H₂O0.0015％、
KCl0.004％、FeSO₄・7H₂O0.0001％を含む培地
（PH7.0）100mlを加え、これにパラコツカス デ
ニトリフイカンスIFO13301を接種して30℃で100
〜120rpmで振盪培養した。 第２図はその培養経過を示したもので、菌の生
育が対数増殖期末期から定常期初期にあたる時期
に培養液中のPQQの蓄積が最高になることを示
している。第２図は、培養中の培養液の一部を無
菌的にとり出し、遠心分離して菌体を除去して得
られる上清0.1mlを33マイクログラムのアポＤ−
グルコース脱水素酵素を含む細胞膜画分に加え、
室温で30分放置して酵素をホロ化させたのち、発
現した酵素活性の強度から培養液中のPQQ濃度
を算出してグラフに示したものであり、菌の成育
は600nｍでの吸光度で表示した。 酵素活性を求めるために、予めホロ化した上記
の酵素液（0.11ml）に50ｍＭトリスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸緩衝液、PH8.75、にアジ化ナト
リウムを24ｍＭ含むもの１ml、6.7ｍＭ、２，６
−ジクロロフエノールインドフエノール0.04ml、
６ｍＭフエナジンメトスルフエート0.2mlを加え、
反応液全量を水で2.9mlとし、25℃で600nｍの吸
光度変化を調べ、同様に調製した盲検との間で吸
光度に増減が生じないことを確認した。次いで８
ｍＭアジ化ナトリウムを含む1Mグルコースを一
方のキユベツトに0.1ml加え、その時点以降の吸
光度変化をレコーダーで記録した。ホロ化の程度
及びホロ酵素の濃度と２，６−ジクロロフエノー
ルインドフエノールの退色とがよい相関を示す。
化学合成されたPQQを用いて、同様の操作によ
つて得た第１図の検量線から各試料中のPQQ濃
度を算出した。PQQが最高に生成される時点で
培養を停止し、菌体を除去して得られる培養液を
予め0.002Mリン酸カリウム、PH7.0、で緩衝化し
ておいたDEAEセフアデツクスＡ−25カラム（生
化学工業(株)製）に吸着させ、0.2M KClを含む同
緩衝液によつて不純物を溶出させた後、0.6M
KClを含む緩衝液によつて溶出されてくる画分に
PQQが含まれていた。 得られたPQQ画分を下記条件で液体クロマト
グラフイー分析を行つたところ、化学合成された
PQQと両者はピークの保持時間（13分）が一致
していた。 機器：日本分光製高速液体クロマトグラフ、トラ
イローター カラム：HW−40S（トヨバール） 溶離液：水−アセトニトリル（１：１） 検出器：UV（254nｍ） 流速：1.0ml／min 次に、PQQ画分から大量分取して、PQQを単
離し、PQQ325μｇを得た。 実施例２、３、４、５、６及び７ 実施例１と同様にして第３表に示した微生物を
培養し、培養液中のPQQ量を定量した。

【表】 実施例 ８ 50容培養タンクに、実施例１で用いたのと同
一の組成の培地30を加え、これにシユードモナ
スN1−１（微工研菌寄第7596号）を接種し、30
／分の通気及び500rpmの撹拌条件下に通気培
養した。培地中のメタノールを追加してメタノー
ル濃度を１％に維持しながら、50時間培養した。
PQQ生成量は30μｇ／mlであつた。 実施例 ９ 実施例１において、メタノール濃度を変えて
64hr培養を行つた。 メタノール濃度 PQQ量（μｇ／ml） 0.1 0.5 0.25 1.8 0.5 2.0 1.0 4.5 3.0 3.6 実施例 10 実施例１に示した培地と同組成の培地を用いて
プロタミノバクター ルベルIFO3708の培養を行
い、得られた菌体を蒸留水で洗浄後、OD₆₀₀＝
10.0になるように菌体に蒸留水を加えてこれを洗
浄細胞懸濁液とした。 洗浄細胞懸濁液をOD₆₀₀＝1.0になるように
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）で希釈後に
メタノール濃度が1.0％、グルタミン酸濃度が0.6
％になるようにメタノール又はグルタミン酸を加
えて30℃で反応を行つた。生成したPQQは実施
例１と同様に定量した。 結果を以下の第４表に示す。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は培養液等の試料中に含まれるPQQの
量を求める検量線を示すグラフ図であり、図の縦
軸は0.16mgの膜を用いた場合の600nｍにおける１
分当りの吸光度差（ΔOD₆₀₀／分／0.16mg蛋白質）
を示し、横軸はPQQモル濃度（×10^-12）を示す。
第２図は実施例１の培養経過を示すグラフ図であ
り、図の横軸は培養時間（時間）を示し、左縦軸
はPQQ濃度（μｍ／ml）を示し、右縦軸は菌の
成育を（OD₆₀₀）で示したものであり、曲線イは
PQQ濃度、曲線ロは菌の成育を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロタミノバクター属もしくはパラコツカス
   属に属するピロロキノリンキノン生産能を有する
   菌、またはシユードモナスA1−２、シユードモ
   ナスP1−１、シユードモナスP2−２、シユード
   モナスP2−３およびシユードモナスN1−１のい
   ずれか一種の菌を栄養培地で培養して培養物中に
   ピロロキノリンキノンを生成せしめ、これを採取
   することを特徴とするピロロキノリンキノンの製
   造方法。 ２ プロタミノバクター属もしくはパラコツカス
   属に属するピロロキノリンキノン生産能を有する
   菌またはシユードモナスA1−２、シユードモナ
   スP1−１、シユードモナスP2−２、シユードモ
   ナスP2−３およびシユードモナスN1−１のいず
   れか一種の菌を栄養培地で培養して得られる菌体
   を分離し、この菌体の存在下にアルコールまたは
   糖質とアンモニウム塩またはアミノ酸とを反応さ
   せてピロロキノリンキノンを生成せしめることを
   特徴とするピロロキノリンキノンの製造方法。