CN114199859B - 基于g4核酸适配体的检测生物分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域，公开了一种基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法。所述方法包括如下步骤：(1)在反应溶剂I中，将生物分子的G4核酸适配体与钾离子进行混合反应，得到反应溶液I；(2)将所述反应溶液I、氯化血红素和含有所述生物分子的待测物进行混合I，得到反应溶液II；(3)将所述反应溶液II、过氧化氢和3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺进行混合，得到反应溶液III，观察所述反应溶液III的颜色变化并检测吸光值；(4)激光照射所述反应溶液III，检测激光关闭后的温度变化。该方法能够实现比色‑温度双信号检测，从而提高检测的精密度。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种基于G4核酸适配体的 检测生物分子的方法。
背景技术
生物传感器的概念起源于1962年Clark和Lyons设计的葡萄糖检测电 极，即基于葡萄糖氧化酶与葡萄糖的相互作用而产生电信号用以检测样品中 葡萄糖的浓度。生物传感器主要包括两个部分：信号识别单元和信号转化单 元。识别单元一般对待测物具有高特异性强亲和力的结合作用，早期传感器 一般使用特异性的酶作为识别单元，后来发展到使用有机小分子、抗体、多肽、适配体甚至细胞等，信号转化单元则将识别结合等相互作用转化为各种 物理化学信号，比如荧光、颜色、电化学信号等。
现有技术中的G-四链体传感器对生物分子的测量，大多通过比色法测 量。但是人眼对颜色变化的观察具有欺骗性，容易造成测量误差，而且颜色 变化受自身条件(浓度)以及外界环境(环境的亮暗)的影响较大，检测过程中的精密度不是很高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于G4核酸适配体的检测生物 分子的方法，该方法能够实现比色-温度双信号检测，从而提高检测的精密 度。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于G4核酸适配体的检测生物分 子的方法，包括如下步骤：
(1)在反应溶剂I中，将生物分子的G4核酸适配体与钾离子进行混合 反应，得到反应溶液I；
(2)将所述反应溶液I、氯化血红素和含有所述生物分子的待测物进行 混合I，得到反应溶液II；
(3)将所述反应溶液II、过氧化氢和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行混合 II，得到反应溶液III，观察所述反应溶液III的颜色变化并检测吸光值；
(4)激光照射所述反应溶液III，监测激光关闭后的温度变化。
优选地，所述生物分子选自赭曲霉素A(OTA)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) 和凝血酶(Thr)中的至少一种；所述赭曲霉素A的G4核酸适配体的核苷 酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述腺嘌呤核苷三磷酸的G4核酸适配体的核 苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述凝血酶的G4核酸适配体的核苷酸序列 如SEQ ID NO.3所示。
优选地，在步骤(1)中，所述G4核酸适配体和所述钾离子的摩尔比为 1:5000-15000。
进一步优选地，在步骤(1)中，所述G4核酸适配体的浓度为0.5-2μM。
优选地，在步骤(1)中，所述混合反应包括：将生物分子的G4核酸适 配体与钾离子混合后，加热、冷却。
进一步优选地，所述加热的条件至少满足：温度为80-95℃，时间为 2-8min。
优选地，用于所述钾离子的钾源为氯化钾；所述反应溶剂I为水。
优选地，在步骤(2)中，以1μmol的所述G4核酸适配体计，所述氯 化血红素的添加量为0.8-1.2μmol。
优选地，在步骤(2)中，所述混合I的方法为：分别提供含有氯化血 红素的溶液和含有生物分子的溶液，将所述含有氯化血红素的溶液、所述含 有生物分子的溶液和所述反应溶液I混合。
优选地，在步骤(3)中，以1μmol的所述G4核酸适配体计，所述过 氧化氢的添加量为0.5-2mmol，所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的添加量为0.2-0.6mmol。
优选地，在步骤(3)中，所述混合II的方法为：分别提供含有过氧化 氢的溶液和含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液，将所述含有过氧化氢的溶 液、所述含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液和所述反应溶液II混合。
