CN106706528A

CN106706528A - 一种基于核酸适配体的四环素比色检测法

Info

Publication number: CN106706528A
Application number: CN201611059939.0A
Authority: CN
Inventors: 孔令洪; 孔宇; 杨贵芳; 杨桂芳; 陈述濛
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明公开了一种基于核酸适配体的四环素比色检测法。所述的比色检测法包括以下几个步骤：(1)制备胶体金溶液，加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物，形成稳定的检测体系。(2)制备所述四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤(1)所述的检测体系中，观察体系颜色的变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线。(3)将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，即可求出样品中四环素的浓度。与现有技术相比，本发明能够实现对水体、牛奶等溶液中四环素的快速、简便、普适性检测。

Description

一种基于核酸适配体的四环素比色检测法

【技术领域】

本发明属于食品安全技术和分析化学技术领域。涉及一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，特别涉及纳米金颗粒、阳离子混合物和非标记四环素适配体形成的稳定体系检测样品中四环素的方法。

【背景技术】

四环素(tetracycline，TET)是一种重要的广谱抗菌药物，从放线菌金色链球菌的培养液分离而来，属于氢化并四苯环衍生物。四环素能阻碍氨酰tRNA与核糖体的结合而影响菌体蛋白的合成，具有稳定的药性，优良的抗菌性，因此被用来抑制革兰氏阴性菌、阳性菌、立克次体等生长。另外，由于价格低廉，能促进动物生长等作用，四环素也被用作饲料添加剂广泛应用于畜牧业及水产养殖业。我国每年约有上千万吨兽用抗生素用于畜禽饲料添加剂，占全球抗生素饲料添加剂使用量的一半，其中四环素类抗生素在我国及世界畜禽养殖业中的生产量与实际使用量均为最大。然而四环素在动物体内并不能被完全吸收代谢，大部分以原药或代谢物的形式随尿，粪便等排出，并进入土壤、地表水及地下水等环境中，不仅污染环境、破坏微生态系统平衡，而且会对人类健康带来直接或间接的危害。为了保障消费者的食品安全，我国农业部修订的235号公告《动物食品中兽药最高残留限量》中规定所有动物性食品中四环素类药物的最高残留量为100-600μg/kg，其中牛/羊奶中四环素残留量为100μg/kg。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，主要用以快速、简便地检测水体、牛奶等样品中的四环素残留量。本发明方法结合了胶体金颗粒在一定阳离子浓度下会发生聚沉变色的现象和适配体保护胶体金免于发生聚沉的作用而检测四环素含量，检测体系颜色和吸光度的变化与四环素的含量具有一定的线性关系。相比于上述现有技术，本方法具有操作灵活简便，不依赖专业技术人员，普适性强等优势。

本发明采用以下技术方案：

一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，包括：

(1)制备胶体金溶液，并加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物形成稳定的检测体系；

(2)制备四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤(1)所述检测体系中，观察相应的颜色变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线；

(3)将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。

进一步的，步骤(1)中，对所述四环素高亲和性核酸适配体的DNA序列具有如SEQID NO：1所示的核苷酸序列。

进一步的，步骤(1)中，所述的胶体金溶液制备方法包括：将100ml，0.01％的氯金酸溶液煮沸后，加入2.2ml，1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色由灰色变为红色后在室温下冷却，得到的胶体金溶液分装于离心管中，在4℃～10℃保存待用。

进一步的，步骤(1)中，所述四环素高亲和性核酸适配体浓度为10μM。

进一步的，步骤(1)中，所述阳离子混合物为阳离子聚合物PDM和NaCl的混合物。

进一步的，步骤(1)中，所述NaCl浓度为0.14M，孵育条件为25℃，10min。

进一步的，步骤(2)中，所述的四环素标准液含一系列浓度梯度，所述的浓度梯度范围为：0～10,000nM。

进一步的，步骤(2)中，所述标准曲线绘制步骤包括：记录不同浓度四环素标准溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，根据吸收光比率(y＝A650/A520)绘制四环素浓度的标准曲线。

进一步的，所述标准曲线回归曲线方程为y＝0.1468x+0.282，相关系数R2为0.993，(y＝A650/A520)为不同四环素浓度下紫外吸收值比率，x为相应四环素的浓度。

