CN102818801A

CN102818801A - 一种测定atp的方法

Info

Publication number: CN102818801A
Application number: CN2011101518160A
Authority: CN
Inventors: 席雪飞; 胡煜; 张艳楠; 彭晓佳; 王磊; 武满满; 唐玉姝
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明涉及一种测定ATP的方法，用于测定含菌水体、土壤、污泥等中的ATP量，包括如下步骤：a)制取样品的待测溶液；b)在待测溶液中加入BAB溶液；c)吸取过滤后的滤液放入已加入荧光素酶的过滤比色杯中；d)使用Profile-1生物发光仪进行ATP测定。与现有技术相比，本发明高于Profile-1生物发光仪自带的标准分析方法，特别适用于土壤ATP的测定，弥补了Profile-1生物发光仪自带的标准分析方法的不足。

Description

一种测定ATP的方法

技术领域

本发明涉及一种ATP含量的测定方法，特别涉及一种利用Profile-1生物发光仪测定含菌水体、土壤、污泥中ATP含量的测定方法，以及通过测定ATP的含量间接表示出土壤中微生物量的方法。

背景技术

ATP(Adenosine Triphosphate)是生物体内一种特定的高能磷酸化合物。正常生物体细胞内的ATP含量是相对稳定的。故ATP含量与活性微生物量之比可以认为是常数。因此，ATP可以作为一种指标表征活性微生物量。ATP生物发光法是利用ATP与虫荧光素-虫荧光素酶反应，产生光子，再用荧光检测器检测发光值，从而得到ATP的量。其反应过程如下：

目前文献报道的微生物ATP提取方法主要有3种，即热提取法、酸提取法及有机溶剂提取法。酸提取，主要使用TCA(三氯醋酸)，TCA对细菌ATP有较高的提取效率，但是提取液中有若有大量TCA存在，会使荧光素酶因酸度过低而失活；为了降低这种作用，需对提取液进行适当的稀释，但是这样就降低了ATP测定的灵敏度。有机溶剂提取对脂肪和蛋白质含量高的生物材料较为有利，但在提取液中不能残留有机溶剂。因为有机溶剂是荧光素酶的抑制剂。热提取是采用煮沸的方法提取ATP，这种方法对荧光素酶无抑制作用，但是操作复杂。在土壤中，由于大部分微生物都吸附在土壤颗粒上，在预处理过程中，不易对其进行富集也不易使之转移到水溶液中，致使最终收集到的ATP浓度低于土壤中的实际浓度，这限制了ATP生物发光法在土壤学中的应用。

Profile-1生物发光仪，由于体积较小，便于携带，主要被用于对现场食品成品、饮料、仪器等各种对象进行细菌总数的检测。其检测灵敏度高，量程可达0～10⁷cfu·mL^-1或cfu·g^-1，高于一般ATP荧光检测仪灵敏度1～2个数量级。然而在大量的土壤样品分析过程中，我们发现与Profile-1生物发光仪匹配的ATP提取方法对土壤样品微生物中ATP的提取率较低，因此其用于检测土壤中微生物量的灵敏度和准确性较低。这可能是因为土壤样品成份较复杂，仪器自带的ATP提取法不能有效提取土壤微生物中的所有ATP。

苯扎溴铵(BAB)，主要成分为溴化二甲基苄基烃铵，可贮存较长时间而效果不减，性状稳定。它为季铵盐类阳离子表面活性剂，它能改变细菌细胞膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起到杀灭作用，是一种广谱杀菌剂，广泛用于环境消毒。

然而现阶段，由于ATP提取方法和ATP检测仪灵敏度和检出线的限制，ATP生物发光法多用于全血、水环境和食品中活性微生物量的检测。对于像土壤这样固体样品的ATP检测，目前却没有一个快速、高效的方法，所以找到一种适用范围更加广泛的高灵敏度和可靠性的ATP检测方法是非常有价值和必要的事情。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种灵敏度和准确性方面都有显著的提高的测定ATP的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种测定ATP的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)制取样品的待测溶液；

(2)在待测溶液中加入苯扎溴铵溶液得到混合溶液；

(3)用定量滤纸对步骤(2)得到的混合溶液进行吸取过滤，将得到的滤液放入已加入荧光素酶的过滤比色杯中；

(4)使用型号为Profile-1的生物发光仪进行ATP测定。

步骤(1)中所述的样品的待测溶液为土样分散液，制取过程包括以下步骤：将土样放入灭菌水中，控制土样的浓度为0.5～2g/ml，然后向其中加入10～15粒玻璃珠，放入摇床振荡60min，控制转速为160rpm，搅拌得到待测溶液。