优选地，在步骤(4)中，所述激光照射的条件至少满足：波长为 780-830nm，功率密度为1.7-2.5W/cm2，时间为15-35s。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明的方法，在没有生物分子存在时，生物分子的G4核酸适配体与 氯化血红素结合形成DNA酶，能高效催化过氧化氢氧化底物3,3’,5,5’-四甲 基联苯胺导致溶液变为蓝色，再通过激光照射后的溶液温度升高明显；当有 生物分子存在时，检测无DNA酶的形成，溶液颜色变浅，激光照射后温度 变化减弱，通过两种情况下颜色和温度的对比实现比色-温度双信号检测， 防止单独颜色检测带来的误差，提高生物分子检测的灵敏度。
附图说明
图1是实施例4、实施例5和实施例6中测量的吸光度的曲线对比图；
图2是实施例1和实施例7-实施例9中测量的吸光度的柱状对比图；
图3是实施例2和实施例10-实施例12中测量的吸光度的柱状对比图；
图4是实施例1和实施例13-实施例17中测量的温度变化的柱状对比图；
图5是实施例1和实施例18-实施例23中测量的温度变化的柱状对比图；
图6是各生物分子的标准曲线图，其中，a为OTA和ΔT0-ΔT的标准 曲线图，b为ATP和ΔT0-ΔT的标准曲线图，c为Thr(Thrombin)和ΔT0- ΔT的标准曲线图，其中，ΔT0为没有生物分子情况下激光照射后的温度变 化，ΔT为生物分子存在的情况下激光照射后的温度变化；
图7是特异性是特异分析图，其中，按照顺序，OTA为赭曲霉素A， Ac-Phe-OH为N-乙酰-L-苯丙氨酸，AFB1为黄曲霉素B1，L-Phenylalanine 为L-苯丙氨酸，zearalenone为玉米赤霉烯酮，OTB为赭曲霉素B，ATP为 腺嘌呤核苷三磷酸，CTP为胞嘧啶核苷三磷酸，GTP为三磷酸鸟苷，UTP 为三磷酸尿苷，Thr为凝血酶，BSA为牛血清白蛋白，GOX为葡萄糖氧化 酶，TRY为胰蛋白酶，glucose为葡萄糖，LAC为乳糖，LIP为脂肪酶；
图8为不同浓度的OTA在检测过程中的颜色变化图，从左向右浓度依 次增加，从左向右的浓度依次为：0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、 1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L；
图9为不同浓度的ATP在检测过程中的颜色变化图，从左向右浓度依 次增加，从左向右的浓度依次为：0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、 1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L；
图10为不同浓度的Thr在检测过程中的颜色变化图，从左向右浓度依 次增加，从左向右的浓度依次为：0U/mg、50U/mg、100U/mg、150U/mg、 250U/mg、300U/mg、350U/mg、400U/mg、500U/mg、625U/mg。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这 些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各 个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点 值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视 为在本文中具体公开。
本发明提供一种基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，包括如下 步骤：
(1)在反应溶剂I中，将生物分子的G4核酸适配体与钾离子进行混合 反应，得到反应溶液I；
(2)将所述反应溶液I、氯化血红素和含有所述生物分子的待测物进行 混合I，得到反应溶液II；
(3)将所述反应溶液II、过氧化氢和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行混合 II，得到反应溶液III，观察所述反应溶液III的颜色变化并检测吸光值；
(4)激光照射所述反应溶液III，监测激光关闭后的温度变化。
其中，步骤(3)中提到的观察所述反应溶液III的颜色变化的方法可以 是直接观察，然后将观察到的颜色与比色卡对比，从而得知待检测样品中是 否含有生物分子。吸光值的检测可以是通过紫外-可见光分光光度计测定 550-750nm波长范围内的紫外可见吸收光谱，或者直接测量650nm波长处的 吸光度A。
步骤(4)中提到的温度的检测可以是通过温度计进行检测，也可以是 铜鼓普FLIR3C热成像相机监测激光关闭后的温度变化。为了能够进一步提 高检测的准确性，步骤(4)中的温度变化的检测至少测定三次。
本发明的发明人在研究过程中发现，在没有生物分子存在时，生物分子 的核酸适配体与氯化血红素结合形成DNA酶，能高效催化过氧化氢氧化底 物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺导致溶液变为蓝色，通过激光照射后的溶液温度升 高明显；当有生物分子存在时，检测无DNA酶的形成，溶液颜色变浅，激 光照射后温度变化减弱，通过两种情况下颜色和温度的对比实现比色-温度 双信号检测，从而提高生物分子检测的精密度。