进一步的，步骤(3)中，所述待测样品中四环素浓度为：根据样品测得的吸收值比率(y＝A650/A520)，对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明方法由于利用胶体金颜色变化以达到检测四环素的目的，提供了一种简便、快速、灵敏、可肉眼观察的快速分析技术；

进一步的，本发明方法的灵敏度高，选择了PDM和NaCl混合物作为阳离子溶液，具有增大检测灵敏度，降低检测限的优势；

进一步的，本发明方法的特异性好，这是由选择的适配体高的亲和性和强的特异性决定的；

进一步的，本发明方法中适配体无需标记，操作不依赖大型仪器和专业技术人员，检测成本低，普适性强。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

【附图说明】

图1为基于核酸适配体的四环素比色检测法的原理图；

图2为不同阳离子混合物浓度下胶体金的吸收光谱图；

图3为不同浓度四环素的吸光度；

图4为四环素标准溶液紫外吸收值比率A₆₅₀/A₅₂₀与四环素浓度之间关系的线性拟合图；

图5为不同物质加入检测体系中形成检测体系后的吸光度比值A₆₅₀/A₅₂₀。

【具体实施方式】

本发明检测方法的原理是(如图1所示)，纳米金强烈的粒子间距光学效应，其在分散状态下呈红色，而在高盐浓度下发生凝聚后变蓝。四环素适配体通过暴露带正电荷的碱基与胶体金表面的负电荷发生静电作用而直接吸附在胶体金表面，以此保护胶体金颗粒在高盐浓度下免于发生凝集变色。当向检测体系中加入含有四环素的样品时，适配体与四环素发生特异性结合，从纳米金表面解离，失去单链保护的纳米金在高盐浓度下发生凝集，体系颜色由酒红色变为紫色甚至是蓝色。体系的颜色变化和引起的吸光值比率的变化程度与四环素的含量成正比，基于此实现对水体、牛奶等样品中四环素的检测。

本发明涉及一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，具体步骤如下：

步骤一，制备胶体金溶液，并加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物形成稳定的检测体系。

步骤二，制备所述四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤一所述的检测体系中，观察体系颜色的变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线。

步骤三，将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，即可求出样品中四环素的浓度。

进一步的，步骤一中所述胶体金溶液是由柠檬酸钠和氯金酸摩尔比为3:1制备得到的。

进一步的，步骤一中所述对四环素特异性识别且亲和力高的核酸适配体的DNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。基于此适配体，保证了本发明检测方法的特异性与灵敏性。

进一步的，步骤一中所述的四环素适配体浓度为10μM。

进一步的，步骤一中所述的阳离子混合物包括阳离子聚合物PDM和NaCl，孵育条件为25℃，10min。基于此，使胶体金充分聚沉变色，提高检测灵敏度。

进一步的，步骤二中所述的四环素标准液具有一系列浓度梯度，所述的浓度梯度范围为：0～10000nM。基于此标准液浓度梯度，绘制四环素标准曲线；

进一步的，步骤二中所述的标准曲线绘制步骤包括：记录四环素标准溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，根据吸收光比率A₆₅₀/A₅₂₀绘制四环素浓度的标准曲线；

进一步的，步骤三中，所述的待测样品中四环素含量的计算是指：根据样品测得的吸收值比率A₆₅₀/A₅₂₀，对应标准曲线，即可求出待测样品中四环素的浓度。

进一步的。步骤三中所述的标准曲线回归曲线方程为y＝0.1468x+0.282，相关系数R²为0.993。(y＝A₆₅₀/A₅₂₀)为不同四环素浓度下紫外吸收值比率，x为相应四环素的浓度。

实施例1纳米金制备的优化。

为提高体系检测灵敏性，本发明中对纳米金溶液颜色与颗粒大小进行优化选择。根据柠檬酸钠与氯金酸的摩尔比设置10个梯度：1.5:1、2:1、2.7:1、3:1、3.5:1、4:1、4.2:1、4.5:1、5:1、10:1。加热反应完成后冷却至室温，根据溶液颜色和透射电镜图，选择柠檬酸钠与氯金酸摩尔比为3:1。

