CN109632780B - 一种检测atp的比色方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测ATP的比色方法及试剂盒。该比色方法通过将已知浓度的ATP溶液和待测溶液分别与H2O2、显色剂和含氢离子的小分子溶液混合,反应;依据已知浓度的反应产物的颜色,判断待测溶液反应产物中是否含有ATP;以及将已知浓度的反应产物和待测溶液反应产物在相同波长下检测,将已知浓度的反应产物的检测值制作标准曲线,依据标准曲线和待测溶液反应产物的检测值,得到待测溶液中的ATP的浓度。依据该比色方法,本发明还提供了一种检测ATP的试剂盒,包括H2O2检测液、显色剂检测液、含氢离子的小分子检测液和ATP标准溶液。本发明提供的方法简单、便宜、快速、且灵敏。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域,特别涉及一种检测ATP的比色方法及试剂盒。
背景技术
ATP(adenosine triphosphate),中文为腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷),是一种不稳定的高能化合物,由1分子腺嘌呤,1分子核糖和3分子磷酸组成。ATP在生物体内发挥着重要的作用,是所有生物体生存和细胞繁殖的能量来源。研究发现,ATP可以作为细胞存活率和细胞损伤的指示剂,其在生物体细胞中的浓度与肿瘤、心血管疾病、帕金森综合征等重大疾病有关。目前,ATP的检测还被普遍用于微生物的快速检测、疾病的诊断与预防、食品分析等领域。
检测ATP的方法有主要包括高效液相色谱法、核酸适配体法、荧光素/荧光素酶法以及电泳法等。这些方法的灵敏度和特异性都很好,但是需要昂贵的仪器和繁琐的操作步骤,并且耗时耗力。因此,研究一种简单快速检测ATP的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种检测ATP的比色方法。
本发明的另一目的在于提供一种检测ATP的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种检测ATP的比色方法,包括如下步骤:
(1)将若干个不同浓度的ATP溶液与H2O2、显色剂和含氢离子的小分子溶液混合,得到反应体系I,反应,得到已知浓度的反应产物;将待测溶液的原液或稀释液与H2O2、显色剂和含氢离子的小分子溶液混合,得到反应体系II,反应,得到待测溶液反应产物;
(2)依据已知浓度的反应产物的颜色,判断待测溶液反应产物中是否含有ATP,判断标准如下:若待测溶液反应产物的颜色与ATP为0的已知浓度的反应产物的颜色相当时,表示待测溶液不含ATP;若待测溶液反应产物的颜色比ATP为0的已知浓度的反应产物的颜色浅时,表示待测溶液中含有ATP;
(3)将步骤(1)得到已知浓度的反应产物和待测溶液反应产物在相同波长下检测;将已知浓度的反应产物的检测值制作标准曲线,依据标准曲线和待测溶液反应产物的检测值,得到待测溶液中的ATP的浓度。
步骤(1)中:
所述的反应体系I中的ATP的浓度优选为0~200μM;更优选为0μM以及0.01~50μM。
所述的含氢离子的小分子为酸;优选为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、氯酸、高氯酸、次氯酸、亚硫酸、柠檬酸、草酸、甲酸、丙酸和丁酸中的一种或至少两种。
所述的显色剂指的是可以被过氧化氢氧化的有机试剂;优选为3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和邻苯二胺中的一种或至少两种。
所述的含氢离子的小分子的浓度,以氢离子的含量计算浓度,为1μM~10M;优选1M、0.5M、0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、500μM、50μM、1μM。
所述的显色剂的浓度为0.001mM~50mM;优选0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM、10mM、50mM。
所述的H2O2的浓度为0.001mM~1000mM;优选0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM、10mM、50mM、100mM、500mM、1000mM。
所述的反应的温度为0~100℃;优选为在室温,室温的温度为0~40℃,更优选为10~30℃,最优选为23~27℃。
所述的反应的时间为1min~24h;优选为5min~24h。
步骤(3)中:
所述的波长为400~450nm;更优选为420nm。
一种检测ATP的试剂盒,是基于上述比色方法设计得到,包括以下成分:H2O2检测液、显色剂检测液、含氢离子的小分子检测液和ATP标准溶液。
所述的ATP标准溶液为已知浓度的ATP溶液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明基于发明人意外发现了ATP能够抑制含氢离子的小分子作为类过氧化物酶催化H2O2和显色剂反应的活性:在无ATP时,含氢离子的小分子具有很好催化活性,催化H2O2和显色剂反应显色;ATP存在时,含氢离子的小分子催化活性被抑制,H2O2和显色剂的显色反应受到影响,随着ATP含量的增大,显色越弱;从而做出的发明创造。本发明利用颜色的变化可以定性或半定量检测ATP的含量,利用紫外可见分光计可以定量检测ATP的含量。
(2)本发明提供的方法简单、便宜、快速、且灵敏。