步骤(2)具体包括以下步骤：吸取步骤(1)振荡得到的待测溶液，加入到苯扎溴铵溶液中，控制待测溶液与苯扎溴铵溶液的体积比为1∶4，振荡均匀即可。

所述的苯扎溴铵溶液的浓度为0.05wt％。

步骤(3)中所述的荧光素酶与滤液的体积比为1∶1。

与现有技术相比，本发明使用BAB改良分析法的ATP提取率高于Profile-1生物发光仪自带的标准分析方法对于ATP的提取率，特别是对于土壤ATP检测，本发明的方法在灵敏度和准确性方面都有显著的提高，因此BAB改良分析法配合Profile-1生物发光仪可以应用于各类固体样品的ATP含量及其微生物量的检测，具有良好的应用前景和实用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

测定大肠杆菌标准液中的ATP量

大肠杆菌标准液：挑单菌(E.coli.Top10)放入1mL LB液体培养基过夜培养，取培养后的大肠杆菌培养液1mL转接到40mL LB液体培养基中，转速120r·min^-1，培养2h。取0.5mL，培养液放入已灭菌的4.5mL蒸馏水中，配成稀释梯度为10倍的大肠杆菌培养液，并依此法依次配制稀释梯度为10²和10³倍的大肠杆菌培养液。分别测定各个稀释倍数的大肠杆菌标准液中的ATP。

大肠杆菌菌液的测定步骤为：取1mL培养液并快速加入4mL 0.05％BAB溶液，震荡90s。吸取混合液100μL放入已加入100μL荧光素酶的过滤比色杯中，并将杯中溶液吸、排2～3次使溶液混匀，进行ATP测定。

表1：BAB改良分析法和Profile-1生物发光仪标准方法分别测定不同大肠杆菌浓度结果比较

注：表中*栏计算公式为折算结果(g ATP·个菌-1)＝对应方法的ATP浓度(mol·mL-1)*ATP摩尔质量(g·mol-1)/菌落计数结果(CFU·mL-1)

表1中，根据BAB改良分析法测定结果，ATP浓度与菌落计数结果之间的转化关系大致为5.32×10^-16g ATP/个菌；根据Profile-1生物发光仪标准方法测定结果，ATP浓度与菌落计数结果之间的转化关系大致为4.82×10^-16gATP/个菌。也就是说，使用本发明所述的检测方法和Profile-1生物发光仪自带的标准分析方法检测得到的ATP浓度基本和大肠杆菌溶液的微生物量成线性关系。经SPSS13.0中LSD单因素方差分析，两种方法的测定结果并无显著性差异(P＞0.05)。即本发明所述的ATP分析法和Profile-1生物发光仪标准方法对于测定菌液中ATP的灵敏度没有显著性差异。

实施例2

测定土壤样品中的ATP量

土壤样品：分别采集3种不同类型的土壤：上海崇明岛98大堤内的农田，其上分别种植花菜、牧草和玉米；崇明东滩湿地公园内2块实验改良地土壤以及对照土壤；上海九段沙湿地盐渍藻类带(光滩)、海三棱藨草带(Scirpusmariqueter)和互花米草群落带土壤(Spartina alterniflora)。3种类型的土壤都按对角线法各取五份平行样(表层土壤5～20cm)。新鲜土样4℃保存用于测定土壤ATP值和微生物等指标。

对于土壤样品的检测步骤为：将5g新鲜土样放入50mL灭菌水中，加10～15粒玻璃珠，放入摇床震荡60min，转速160r·min^-1。吸取2mL土样分散液，快速加入8mL 0.05％BAB溶液，震荡45s。用定量滤纸过滤，吸取滤液100μL放入已加入100μL荧光素酶的过滤比色杯中，并将杯中溶液吸、排2～3次使溶液混匀，进行ATP测定。

表2：各土壤样品微生物浓度

注：表中*栏微生物数量(个·mL^-1)＝对应方法的ATP浓度(mol·mL^-1)*ATP摩尔质量(g·mol^-1)/表1中对应方法的ATP浓度与微生物浓度之间的转化关系(gATP·个菌^-1)；表中**栏比值(％)＝菌落计数结果(CFU·g(干土)^-1)/对应的方法微生物数量(个·mL^-1)*100％