所述生物分子可以是任意一种其G4核酸适配体为G-四链体的生物分 子。为了进一步提高生物分子检测的精密度，优选地，所述生物分子选自赭 曲霉素A、腺嘌呤核苷三磷酸和凝血酶中的至少一种；所述赭曲霉素A的 G4核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述腺嘌呤核苷三磷酸 的G4核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述凝血酶的G4核 酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。发明人实际试验过程中发现，采用上述G4核酸适配体对上述生物分子进行检测，其颜色、温度变化更为 明显，检测的精密度更高。
具体地，上述三种G4核酸适配体户通过引物合成公司购买，下表为上 述三种G4核酸适配体的序列设计表。
| DNA name | DNA sequence(5’to 3’) |
| OTA aptamer | GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC(SEQ ID NO.1) |
| ATP aptamer | ACCTGGGGGAGTATTTGCGGAGGAAGGT(SEQ ID NO.2) |
| Thrombin aptamer | TATAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT(SEQ ID NO.3) |
所述G4核酸适配体和所述钾离子可以是本领域技术人员根据实际情况 进行配比。优选地，在步骤(1)中，所述G4核酸适配体和所述钾离子的摩尔比为1:5000-15000。在该摩尔比下，G4核酸适配体和钾离子的反应效果 更好，后续检测的精密度更高。
优选地，在步骤(1)中，所述G4核酸适配体的浓度为0.5-2μM。发明 人试验过程中发现，该浓度的G4核酸适配体具有较高的检测效果。
为了进一步提高检测的精密度，优选地，在步骤(1)中，所述混合反 应包括：将生物分子的G4核酸适配体与钾离子混合后，加热、冷却。通过 加热的方式能够促进G4核酸适配体和钾离子的反应，从而进一步提高后续 检测的精密度。
所述加热温度可以设置为60-100℃，为了进一步提高反应效果，进而提 高检测的精密度，优选地，所述加热的条件至少满足：温度为80-95℃，时 间为2-8min。
用于提供钾离子的钾源可以是氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等含有钾离子的 无机盐，反应溶剂I可以是水或者是各种能够用于生物反应的缓冲液。为了 提高反应效果，优选地，用于提供所述钾离子的钾源为氯化钾；所述反应溶 剂I为水。
所述氯化血红素的添加量可以是本领域技术人员根据实际情况确定，优 选地，在步骤(2)中，以1μmol的所述G4核酸适配体计，所述氯化血红 素的添加量为0.8-1.2μmol。能够使其氯化血红素与反应溶液I从而反应，从 而提高后续检测的精密度。
优选地，在步骤(2)中，所述混合I的方法为：分别提供含有氯化血 红素的溶液和含有生物分子的溶液，将所述含有氯化血红素的溶液、所述含 有生物分子的溶液和所述反应溶液I混合。所述含有氯化血红素的溶液中氯 化血红素的浓度可以是本领域技术人员根据实际情况确定。含有生物分子的 溶液中生物分子的浓度不做过多限定，可以是原有待测液体中含有的生物分 子的浓度，也可以是稀释后的待测液体中含有的生物分子的浓度，该生物分 子的浓度可以是零，也可以是该待测液体中所能容纳的上限值。以能够使得 反应更为充分，从而提高后续检测的精密度。
含有氯化血红素的溶液的浓度可以是本领域技术人员根据实际情况确 定，优选地，含有氯化血红素的溶液的浓度为2μM。
所述步骤(2)还包括将混合I得到液体至于水浴中加热，然后冷却至 室温。优选地，所述水浴加热的条件至少满足：温度为35-40℃，时间为 5-15min。
所述过氧化氢和所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的添加量可以是本领域技 术人员根据实际情况确定，优选地，在步骤(3)中，以1μmol的所述G4 核酸适配体计，所述过氧化氢的添加量为0.5-2mmol，所述3,3’,5,5’-四甲基 联苯胺的添加量为0.2-0.6mmol。以能够充分促进过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四 甲基联苯胺，提高检测的精密度。
优选地，在步骤(3)中，所述混合II的方法为：分别提供含有过氧化 氢的溶液和含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液，将所述含有过氧化氢的溶 液、所述含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液和所述反应溶液II混合。以使得 反应更为充分，从而提高检测的精密度。