(3)本发明可以应用于医学、食品或微生物快速检验与测定技术等各个领域,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是通过本发明提供的方法检测不同含量ATP的结果照片图。
图2是通过本发明提供的方法检测不同含量ATP的紫外可见光谱图。
图3是使用本发明得到的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
分别准确吸取0μL、20μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL浓度为1mM的ATP溶液,加入到准备好的1.5mL离心管中,依次再往离心管中加入200μL、180μL、150μL、120μL、100μL、50μL、0μL水,此时,离心管中的溶液体积为200μL。在每个离心管中加入100μL浓度为1mM的H2O2溶液以及20μL浓度为50mM的ABTS溶液,分别加入680μL浓度为0.1M的醋酸溶液,定容到1mL,在室温反应2小时,得到如图1所示的溶液。ATP的浓度(由左到右)为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM,可见随着ATP浓度的增加,溶液颜色越来越浅。
利用紫外可见分光光度计测定溶液在380nm~800nm处的吸光度,如图2所示。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处的吸光度越来越低,ATP的浓度(由上到下)为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
实施例2
操作基本同实施例1,区别仅在于:用盐酸溶液代替实施例1的醋酸溶液,反应时间不同,具体步骤如下:
分别准确吸取0μL、20μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL ATP溶液(1mM)加入到准备好的1.5mL离心管中,依次再往离心管中加入200μL、180μL、150μL、120μL、100μL、50μL、0μL水,在每个离心管中加100μL 1mM H2O2溶液和20μL 50mM ABTS溶液,分别用680μL浓度为0.1M的盐酸溶液定容到1mL,在室温反应1小时得到类似图1所示溶液。随着ATP浓度的增加,溶液颜色越来越浅,ATP的浓度分别为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
利用紫外可见分光光度计测定溶液在380nm~800nm处的吸光度,结果类似图2。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处的吸光度越来越低,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
实施例3
操作基本同实施例1,区别仅在于:用磷酸溶液代替实施例1的醋酸溶液,反应时间不同,具体步骤如下:
分别准确吸取0μL、20μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL ATP溶液(1mM)加入到准备好的1.5mL离心管中,依次再往离心管中加入200μL、180μL、150μL、120μL、100μL、50μL、0μL水,在每个离心管中加100μL 1mM H2O2溶液和20μL 50mM ABTS溶液,分别用680μL浓度为0.1M的磷酸溶液定容到1mL,在室温反应0.5小时得到类似图1所示溶液。随着ATP浓度的增加,溶液颜色越来越浅,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
利用紫外可见分光光度计测定溶液在380nm~800nm处的吸光度,结果类似图2所示。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处的吸光度越来越低,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
实施例4
操作基本同实施例1,区别仅在于:用甲酸溶液代替实施例1的醋酸溶液,反应时间不同,具体步骤如下:
分别准确吸取0μL、20μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL ATP溶液(1mM)加入到准备好的1.5mL离心管中,依次再往离心管中加入200μL、180μL、150μL、120μL、100μL、50μL、0μL水,在每个离心管中加100μL 1mM H2O2溶液和20μL 50mM ABTS溶液,分别加入680μL 1M甲酸溶液定容到1mL,在室温反应5分钟得到类似图1所示溶液。随着ATP浓度的增加,溶液颜色越来越浅,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
利用紫外可见分光光度计测定溶液在380nm~800nm处的吸光度,结果类似图2所示。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处的吸光度越来越低,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
实施例5
操作基本同实施例1,区别仅在于:用硫酸溶液代替实施例1的醋酸溶液,反应时间不同,具体步骤如下:
