CN110836881A - 石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光检测抗生素的方法 - Google Patents

石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光检测抗生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光双模检测抗生素的方法。本发明是以带负电的柠檬酸修饰的金纳米粒子(AuNPs)作为比色探针，以带正电的石墨相氮化碳纳米片层(g‑C3N4)作为荧光探针，适配体作为AuNPs的保护剂防止两种不同电荷的纳米材料聚集。在检测过程中，适配体与抗生素特异性结合，失去对金纳米粒子的保护能力，使两种带不同电荷的纳米材料由于正负电荷相互吸引，使AuNPs聚集在g‑C3N4表面，利用金纳米粒子表面等离子体共振及淬灭荧光的性质和g‑C3N4的荧光性质，可以通过溶液颜色由红变蓝及荧光由强变弱来指示水溶液中抗生素的存在。本发明灵敏度高，检测结果直观可信，可以通过裸眼观察，并且操作简单，造价低，所用试剂和操作过程无毒副作用。

Description

石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光检测抗生素的方法
技术领域
本发明涉及比色法、荧光法检测技术，具体涉及一种石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光双模检测抗生素的方法。
背景技术
现有仪器技术检测抗生素的方法包括色谱分析法、酶免疫分析方法、毛细管电泳法和放射免疫测定法。但这些方法存在仪器昂贵、操作繁琐、需要专业的分析操作人员、样品处理复杂、成本高的缺点。近年来，以纳米材料为代表发展了一系列光谱法检测抗生素的方法，它们成本低，不需要繁琐的预处理步骤，但是在这些光谱法检测抗生素的方法大都局限于用一种光谱响应信号来进行检测，其检测结果易受仪器因素或复杂样品中的环境条件影响，导致检测结果不准确。与传统的单信号检测方法相比，多信号检测方法可以避免复杂系统中背景的影响，获得更准确的检测结果。因此本发明着眼于利用AuNPs的比色性质和淬灭荧光性质及g-C3N4的荧光性质发明一种可以实现比色、荧光双模式响应的抗生素检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、检测限低、检测范围宽的双模石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光双模检测抗生素的方法。
为实现上述目的，本发明以带负电的柠檬酸修饰的金纳米粒子(AuNPs)作为比色探针，以带正电的石墨相氮化碳纳米片层(g-C3N4)作为荧光探针，适配体作为AuNPs的保护剂防止两种不同电荷的纳米材料聚集。在检测抗生素过程中，适配体易与抗生素特异性结合并发生构型转变，同时失去对金纳米粒子的保护能力，使两种带不同电荷的纳米材料AuNPs和g-C3N4在正负电荷相互吸引，AuNPs聚集在g-C3N4表面，利用金纳米粒子表面等离子体共振及淬灭荧光的性质和g-C3N4的荧光性质，可以通过溶液颜色由红变蓝及荧光由强变弱来指示水溶液中抗生素的存在。本发明灵敏度高、选择性好、不需要大型仪器、可实现原位快速检测，检测结果直观，可以通过裸眼观察，并且操作简单，造价低，所用试剂和操作过程无毒副作用。
本发明提供的一种石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光双模检测抗生素的方法，具体步骤包括：
(1)制备并配置浓度10-50nM的AuNPs；
(2)制备并配置浓度0.5-2mg/mL的g-C3N4；
(3)配置浓度500-800nM的抗生素适配体；
(4)按体积比0.5-2:1将上述浓度的AuNPs与抗生素适配体混合均匀，孵育15-60min；
(5)按体积比0.5-2:1将步骤(4)孵育后的AuNPs与抗生素适配体的混合液与g-C3N4混合均匀，得到检测抗生素的探针标准溶液；
(6)将待测溶液加入步骤(5)得到的探针标准溶液中，通过溶液颜色由红变蓝及荧光由强变弱的变化实现抗生素检测。
所述抗生素为四环素类、磺胺类、喹诺酮类或氨基糖甙类抗生素等。
所述待测溶液可为含抗生素的溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的两种探针溶液AuNPs和g-C3N4，提供了比色及荧光双模式检测信号，使得探针检测结果更准确。且灵敏度高、检出范围宽，检出限1.01×10-16M，比现有方法的检出限低至少三个数量级，检出范围为5×10-16M到5×10-11M；可以实现水中抗生素的超灵敏检测；
(2)不需要大型仪器，通过裸眼观察或比色、荧光光谱，即可识别检测结果；
(3)本发明所用试剂和操作过程均无毒副作用；
(4)本发明方法简单、快速、易操作，可进行现场原位快速检测。
附图说明
图1为本发明制备的探针标准溶液随g-C3N4浓度的变化其荧光淬灭效率的变化。
图2为本发明制备的探针标准溶液随适配体与金纳米粒子比例变化其UV-Vis吸收在650nm和520nm处的光谱比值(A650/A520)的变化。
图3为本发明制备的探针标准溶液随适配体与金纳米粒子比例变化g-C3N4荧光光谱在440纳米处的变化。
图4为本发明制备的探针标准溶液随pH变化金纳米粒子的UV-Vis吸收光谱的变化。
图5为本发明制备的探针标准溶液随四环素浓度的变化其UV-Vis吸收光谱的变化。
图6为本发明制备的探针标准溶液与不同浓度四环素溶液之间的UV-Vis线性关系。
图7为本发明制备的探针标准溶液随四环素浓度的变化其荧光光谱的变化。
图8为本发明制备的探针标准溶液与不同浓度四环素溶液之间的荧光线性关系。
图9为本发明制备的探针标准溶液随卡那霉素浓度的变化其UV-Vis吸收光谱的变化。
图10为本发明制备的探针标准溶液与不同浓度卡那霉素溶液之间的UV-Vis线性关系。
图11为本发明制备的探针标准溶液随卡那霉素浓度的变化其荧光光谱的变化。
图12为本发明制备的探针标准溶液与不同浓度卡那霉素溶液之间的荧光线性关系。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光探针标准溶液的制备：