含有过氧化氢的溶液的浓度以及含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液的 浓度可以是本领域技术人员根据实际情况确定，优选地，含有过氧化氢的溶 液的浓度为2mM，含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液的浓度为0.4mM。
更优选地，在步骤(3)中，在所述反应溶液II中加入缓冲液。所述缓 冲液可以是PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液，优选为PBS 缓冲液。
优选地，在步骤(4)中，所述激光照射的条件至少满足：波长为 780-830nm，功率密度为1.7-2.5W/cm2，时间为15-35s。发明人在研究过程 中发现，该激光照射条件能够有效增加两种情况下的温度差值，从而提高检 测的精密度。
进一步优选地，所述激光的波长为800-815nm，功率密度为1.7-2.4 W/cm2。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
核苷酸序列如SEQ ID NO.1的G4核酸适配体购于北京擎科生物科技有 限公司，核苷酸序列如SEQ ID NO.2的G4核酸适配体购于北京擎科生物科 技有限公司，核苷酸序列如SEQ ID NO.3的G4核酸适配体购于北京擎科生 物科技有限公司；氯化血红素购于阿拉丁试剂(上海)有限公司，产品编号 为H140872；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺购于麦克林生化科技(上海)有限公司， 产品编号为T818494；其它试剂均购于国药集团。含有OTA的啤酒溶液、含有OTA的白酒溶液、含有ATP的胎牛血清、含有Thr的人血清中各生物 分子的含量均是预先知道的。
紫外-可见光分光光度计购于岛津企业管理(中国)有限公司，其型号为 UV-3600Plus；红外热成像相机购于菲力尔公司，其型号为FLIR LEPTON3。
实施例1
(1)将2μL 2μM的G4核酸适配体(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， G4核酸适配体的浓度为2μM)水溶液和2μL 20mM的氯化钾水溶液混合， 在90℃的条件下加热5min，冷却至室温后，得到反应溶液I；
(2)在上述反应溶液I中加入2μL 2μM的氯化血红素水溶液以及2μL 的啤酒(OTA含量2μM)，在37℃的条件下水浴10min，冷却至室温后， 得到反应溶液II；
(3)在上述反应溶液II中加入2μL 2mM的过氧化氢水溶液以及4μL 0.4mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液，并加入pH为7的磷酸缓冲液 (10mM)定容至100μL，得到反应溶液III，采用紫外-可见光分光光度计测 量该反应溶液III在650nm波长处的吸光度A并观察期颜色变化(如图8所 示)；
(4)以2.1W/cm2为功率密度、波长为808nm激光垂直照射25s，用热 成像相机监测激光关闭后的温度变化，并重复测量三次。
实施例2
(1)将2μL 2μM的G4核酸适配体(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， G4核酸适配体的浓度为2μM)水溶液和2μL 20mM的氯化钾水溶液混合， 在90℃的条件下加热5min，冷却至室温后，得到反应溶液I；
(2)在上述反应溶液I中加入2μL 2μM的氯化血红素水溶液以及2μL 的白酒(OTA含量2μM)，在37℃的条件下水浴10min，冷却至室温后， 得到反应溶液II；
(3)在上述反应溶液II中加入2μL 2mM的过氧化氢水溶液以及4μL 0.4mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液，并加入pH为7的磷酸缓冲液 (10mM)定容至100μL，得到反应溶液III，采用紫外-可见光分光光度计测 量该反应溶液III在650nm波长处的吸光度A；
(4)以2.1W/cm2为功率密度、波长为808nm激光垂直照射25s，用热 成像相机监测激光关闭后的温度变化，并重复测量三次。
实施例3
(1)将2μL 1μM的G4核酸适配体(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， G4核酸适配体的浓度为2μM)水溶液和2μL 5mM的氯化钾水溶液混合，在 80℃的条件下加热8min，冷却至室温后，得到反应溶液I；
(2)在上述反应溶液I中加入0.8μL 2μM的氯化血红素水溶液以及2μL 的胎牛血清(ATP含量2μM)，在35℃的条件下水浴15min，冷却至室温后， 得到反应溶液II；
(3)在上述反应溶液II中加入0.5μL 2mM的过氧化氢水溶液以及1μL 0.4mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液，并加入pH为7的磷酸缓冲液 (10mM)定容至100μL，得到反应溶液III，采用紫外-可见光分光光度计测 量该反应溶液III在650nm波长处的吸光度A并观察其颜色变化(如图9所 示)；
