CN105624084B

CN105624084B - 定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌

Info

Publication number: CN105624084B
Application number: CN201610059296.3A
Authority: CN
Inventors: 柯崇榕; 黄建忠; 廖灿; 钟璐芳; 杨欣伟; 任洋
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: FUJIAN LIDUOLI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2036-01-28
Also published as: CN105624084A

Abstract

本发明公开了定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌。本发明提供了一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法，包括如下步骤:1)将初始甲基营养菌作为处理对象在含有甲醇的液体培养基中进行多次诱导培养，得到驯化后菌，所有驯化后菌组成驯化菌株库；2)发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；3)检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株。本发明通过逐步提高培养基中的甲醇浓度对甲基营养菌进行应激驯化，提高了选育正突变率以及吡咯喹啉醌产量增加幅度。

Description

定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌。

背景技术

吡咯喹啉醌(pyrroloquinol ine quinone，PQQ)作为细菌脱氢酶辅酶参与呼吸链电子传递，具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细菌对毒性和辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。PQQ的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法是以无机培养基为主，成本低，产率较高且利于下游纯化，是工业化规模生产的主要方向。

菌种选育是稳定菌种质量，提高发酵水平的有效手段。PQQ的生物合成机制尚未彻底阐明，基因工程改造代谢途径难度较大，诱变育种仍然是PQQ产生菌的主要选育方法。菌种选育一般分为突变库的构建和高产株筛选两个部分。PQQ突变库的构建通常采用单纯的物理、化学及其复合诱变，操作简单、速度快，但正突变率低，筛选工作量巨大。《紫外线—氯化锂诱变选育吡咯喹啉醌高产菌》(《安徽农业科学》第41卷第34期)公开了利用紫外线—氯化锂诱变肺炎克雷伯氏菌构建突变株库，并采用氧化还原法筛选高产突变株。该方法构建的突变库的正突变株的比例低，从200株的突变库中只筛选获得3株产量明显提高的突变株，筛选效率低下。

目前报道的PQQ测定方法有重组酶法、薄层色谱法、活性电泳法、光谱法、氧化还原法和高效液相色谱法，重组酶法专一性强、灵敏度高，但所用的脱氢酶纯化制备繁琐不易大量获得且酶活测定过程复杂；薄层色谱法简便直观，但样品处理繁琐耗时无法定量分析；活性电泳法灵敏度高，抗干扰强，但耗时费力无法定量分析；光谱法精密度高，抗干扰性较差；氧化还原法操作简便，但使用的硝基四唑蓝极易被氧化，准确性低；高效液相色谱法准确度和灵敏度高，但工序复杂耗时，无法快速测定大量样品，效率低。高产株筛选要经过初筛和复筛两阶段，初筛的菌株量大，如果采用繁琐费时的测定方法，筛选效率低下。《3种检测吡咯喹啉醌的方法比较》(《生物技术通讯》第22卷第4期)公开了利用D₃₂₆nm值与D₄₀₀nm值的差值来检测PQQ含量的方法。该方法精密度高，但该方法的检测限较窄，需要对样品进行稀释，影响筛选效率。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤:

1)将初始甲基营养菌作为处理对象在含有甲醇的液体培养基中进行多次诱导培养，得到驯化后菌，所有驯化后菌组成驯化菌株库；

每次所述诱导培养的处理对象为上一次诱导培养后菌，且每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇浓度呈依次递增的状态；

2)发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；

3)检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株。

上述方法中，步骤1)中，每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5-1％。

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8，其每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高1％，具体从2％-8％。

脱氮生丝微菌FJNU-6CGMCC NO.1.12893，其每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5％，具体从0.5％-8％。

Methylobacterium extorquens CGMCC NO.1.6987，其每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5％，具体从1％-8％。

上述方法中，所述每次诱导培养为培养至菌体OD₆₀₀值比该次诱导培养前体系中菌体OD₆₀₀值增加1.2-1.5；所述每次诱导培养为培养至菌体OD₆₀₀值比该次诱导培养前体系中菌体OD₆₀₀值具体增加1.5。