(1)将100mL 1mM氯金酸溶液加入带有回流装置的烧瓶中，搅拌，加热到沸腾，然后快速加入10mL 38.8mM柠檬酸钠溶液，回流直到溶液变为酒红色；将烧瓶移出热源，继续搅拌，冷却至室温得到AuNPs；
(2)将二氰二胺在氮气保护下于550℃煅烧4小时。取煅烧得到的黄色粉末500mg与500mL 5M的硝酸溶液在室温下超声处理2小时，再于120℃下加热回流24小时。待冷却至室温后，离心，除上清液，用蒸馏水洗涤至中性。于真空干燥箱中干燥。取50mg上述粉末于50mL蒸馏水中超声3小时，离心，除去不溶物，过滤上清液，制得的g-C3N4纳米片层溶液置于4℃保存待用；
(3)将30μL 600nM AuNPs与30μL 20nM四环素适配体室温孵育30min，加入60μL1mg/mL g-C3N4，再加入60μL Tris-HCl(20mM,pH 8.0)缓冲液，混合均匀得到g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液。
实施例2
g-C3N4浓度的变化对其荧光淬灭效率的影响：
改变实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中g-C3N4的浓度，检测不同浓度下对荧光淬灭效率的影响。
不同浓度对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液荧光淬灭效率的影响见图1：在不同浓度下，荧光淬灭效率均为常数；随着浓度不断增加，常数数值在0.25mg/mL时出现峰值，说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液最佳浓度为0.25mg/mL。
实施例3
改变实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中适配体与金纳米粒子比例。检测在不同适配体与金纳米粒子浓度下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收在650nm和520nm处的光谱比值(A650/A520)的变化。
不同比例的适配体与金纳米粒子对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸光度比值的影响见图2：逐渐增加适配体与金纳米粒子的比例，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液A650/A520常数值不断降低。当比例为30时，出现拐点，说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的最佳适配体与AuNPs的比例为30。
实施例4
改变实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中适配体与金纳米粒子比例。检测在不同适配体与金纳米粒子浓度下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液在440nm处荧光强度的变化。
不同比例的适配体与金纳米粒子对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液在440nm处的荧光强度影响见图3：逐渐增加适配体与金纳米粒子的比例，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液在440nm处荧光强度常数值不断增加。当比例为30时，出现拐点，说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的最佳适配体与AuNPs的比例为30。
实施例5
改变实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中的pH。检测在不同pH条件下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液UV-Vis吸收光谱的变化。
不同pH条件下对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的影响见图4：pH 8时，UV-Vis吸收光谱在650nm处吸收最弱，说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的最佳pH为8。
实施例6
向实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中加入不同浓度的四环素溶液UV-Vis吸收谱图随四环素浓度的变化实验：
取实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液240μL，逐渐向溶液中加入四环素，检测在不同四环素浓度下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的变化。
不同浓度的四环素溶液对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的影响见图5：逐渐增加四环素的浓度，可视化纳米探探针标准溶液在520nm处的吸收峰逐渐降低，650nm处的吸收峰逐渐升高。说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液能够实现对不同四环素浓度的检测。
此外，本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的变化与四环素浓度的对数溶液呈线性关系，如图6所示，随着四环素浓度的增长，吸收光谱比值A650/A520逐渐增强，线性方程的R2＝0.990。
实施例7
向实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中加入不同浓度的四环素溶液荧光光谱图随四环素浓度的变化实验：
取实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液240μL，逐渐向溶液中加入四环素，检测在不同四环素浓度下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的荧光光谱的变化。