分别准确吸取0μL、20μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL ATP溶液(1mM)加入到准备好的1.5mL离心管中,依次再往离心管中加入200μL、180μL、150μL、120μL、100μL、50μL、0μL水,在每个离心管中加100μL 1mM H2O2溶液和20μL 50mM ABTS溶液,分别加入680μL 0.01M硫酸溶液,定容到1mL,在室温反应24小时得到类似图1所示溶液。随着ATP浓度的增加,溶液颜色越来越浅,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
利用紫外可见分光光度计测定溶液在380nm~800nm处的吸光度,结果类似图2所示。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处的吸光度越来越低,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
实施例6
操作基本同实施例1,区别仅在于:用硝酸溶液代替实施例1的醋酸溶液,具体步骤如下:
分别准确吸取0μL、20μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL ATP溶液(1mM)加入到准备好的1.5mL离心管中,依次再往离心管中加入200μL、180μL、150μL、120μL、100μL、50μL、0μL水,再每个离心管中加100μL 1mM H2O2溶液和20μL 50mM ABTS溶液,分别加入680μL浓度为0.001M的硝酸溶液,定容到1mL,在50℃下反应2小时得到类似图1所示溶液。随着ATP浓度的增加,溶液颜色越来越浅,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
利用紫外可见分光光度计测定溶液在380nm~800nm处的吸光度,结果类似图2所示。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处的吸光度越来越低,ATP的浓度为0μM、20μM、50μM、80μM、100μM、150μM、200μM。
实施例7
标准曲线的绘制:
分别准确吸取200μL不同浓度的ATP溶液(0.05μM、0.25μM、0.50μM,2.5μM、5.0μM、50μM、125μM、250μM)加入到准备好的1.5mL离心管中,在每个离心管中加入100μL浓度为1mM的H2O2溶液和20μL浓度为50mM的ABTS溶液,分别加入680μL浓度为1M的醋酸溶液,定容到1mL,在37℃下反应10分钟,通过紫外分光光度计在420nm处检测,得到如图3所示的标准曲线图。随着ATP浓度的增加,溶液在420nm处吸光度越来越低,ATP的浓度为0.01μM、0.05μM、0.10μM、0.50μM、1.00μM、10.0μM、25.0μM、50.0μM。检测线性范围为0.01~50μM,检出限为0.01μM。
实施例8
一种检测ATP的试剂盒,包括:浓度为1mM的H2O2的溶液、浓度为50mM的ABTS溶液、浓度为1M的盐酸溶液、浓度为1mM的ATP标准溶液。
对待测溶液中的ATP的检测步骤如下:
(1)使用不同浓度的ATP标准溶液,参照实施例7的操作,得到浓度为0.01μM、0.05μM、0.10μM、0.50μM、1.00μM、10.0μM、25.0μM、50.0μM的ATP溶液的颜色变化情况,利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,绘制标准曲线。
(2)用待测溶液原液或是稀释液进行操作,参照实施例7的操作,得到反应溶液。肉眼观察,可以初步判定待测溶液中是否含有ATP。利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,得到的数值,依据标准曲线,即可以得到待测溶液中ATP的含量。
实施例9ATP的检测试剂盒组成
一种检测ATP的试剂盒,包括:浓度为1mM的H2O2的溶液、浓度为50mM的TMB溶液(显色剂)、浓度为1M的醋酸溶液、浓度为1mM的ATP标准溶液。
对待测溶液中的ATP的检测步骤如下:
(1)使用不同浓度的ATP标准溶液,参照实施例7的操作,得到浓度为0.01μM、0.05μM、0.10μM、0.50μM、1.00μM、10.0μM、25.0μM、50.0μM的ATP溶液的颜色变化情况,利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,绘制标准曲线。
(2)用待测溶液原液或是稀释液进行操作,参照实施例7的操作,得到反应溶液。肉眼观察,可以初步判定待测溶液中是否含有ATP。利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,得到的数值,依据标准曲线,即可以得到待测溶液中ATP的含量。
实施例10ATP的检测试剂盒组成
一种检测ATP的试剂盒,包括:浓度为1mM的H2O2的溶液、浓度为50mM的邻苯二胺溶液(显色剂)、浓度为1M的硝酸溶液、浓度为1mM的ATP标准溶液。
对待测溶液中的ATP的检测步骤如下:
(1)使用不同浓度的ATP标准溶液,参照实施例7的操作,得到浓度为0.01μM、0.05μM、0.10μM、0.50μM、1.00μM、10.0μM、25.0μM、50.0μM的ATP溶液的颜色变化情况,利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,绘制标准曲线。