上述含有甲醇的液体培养基为将甲醇与液体培养基混匀，得到培养基，所述甲醇的体积百分含量为0.5％-10％。

上述方法中，所述步骤3)中，所述检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌采用酶标仪检测。

上述方法中，所述酶标仪检测波长为330nm。

上述酶标仪检测为测定OD330值，再通过图2所示标曲得到PQQ产量。

上述方法中，在酶标仪检测步骤后，还包括用HPLC鉴定PQQ产量(图3所示标曲)的步骤。

上述方法中，所述甲基营养菌为利用甲醇为唯一碳源进行生长的革兰阴性细菌。

上述方法中，所述利用甲醇为唯一碳源进行生长的革兰阴性细菌为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)或其诱变菌株，具体为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-R8或脱氮生丝微菌FJNU-6 CGMCC NO.1.12893。

上述方法中，所述利用甲醇为唯一碳源进行生长的革兰阴性细菌为扭托甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)或其诱变菌株，具体为扭托甲基杆菌Methylobacteriumextorquens CGMCC NO.1.6987。

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8已于2015年3月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.10620，分类命名为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)。

本发明的实验证明，本发明通过逐步提高培养基中的甲醇浓度对甲基营养菌进行应激驯化，提高了选育正突变率以及吡咯喹啉醌产量增加幅度；同时根据吡咯喹啉醌在330nm的特征吸收峰，利用紫外分光光度法结合酶标仪批量快速测定吡咯喹啉醌样品，提高检测效率；最后通过HPLC法对少量初筛的高产菌株进行复筛，获得吡咯喹啉醌高产突变株，提高了筛选效率，缩减了育种周期。

附图说明

图1为PQQ标准品与发酵液上清的全波长扫描图谱。

图2为PQQ浓度--330nm吸光值的标准曲线图。

图3为HPLC检测的PQQ标准曲线图。

图4为脱氮生丝微菌FJNU-R8突变株的PQQ含量。

图5为脱氮生丝微菌CGMCC NO.1.12893突变株的PQQ含量。

图6为扭托甲基杆菌CGMCC NO.1.6987突变株的PQQ含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

下面的实施例中菌株如下：

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-6 CGMCC NO.1.12893已于2015年3月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.1.12893，分类命名为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)。扭托甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)CGMCC NO.1.6987

下面的实施例中液体培养基由甲醇20g/L、硫酸铵3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠4g/L、硫酸镁1g/L，微量元素液2mL/L和水组成，初始pH 6.8-7.0；

其中，微量元素液由80g/L硫酸亚铁、22.5g/L硫酸锌、40g/L硫酸锰、5g/L硫酸铜、15g/L氯化钠、0.3g/L钼酸钠、0.3g/L氯化钾、0.03g/L氯化钴、3g/L硼酸、300g/L氯化钙和水组成。

种子培养基由5g/L甲醇、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠4g/L、硫酸镁1g/L和水组成。

液体培养基由硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠6g/L、硫酸镁1.5g/L和水组成，初始pH 6.8-7.0。

含甲醇的液体培养基为将不同量的甲醇添加到液体培养基中得到的培养基。

实施例1、吡咯喹啉醌PQQ检测方法的建立

1、PQQ标准品和发酵液的全波长扫描

生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8按接种量为5％接种在液体培养基，30℃，220rpm发酵4天，得到发酵液，8000×g离心5min，收集发酵上清液。

取生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8发酵液上清和溶于液体培养基的PQQ标准品(sigma-aldrich公司，货号：D7783)用紫外可见分光光度计进行全波长扫描(200nm-840nm)。

结果如图1所示，可以看出PQQ具有248nm、269nm和330nm处三个特征吸收峰，发酵液上清液的二维图谱与PQQ标准品的二维图谱相似。由于PQQ在248nm和269nm的吸光度受发酵液中的蛋白质和核酸的影响较大，而在330nm处的吸光度基本不受影响。因此，选用330nm的吸光值来检测PQQ的含量。