(4)以2.1W/cm2为功率密度、波长为808nm激光垂直照射25s，用热 成像相机监测激光关闭后的温度变化，并重复测量三次。
实施例4
(1)将2μL 4μM的G4核酸适配体(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， G4核酸适配体的浓度为2μM)水溶液和2μL 60mM的氯化钾水溶液混合， 在95℃的条件下加热2min，冷却至室温后，得到反应溶液I；
(2)在上述反应溶液I中加入4.8μL 2μM的氯化血红素水溶液以及2μL 的人血清(Thr含量100U/mg)，在40℃的条件下水浴5min，冷却至室温后， 得到反应溶液II；
(3)在上述反应溶液II中加入6μL 2mM的过氧化氢水溶液以及12μL 0.4mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液，并加入pH为7的磷酸缓冲液 (10mM)定容至100μL，得到反应溶液III，采用紫外-可见光分光光度计测 量该反应溶液III在650nm波长处的吸光度A并观察其颜色变化(如图10 所示)；
(4)以2.1W/cm2为功率密度、波长为808nm激光垂直照射25s，用热 成像相机监测激光关闭后的温度变化，并重复测量三次。
实施例5
在实施例4的基础上将步骤(3)中磷酸缓冲液改为pH为7的Tris-HCl 缓冲液。
实施例6
在实施例4的基础上将步骤(3)中的磷酸缓冲液改为pH为7的HEPES 缓冲液。
实施例7
在实施例1的基础上将步骤(3)中的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的浓度改 为0.2mM。
实施例8
在实施例1的基础上将步骤(3)中的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的浓度改 为0.6mM。
实施例9
在实施例1的基础上将步骤(3)中的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的浓度改 为0.8mM。
实施例10
在实施例2的基础上将步骤(3)中的过氧化氢水溶液的浓度改为 0.5mM。
实施例11
在实施例2的基础上将步骤(3)中的过氧化氢水溶液的浓度改为1mM。
实施例12
在实施例2的基础上将步骤(3)中的过氧化氢水溶液的浓度改为4mM。
实施例13
在实施例1的基础上将激光功率密度调整为0.15W/cm2。
实施例14
在实施例1的基础上将激光功率密度调整为0.7W/cm2。
实施例15
在实施例1的基础上将激光功率密度调整为1.25W/cm2。
实施例16
在实施例1的基础上将激光功率密度调整为1.75W/cm2。
实施例17
在实施例1的基础上将激光功率密度调整为2.35W/cm2。
实施例18
在实施例1的基础上将激光照射时间调整为5s。
实施例19
在实施例1的基础上将激光照射时间调整为10s。
实施例20
在实施例1的基础上将激光照射时间调整为15s。
实施例21
在实施例1的基础上将激光照射时间调整为20s。
实施例22
在实施例1的基础上将激光照射时间调整为30s。
实施例23
在实施例1的基础上将激光照射时间调整为35s。
测试例
预先测量标准浓度下的温度变化，并作出标准曲线如图6所示，其中， a为OTA浓度和温度变化的标准曲线，b为ATP浓度与温度变化的标准曲线， c为Thr浓度和温度变化的标准曲线。将上述实施例1-4测量得到的温度变 化结果带入上述各曲线中，得到如下数据：
根据上述实施例的数据可知，本发明提供的基于核酸适配体的检测生物 分子的方法，回收率接近百分之百，相对标准偏差更小，具有较好的精密度 和重现性。
而且，发明人发现，在最佳实验条件(实施例1和实施例2中的条件) 下的标准曲线测量中，溶液的温度与OTA、ATP和Thr的浓度分别在 0μM-2.5μM、0μM-2.5μM和0U/mg-500U/mg范围内具有良好的线性关系， 检出限分别为0.4μM、0.2μM和60U/mg，参见图6。
通过图1可以看出，采用PBS缓冲液的体系中的吸光度更高，说明在该 体系中浓度的变化更易被检测出。由图2可知，在G4核苷酸配体和3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺的摩尔比为1：200-400的条件下吸光度更高，说明在该比值 下浓度的变化更易被检测出。有图3可知，在G4核苷酸配体和3,3’,5,5’-四 甲基联苯胺的摩尔比为1：500-2000的条件下吸光度更高，说明在该比值下 浓度的变化更易被检测出。由图4可知，激光功率密度在1.75-2.35W/cm2的温度变化差值更大，说明此时生物分子浓度的变化更易被检测出。由图5 可知，激光功率密度在15-35s的温度变化差值更大，说明此时生物分子浓度 的变化更易被检测出。
由图7可知，对不同的生物分子在与OTA、ATP和Thr相对应的条件下 进行了温度变化检测，其中，在检测OTA、ATP和Thr时的温度变化更小， 能够与不添加生物分子形成明显差别，其检测效果更好。