实施例2合成四环素核酸适配体。

所述的四环素核酸适配体碱基序列为：5’-CGCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGTG-3’，配制成10μM的浓度。

实施例3检测体系的优化

向阳离子聚合物PDM溶液中加入氯化钠，配成一系列浓度的阳离子混合物。如图2所示，取7个离心管加入纳米金溶液和超纯水，1管作为对照，其余6管分别加入0.5ml阳离子混合物溶液，其中氯化钠浓度范围为0.10～0.20M，体系反应10min。结果显示，当混合物中氯化钠浓度由0.12M增加为0.14M时，溶液彻底凝集变蓝，且吸收光谱图显示溶液在520nm处几乎无吸收值，为提高检测灵敏度，应选择使胶体金溶液聚沉变色的最小离子浓度，故氯化钠的最优浓度为0.14M。取8个离心管加入纳米金溶液，分别加入0.2～5.0μl浓度为10μM的适配体，室温孵育10min后各管均加入一定体积超纯水使体系总体积一致，混匀后再加入0.5ml阳离子混合物溶液。结果显示，当加入2μL适配体时体系无凝聚变色，结合吸收光谱图选择2μL10μM适配体量为最优添加量。

实施例4标准曲线的建立

取9个离心管加入纳米金溶液和2μL10μM适配体，室温孵育10min后分别向各管中加入浓度梯度为0～10000ng/ml的四环素标准液。混合均匀后孵育10min，再均加入0.5ml优化的阳离子溶液，观察各管体系颜色并扫描其紫外可见吸收光谱(如图3所示)，以各管标准溶液测得的吸光值比率绘制标准曲线(如图4所示)。标准曲线回归曲线方程为y＝0.1468x+0.282，相关系数R²为0.993。(y＝A₆₅₀/A₅₂₀)为不同四环素浓度下紫外吸收值比率，x为相应四环素的浓度。本四环素生物传感器的线性范围10～10000ng/ml，定量检测限为2.9ng/ml。

实施例5检测体系特异性的评测

取3个离心管加入纳米金溶液和2μL10μM适配体，室温孵育10min后分别向各管中加入一定浓度的四环素、土霉素、氯霉素溶液。混合均匀后孵育10min，再均加入0.5ml阳离子混合物溶液，观察各管体系颜色并扫描其紫外可见吸收光谱，结果如图5所示，证明本发明检测方法具有很高的特异性。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

核苷酸序列表

<110>西安交通大学

<120>一种基于核酸适配体的四环素比色检测法

<130>表示案卷参考号

<160> 1

<170>表示序列表电子文件的软件版本信息

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>能够对四环素特异性识别结合的DNA片段

<400> 1

cgcccccggcaggccacggcttgggttggtcccactgcgcgtgtg 45

Claims

1.一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，对所述四环素高亲和性核酸适配体的DNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，所述的胶体金溶液制备方法包括：将100ml，0.01％的氯金酸溶液煮沸后，加入2.2ml，1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色由灰色变为红色后在室温下冷却，得到的胶体金溶液分装于离心管中，在4℃～10℃保存待用。

4.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，所述四环素高亲和性核酸适配体浓度为10μM。

5.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，所述阳离子混合物为阳离子聚合物PDM和NaCl的混合物。

6.根据权利要求5所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，所述NaCl浓度为0.14M，孵育条件为25℃，10min。

7.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(2)中，所述的四环素标准液含一系列浓度梯度，所述的浓度梯度范围为：0～10,000nM。

8.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(2)中，所述标准曲线绘制步骤包括：记录不同浓度四环素标准溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，根据吸收光比率y＝A₆₅₀/A₅₂₀绘制四环素浓度的标准曲线。

9.根据权利要求8所述的绘制标准曲线，其特征在于，所述标准曲线回归曲线方程为y＝0.1468x+0.282，相关系数R²为0.993，y＝A₆₅₀/A₅₂₀为不同四环素浓度下紫外吸收值比率，x为相应四环素的浓度。

10.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(3)中，所述待测样品中四环素浓度为：根据样品测得的吸收值比率y＝A₆₅₀/A₅₂₀，对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。