2、PQQ的浓度-330nm吸光值的标准曲线

用酶标仪分别测定浓度为5mg/L、15mg/L、25mg/L、30mg/L、37.5mg/L、50mg/L、60mg/L、75mg/L、100mg/L、120mg/L和150mg/L的PQQ标准品在330nm处的吸光值，然后对不同浓度PQQ标准品做线性回归，即得PQQ的浓度-330nm吸光值的标准曲线，如图2所示。

3、HPLC检测的PQQ标准曲线

用HPLC法分别测定浓度为5mg/L、15mg/L、25mg/L、30mg/L、37.5mg/L、50mg/L、60mg/L、75mg/L、100mg/L、120mg/L和150mg/L的PQQ标准品所对应的峰面积，然后对不同浓度PQQ标准品做线性回归，即得PQQ的浓度-峰面积的标准曲线，如图3所示。

HPLC色谱条件为：色谱柱为C18不锈钢柱、规格为2.1×150mm，填料粒径为3.5μm(Waters公司，货号：186003023)，检测波长330nm，流动相为水∶乙腈＝80∶20(体积/体积)，流速：0.2～0.3mL/min，柱温：45℃，进样量：10～20μL，洗脱时间：8min。

实施例2、高产吡咯喹啉醌的脱氮生丝微菌FJNU-R8突变株定向驯化选育方法

一、菌株的应激定向驯化

1)种子培养液

出发菌株脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8保种斜面通过画线分离单菌落，然后将单菌落接入种子培养基，于30℃培养2天，得到种子培养液；

2)应激定向驯化诱导培养

将种子培养液进行多次诱导培养，具体如下：

将种子培养液按5％(体积百分含量)接种量转入含2％甲醇(体积百分含量)的液体培养基中，30℃、220rpm进行1次诱导培养至4天，使OD₆₀₀比1次诱导培养前增加了1.5，得到1次诱导培养液；

1次诱导培养液8000×g离心5min，收集菌体，转接到含3％甲醇的液体培养基中，30℃、220rpm进行2次诱导培养4天，使OD₆₀₀比2次诱导培养前增加1.5，得到2次诱导培养液；

依次类推，进行再一轮的定向驯化，每轮筛选甲醇浓度比上一轮浓度提高，且每轮筛选甲醇浓度比上一轮浓度提高1％(体积百分比)，直至培养基中甲醇的浓度达到体积百分比10％；得到驯化后的菌液。

将驯化后的菌液稀释10⁷倍，取稀释菌液涂于含有10％甲醇的平板培养基，于30℃培养6天，得到由驯化菌株组成的驯化菌株库。

2、检测PQQ

从驯化菌株库中挑取100个驯化菌株分别接入种子瓶，于30℃220rpm培养2天后按接种量为5％接入发酵培养基，30℃，220rpm发酵4天，得到发酵液，8000×g离心5min，收集100份驯化菌株发酵上清液。

以脱氮生丝微菌FJNU-R8为对照，按照同样的方法进行发酵，收集FJNU-R8发酵上清液。

吸取200μL的上述100份发酵上清液和FJNU-R8发酵上清液于石英酶标板，通过酶标仪批量测定发酵液样品在330nm波长下的吸光值，然后通过实施例1的图2标准曲线来判断PQQ浓度的大小。

测定结果如图4所示，以脱氮生丝微菌FJNU-R8发酵上清液中PQQ的产量(43.27mg/L上清液)为基线，高于该基线的为正突变菌驯化株，低于该基线的为负突变驯化株；从图中可以看出，100份驯化菌株有68株的正突变驯化株，其中14株正突变驯化株的PQQ产量提高了15％以上，最高产量提高了52％。结果表明，本发明的应激定向驯化方法所构建的突变菌株库具有高正突变率，可以提高筛选效率。

二、鉴定

将上述一初筛获得的68株的正突变驯化株发酵液中PQQ含量较高的26号、85号、98号、33号和30号菌株用HPLC法进行复测，检测方法同实施例1中的HPLC检测。

结果如下：26号、85号、98号、33号和30号正突变驯化株的PQQ含量分别为63.31mg/L、62.18mg/L、61.14mg/L、60.03mg/L和59.76mg/L，均高于脱氮生丝微菌FJNU-R8发酵液中PQQ含量。