(2)用待测溶液原液或是稀释液进行操作,参照实施例7的操作,得到反应溶液。肉眼观察,可以初步判定待测溶液中是否含有ATP。利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,得到的数值,依据标准曲线,即可以得到待测溶液中ATP的含量。
实施例11ATP的检测试剂盒组成
一种检测ATP的试剂盒,包括:浓度为1mM的H2O2的溶液、浓度为50mM的ABTS溶液、浓度为1M的甲酸溶液、浓度为1mM的ATP标准溶液。
对待测溶液中的ATP的检测步骤如下:
(1)使用不同浓度的ATP标准溶液,参照实施例7的操作,得到浓度为0.01μM、0.05μM、0.10μM、0.50μM、1.00μM、10.0μM、25.0μM、50.0μM的ATP溶液的颜色变化情况,利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,绘制标准曲线。
(2)用待测溶液原液或是稀释液进行操作,参照实施例7的操作,得到反应溶液。肉眼观察,可以初步判定待测溶液中是否含有ATP。利用紫外可见光分光光度计在420nm处检测,得到的数值,依据标准曲线,即可以得到待测溶液中ATP的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测ATP的比色方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将若干个不同浓度的ATP溶液与H2O2、显色剂和含氢离子的小分子溶液混合,得到反应体系I,反应,得到已知浓度的反应产物;将待测溶液的原液或稀释液与H2O2、显色剂和含氢离子的小分子溶液混合,得到反应体系II,反应,得到待测溶液反应产物;
(2)依据已知浓度的反应产物的颜色,判断待测溶液反应产物中是否含有ATP,判断标准如下:若待测溶液反应产物的颜色与ATP为0的已知浓度的反应产物的颜色相当时,表示待测溶液不含ATP;若待测溶液反应产物的颜色比ATP为0的已知浓度的反应产物的颜色浅时,表示待测溶液中含有ATP;
(3)将步骤(1)得到已知浓度的反应产物和待测溶液反应产物在相同波长下检测;将已知浓度的反应产物的检测值制作标准曲线,依据标准曲线和待测溶液反应产物的检测值,得到待测溶液中的ATP的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:步骤(1)中所述的反应体系I中ATP的浓度为0~200μM。
3.根据权利要求1所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的含氢离子的小分子为酸;
步骤(1)中所述的显色剂指的是能被过氧化氢氧化的有机试剂。
4.根据权利要求3所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:
所述的含氢离子的小分子为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、氯酸、高氯酸、次氯酸、亚硫酸、柠檬酸、草酸、甲酸、丙酸和丁酸中的一种或至少两种;
所述的显色剂为3,3,5,5-四甲基联苯胺、2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐和邻苯二胺中的一种或至少两种。
5.根据权利要求1所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的含氢离子的小分子的浓度,以氢离子的含量计算浓度,为1µM~10M;
步骤(1)中所述的显色剂的浓度为0.001mM~50 mM;
步骤(1)中所述的H2O2的浓度为0.001mM~1000 mM;
步骤(1)中所述的反应的温度为0~100℃;
步骤(1)中所述的反应的时间为1min~24h。
6.根据权利要求5所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:
所述的含氢离子的小分子的浓度为1M、0.5M、0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、500µM、50 µM或1µM;
所述的显色剂的浓度为0.001 mM、0.01 mM、0.1 mM、1 mM、10 mM或50 mM;
所述的H2O2的浓度为0.001 mM、0.01 mM、0.1 mM、1 mM、10 mM、50 mM、100 mM、500mM或1000 mM;
所述的反应的温度为室温;
所述的反应的时间为1min~24h。
7.根据权利要求1所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的波长为400~450nm。
8.根据权利要求7所述的检测ATP的比色方法,其特征在于:
所述的波长为420nm。
9.一种检测ATP的试剂盒,其特征在于:是基于权利要求1~8任一项所述的比色方法设计得到,包括以下成分:H2O2检测液、显色剂检测液、含氢离子的小分子检测液和ATP标准溶液。
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-
2018
- 2018-12-27 CN CN201811609093.2A patent/CN109632780B/zh active Active
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