土壤中有相当数量的微生物是不可培养的，而传统的培养技术即菌落计数法仅能分离1％～10％的土壤微生物。而ATP法可测定出包括土壤中可培养和不可培养的微生物。根据表2的结果，菌落计数法测定结果大约占BAB改良分析法测定结果的1％～5％，两种测定方法的结果具有显著性差异(P＜0.05)。而菌落计数法结果大约占到Profile-1生物发光仪自带方法的测定结果的22％～99％，两种方法的测定结果没有显著性差异(P＞0.05)。这表明改良方法测定的土壤微生物量的结果更加接近实际情况，也更准确。

实施例3

测定污泥中ATP量

污泥来源：于2010年6月1日和2010年6月24日取曲阳污水处理厂曝气池内污泥。对于污泥的测试步骤：将污泥用灭菌后的蒸馏水稀释20倍，制得污泥溶液；吸取2mL土样污泥溶液，快速加入8mL 0.05％BAB溶液，震荡45s。用定量滤纸过滤，吸取滤液100μL放入已加入100μL荧光素酶的过滤比色杯中，并将杯中溶液吸、排2～3次使溶液混匀，进行ATP测定。

我们使用菌落计数法和本发明的方法及其Profile-1生物发光仪标准方法三种方法同时测量，并把它们进行比较，可得如表3所述的结果。

表3：曲阳污水处理厂活性污泥中微生物浓度

根据表3的结果，菌落计数法测定结果大约占本发明测试方法测定结果的4％～6％，而菌落计数法结果大约占到Profile-1生物发光仪自带方法的测定结果的26％～33％。与土壤测定结果相类似。

综上可见，改良过后的方法可操作性强，相较于原有方法，测定固体样品时，具有更高的ATP提取效率，从而使测定结果更加准确。

实施例4

一种测定ATP的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制取样品的待测溶液，制取过程包括以下步骤：将土样放入灭菌水中，控制土样的浓度为0.5g/ml，然后向其中加入10粒玻璃珠，放入摇床振荡60min，控制转速为160rpm，搅拌得到待测溶液；

(2)在待测溶液中加入BAB(苯扎溴铵)溶液得到混合溶液，具体包括以下步骤：吸取步骤(1)振荡得到的待测溶液，加入到浓度为0.05wt％的BAB溶液中，控制待测溶液与BAB溶液的体积比为1∶4，振荡均匀即可；

(3)用定量滤纸对步骤(2)得到的混合溶液进行吸取过滤，将得到的滤液放入已加入荧光素酶的过滤比色杯中，荧光素酶与滤液的体积比为1∶1；

(4)使用Profile-1生物发光仪进行ATP测定。

实施例5

一种测定ATP的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制取样品的待测溶液，制取过程包括以下步骤：将土样放入灭菌水中，控制土样的浓度为2g/ml，然后向其中加入15粒玻璃珠，放入摇床振荡60min，控制转速为160rpm，搅拌得到待测溶液；

(4)使用Profile-1生物发光仪进行ATP测定。

Claims

1.一种测定ATP的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)制取样品的待测溶液；

(2)在待测溶液中加入苯扎溴铵溶液得到混合溶液；

(4)使用型号为Profile-1的生物发光仪进行ATP测定。

2.根据权利要求1所述的一种测定ATP的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的样品的待测溶液为土样分散液，制取过程包括以下步骤：将土样放入灭菌水中，控制土样的浓度为0.5～2g/ml，然后向其中加入10～15粒玻璃珠，放入摇床振荡60min，控制转速为160rpm，搅拌得到待测溶液。

3.根据权利要求1所述的一种测定ATP的方法，其特征在于，步骤(2)具体包括以下步骤：吸取步骤(1)振荡得到的待测溶液，加入到苯扎溴铵溶液中，控制待测溶液与苯扎溴铵溶液的体积比为1∶4，振荡均匀即可。

4.根据权利要求1所述的一种测定ATP的方法，其特征在于，所述的苯扎溴铵溶液的浓度为0.05wt％。

5.根据权利要求1所述的一种测定ATP的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光素酶与滤液的体积比为1∶1。