采用同样的方法检测其余正突变驯化株，发酵液中PQQ含量也均高于脱氮生丝微菌FJNU-R8发酵液中PQQ含量。

快速检测PQQ含量的误差均在6％以内(液相复筛的产量与酶标检测的产量的差值除以液相复筛的产量)。

由此表明本发明的筛选方法的快速性及结果的准确性，可以完成PQQ菌种的快速筛选工作。

实施例3、高产吡咯喹啉醌的脱氮生丝微菌CGMCC NO.1.12893突变株定向驯化选育方法

一、菌株的应激定向驯化

1)种子培养液

出发菌株脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-6CGMCCNO.1.12893保种斜面通过画线分离单菌落，然后将单菌落接入种子培养基，于30℃培养2天，得到种子培养液；

2)应激定向驯化诱导培养

将种子培养液进行多次诱导培养，具体如下：

将种子培养液按5％(体积百分含量)接种量转入含有0.5％(体积百分含量)甲醇的液体培养基中30℃、220rpm进行1次诱导培养3天，使OD₆₀₀比1次诱导培养前增加了1.5，得到1次诱导培养液；

1次诱导培养液8000×g离心5min，收集菌体，转接到含1％甲醇的液体培养基中，30℃、220rpm进行2次诱导培养4天，使OD₆₀₀比2次诱导培养前增加了1.5，得到2次诱导培养液；

离心收集2次诱导培养液菌体，转接到含1.5％甲醇的液体培养基中，30℃、220rpm进行3次诱导培养4天，使OD₆₀₀比3次诱导培养前增加了1.5，得到3次诱导培养液；

依次类推，进行再一轮的定向驯化，每轮筛选甲醇浓度比上一轮浓度提高，且每轮筛选甲醇浓度比上一轮浓度提高0.5％(体积百分含量)，直至培养基中甲醇的起始浓度达到体积百分比8％；得到驯化后的菌液。

将驯化后的菌液稀释10⁷倍，取稀释菌液涂于含有8％甲醇的平板培养基，于30℃培养6天。得到由驯化菌株组成的驯化菌株库。

2、检测PQQ产量

方法与实施例2的一的2相同。

以脱氮生丝微菌CGMCC NO.1.12893为对照，按照同样的方法进行发酵，收集CGMCCNO.1.12893发酵上清液。

测定结果如图5所示，从图中可以看出，以脱氮生丝微菌FJNU-6CGMCC NO.1.12893发酵上清液中PQQ的产量(16.81mg/L上清液)为基线，高于该基线的为正突变菌驯化株，低于该基线的为负突变驯化株；从图中可以看出，100份驯化菌株有94株的正突变驯化株，其中11株正突变驯化株的PQQ产量提高了100％以上，最高产量提高了133％。

二、鉴定

将上述一初筛获得的94株的正突变驯化株发酵液中PQQ含量较高的73号、37号、81号、15号和97号菌株用HPLC法进行复测，检测方法同实施例1中的HPLC检测。

结果如下：73号、37号、81号、15号和97号正突变驯化株的PQQ含量分别为38.22mg/L、36.81mg/L、36.54mg/L、36.59mg/L和35.31mg/L，均高于脱氮生丝微菌FJNU-6CGMCCNO.1.12893发酵液中PQQ含量。

采用同样的方法检测其余正突变驯化株，发酵液中PQQ含量也均高于脱氮生丝微菌FJNU-6CGMCC NO.1.12893发酵液中PQQ含量。

实施例4、高产吡咯喹啉醌的Methylobacterium extorquens CGMCC NO.1.6987突变株定向驯化选育方法

一、菌株的应激定向驯化

1)种子培养液

出发菌株Methylobacterium extorquens CGMCC NO.1.6987保种斜面通过画线分离单菌落，然后将单菌落接入种子培养基，于30℃培养2天，得到种子培养液；

2)应激定向驯化诱导培养

将种子培养液进行多次诱导培养，具体如下：

将种子培养液按5％(体积百分含量)接种量转入含有1％甲醇的液体培养基中30℃、220rpm进行1次诱导培养3天，使OD₆₀₀比1次诱导培养前增加了1.5，得到1次诱导培养液；