图8-图10分别是不同浓度的OTA、ATP和Thr在检测过程中的颜色变 化图，从左向右生物分子的浓度逐渐增加，其颜色逐渐减淡。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在 本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包 括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样 应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法
<130> 2021.8.27
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat c 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
acctggggga gtatttgcgg aggaaggt 28
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tatagtccgt ggtagggcag gttggggtga ct 32
Claims (9)
1.一种基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在反应溶剂I中，将生物分子的G4核酸适配体与钾离子进行混合反应，得到反应溶液I；
(2)将所述反应溶液I、氯化血红素和含有所述生物分子的待测物进行混合I，得到反应溶液II；
(3)将所述反应溶液II、过氧化氢和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行混合II，得到反应溶液III，观察所述反应溶液III的颜色变化并检测吸光值；
(4)激光照射所述反应溶液III，监测激光关闭后的温度变化；
所述生物分子选自赭曲霉素A、腺嘌呤核苷三磷酸和凝血酶中的至少一种；所述赭曲霉素A的G4核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述腺嘌呤核苷三磷酸的G4核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述凝血酶的G4核酸适配体的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述G4核酸适配体和所述钾离子的摩尔比为1:5000-15000。
3.根据权利要求2所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述G4核酸适配体的浓度为0.5-2μM。
4.根据权利要求1所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述混合反应包括：将生物分子的G4核酸适配体与钾离子混合后，加热、冷却。
5.根据权利要求4所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，所述加热的条件至少满足：温度为80-95℃，时间为2-8min。
6.根据权利要求1所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，用于提供所述钾离子的钾源为氯化钾；所述反应溶剂I为水。
7.根据权利要求1所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，在步骤(2)中，以1μmol的所述G4核酸适配体计，所述氯化血红素的添加量为0.8-1.2μmol；
所述混合I的方法为：分别提供含有氯化血红素的溶液和含有生物分子的溶液，将所述含有氯化血红素的溶液、所述含有生物分子的溶液和所述反应溶液I混合。
8.根据权利要求1所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，在步骤(3)中，以1μmol的所述G4核酸适配体计，所述过氧化氢的添加量为0.5-2mmol，所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的添加量为0.2-0.6mmol；
所述混合II的方法为：分别提供含有过氧化氢的溶液和含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液，将所述含有过氧化氢的溶液、所述含有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的溶液和所述反应溶液II混合。
9.根据权利要求1所述的基于G4核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述激光照射的条件至少满足：波长为780-830nm，功率密度为1.7-2.5W/cm2，时间为15-35s。
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