不同浓度的四环素溶液对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的荧光光谱的影响见图7：逐渐增加四环素的浓度，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液在440nm处的荧光强度逐渐降低。说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液能够实现对不同四环素浓度的检测。
此外，本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的荧光淬灭效率的变化与四环素浓度的对数溶液呈线性关系，如图6所示，随着四环素浓度的增长，荧光淬灭效率逐渐增强，线性方程的R2＝0.991。
实施例8
为了分析探针溶液是否具有普适性，选取卡那霉素(属于氨基糖甙类抗生素)代替四环素作为模型检测物。在实施例1步骤(1)和(2)的基础上，将实施例1步骤(3)中的四环素适配体替换为卡那霉素适配体，相应地，适配体的浓度由实施例1步骤(3)中的20nM变为100nM。具体的步骤如下：将30μL 600nM AuNPs与30μL 100nM卡那霉素适配体室温孵育30min，加入60μL 1mg/mL g-C3N4，再加入60μL Tris-HCl(20mM,pH 8.0)缓冲液，混合均匀得到g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液。
实施例9
取实施例8制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中加入不同浓度的卡那霉素溶液，检测UV-Vis吸收谱图随卡那霉素浓度的变化实验：
取实施例8制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液240μL，逐渐向溶液中加入卡那霉素，检测在不同卡那霉素浓度下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的变化。
不同浓度的卡那霉素溶液对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的影响见图9：逐渐增加卡那霉素的浓度，可视化纳米探探针标准溶液在650nm处的吸收峰逐渐升高。说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液能够实现对不同卡那霉素浓度的检测。
此外，本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的变化与卡那霉素浓度的对数呈线性关系，如图10所示，随着卡那霉素浓度的增长，吸收光谱比值A650/A520逐渐增强，线性方程的R2＝0.994。
实施例10
向实施例8制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液中加入不同浓度的卡那霉素溶液荧光光谱图随卡那霉素浓度的变化实验：
取实施例8制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液240μL，逐渐向溶液中加入卡那霉素，检测在不同卡那霉素浓度下，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的荧光光谱的变化。
不同浓度的卡那霉素溶液对g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的荧光光谱的影响见图11：逐渐增加卡那霉素的浓度，g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液在440nm处的荧光强度逐渐降低。说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液能够实现对不同卡那霉素浓度的检测。
此外，本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液的荧光淬灭效率的变化与卡那霉素浓度的对数呈线性关系，如图12所示，随着卡那霉素浓度的增长，荧光淬灭效率逐渐增强，线性方程的R2＝0.997。
实施例11
实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液用于饮用水样品中四环素的检测实验：
如表1所示，采用标准加入法，向饮用水中加入四环素。用实施例1制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液检测四环素的含量，测得的相对标准偏差均小于5％，说明本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针标准溶液可以用于检测实际样品中的四环素。
表1为本发明制备的g-C3N4/AuNPs比色荧光探针用于饮用水中四环素的检测
Figure BDA0002282666680000061

Claims (2)

1.一种石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光双模检测抗生素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备并配置浓度10-50nM的AuNPs；
(2)制备并配置浓度0.5-2mg/mL的g-C3N4；
(3)配置浓度500-800nM的抗生素适配体；
(4)按体积比0.5-2:1将上述浓度的AuNPs与抗生素适配体混合均匀，孵育15-60min；
(5)按体积比0.5-2:1将步骤(4)孵育后的AuNPs与抗生素适配体的混合液与g-C3N4混合均匀，得到检测抗生素的探针标准溶液；
(6)将待测溶液加入步骤(5)得到的探针标准溶液中，通过溶液颜色由红变蓝及荧光由强变弱的变化实现抗生素检测。
2.如权利要求1所述的一种石墨相氮化碳/金纳米粒子比色荧光双模检测抗生素的方法，其特征在于，所述抗生素为四环素类抗生素、磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素或氨基糖甙类抗生素。
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