1次诱导培养液8000×g离心5min，收集菌体，转接到含1.5％甲醇的液体培养基中进行应激驯化，30℃、220rpm(振幅式摇床，摇床为上海智城分析仪器制造有限公司，ZWYR-2112B)进行2次诱导培养3天，使OD₆₀₀比2次诱导培养前增加了1.5，得到2次诱导培养液；

依次类推，进行再一轮的定向驯化，每轮筛选甲醇浓度比上一轮浓度提高，且每轮筛选甲醇浓度比上一轮浓度提高0.5％，直至培养基中甲醇的起始浓度达到体积百分比8％；得到驯化后的菌液。

将驯化后的菌液稀释10⁷倍，取稀释菌液涂于含有8％甲醇的平板培养基，于30℃培养4天。得到由驯化菌株组成的驯化菌株库。

2、检测PQQ产量

挑取驯化菌株库中100株生长良好的驯化菌株分别接入种子瓶，于30℃220rpm培养1天后按接种量为5％接入发酵培养基，30℃，220rpm发酵3天，得到发酵液，8000×g离心5min，收集100份驯化菌株发酵上清液。

以Methylobacterium extorquens CGMCC NO.1.6987为对照，按照同样的方法进行发酵，收集FJNU-R8发酵上清液。

吸取200μL的上述100份发酵上清液和CGMCC NO.1.6987发酵上清液于石英酶标板，通过酶标仪批量测定发酵液样品在330nm波长下的吸光值，然后实施例1的图2标准曲线来判断PQQ浓度的大小。

测定结果如图6所示，以CGMCC NO.1.6987发酵上清液中PQQ的产量(6.73mg/L上清液)为基线，高于该基线的为正突变菌驯化株，低于该基线的为负突变驯化株；从图中可以看出，从图中可以看出，100份驯化菌株有96株的正突变驯化株，其中17株正突变驯化株的PQQ产量提高了200％以上，最高产量提高了261％。

二、鉴定

将上述一初筛获得的96株的正突变驯化株发酵液中PQQ含量较高的84号、95号、25号、34号和11号菌株用HPLC法进行复测，检测方法同实施例1中的HPLC检测。

结果如下：84号、95号、25号、34号和11号正突变驯化株的PQQ含量分别为22.31mg/L、21.98mg/L、22.06mg/L、22.74mg/L和21.87mg/L，均高于脱氮生丝微菌CGMCC NO.1.6987发酵液中PQQ含量。

采用同样的方法检测其余正突变驯化株，发酵液中PQQ含量也均高于脱氮生丝微菌CGMCC NO.1.6987发酵液中PQQ含量。

快速检测PQQ含量的误差均在10％以内(液相复筛的产量与酶标检测的产量的差值除以液相复筛的产量)。

Claims

1.一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法，包括如下步骤:

1）种子培养液

出发菌株为脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans）FJNU-R8，保藏编号为CGMCCNo.10620，从所述菌株的保种斜面通过画线分离单菌落，然后将单菌落接入种子培养基，培养得到种子培养液；

2）应激定向驯化诱导培养

将种子培养液进行9次诱导培养，具体如下：

将种子培养液按体积百分含量为5%接种量转入含甲醇2%的液体培养基中，诱导培养至OD₆₀₀比培养前增加1.5，得到1次诱导培养液；

1次诱导培养液离心，收集菌体，转接到含3%甲醇的液体培养基中，诱导培养至OD₆₀₀比培养前增加1.5，得到2次诱导培养液；

依次类推，再进行7轮定向驯化，每轮诱导培养至OD₆₀₀值比该轮培养前增加1.5，且每轮液体培养基中甲醇浓度比上一轮提高1%，直至培养基中甲醇的浓度达到10%；得到驯化后的菌液；

将驯化后的菌液稀释，取稀释菌液涂于含有10%甲醇的平板培养基，培养得到由驯化菌株组成的驯化菌株库；

所述液体培养基中甲醇浓度为体积百分比浓度；

3）分别发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；

4）分别检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤4）中，所述检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌采用酶标仪检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述酶标仪检测OD值的波长为330nm。