CN108535236B

CN108535236B - 一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法

Info

Publication number: CN108535236B
Application number: CN201810299791.0A
Authority: CN
Inventors: 胡勇军; 江宁静; 朱挺锋; 余萌; 张文建; 王棋
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108535236A

Abstract

本发明公开一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法。本发明在4‑MBA标记的金纳米颗粒表面包裹一层聚多巴胺，形成金‑PDA‑银卫星结构的SERS标记，利用金银纳米粒子间的缝隙具有独特的局域表面等离子体共振极大的放大SERS标记的拉曼信号；同时，本发明利用酶切循反应结合磁性捕获机制进一步放大SERS信号，实现对miRNA快速的高灵敏定量检测。本发明操作简单，检测稳定性好，检测灵敏度高；操作时只需将酶切循环反应后的孵育液依次加入到功能化磁性纳米颗粒中反应，再与SERS标记反应，反应结束后通过磁分离可马上进行检测，从而实现快速定量检测；可应用于早期癌症的临床诊断筛查。

Description

一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA(microRNA)的方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是两类非编码(Non-coding)RNA中的短链RNA，一般大小约为22～24个碱基，广泛参与细胞的生长、增殖和分化，影响着人体的生理和病理活动，并且与肿瘤的发生、发展有着密切关系，是目前研究的热点。目前检测miRNA的方法主要有量子点、荧光法和qt-PCR等，但这些方法由于其本身特性存在一定局限性，比如毒性、易光漂白、操作复杂等，无法达到现代医学要求的衡量检测等。而由于miRNA的短序列和在人体内的低表达等原因在临床中很难检测，因此建立快速、简单、无毒、超灵敏度检测miRNA的方法具有非常重要的意义。

拉曼光谱技术可以从分子水平检测物质分子的振动光谱来识别和区分不同物质，但由于拉曼散射较弱，普通的拉曼光谱技术在分析痕量物质时灵敏度存在不足。表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering，SERS)技术是一种新颖的光谱标记方法，利用金属表面显著增强的电磁场放大分子拉曼信号，可以用于生化痕量分析。SERS在生化检测中应用主要分为两大类：直接检测法和间接检测法(SERS标记技术)。直接检测法主要是测得待测物质本身的拉曼振动，但由于生物分子本身的拉曼散射截面较小，直接检测时信号较弱，且在复杂生物体系所得拉曼信号十分复杂，不利于生化分析。SERS标记作为一种新颖的光谱标记方法，利用金银等贵金属纳米粒子增强其表面的标记分子的拉曼信号，并将其特征峰作为检测信号，利用SERS信号探针特异性检测生物分子。与其他光谱分析方法相比，SERS具有独特的优势：(1)拉曼标记分子谱峰窄，分辨率高，可以用于多组分检测；(2)水的拉曼信号极其微弱，SERS可以广泛应用于水溶剂体系(生物体系)的检测；(3)SERS信号几乎不受光漂白影响，不容易发生光猝灭；由于SERS独特的优点，SERS纳米探针在生化分析和医学研究中有良好的应用前景，使其成为自然科学研究中的热点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法。该方法是采用局域表面等离子共振的SERS信号放大双金属基底集合酶切循环放大反应实现对microRNA的超灵敏检测。通过双金属信号增强和酶切循环系统放大信号，实现信号双重放大，实现对样品中的miRNA进行快速、高灵敏度的定量分析，解决现有技术对miRNA检测灵敏度不够、耗时过长等问题。

本发明的方法具有灵敏度高、普适性、检测过程简单、准确定量检测等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，包括如下步骤：

(1)选用4-MBA作为拉曼信号分子，通过该分子一端-SH与金纳米颗粒结合，反应完全加入多巴胺(DA)溶液，通过多巴胺氧化自聚合反应在金纳米颗粒表面形成聚多巴胺(PDA)壳层；

(2)将步骤(1)中包裹后的SERS标记金纳米颗粒用等体积银氨溶液混合，通过PDA表面丰富的儿茶酚基团和氨基基团原位吸附银离子并原位还原为银纳米颗粒，得到金-PDA-银卫星结构的SERS标记；

(3)将特异性识别miRNA的发卡结构适配体和不同浓度的miRNA标准样品液混合反应，miRNA特异性打开发卡结构适配体，裸露出与桥接DNA互补的碱基序列Ⅲ；加入桥接DNA，使碱基序列Ⅲ与桥接DNA形成杂交DNA双链后，再加入剪切酶，剪切酶特异性识别双链的特定位点，剪切桥接DNA成为两段，从发卡结构适配体中游离出来；剪切完毕后发卡结构适配体的碱基序列Ⅲ区域又裸露出来，可以再与体系中桥接DNA互补配对，剪切反应循环，体系中切断的桥接DNA在循环反应中随miRNA的增加而增加；酶切循环放大反应完毕，加热使酶失活；

(4)将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基，加入与桥接DNA的3′端互补配对的-NH₂适配体Aptamer S₁，反应完成用Tris-Ac(三羟甲基氨基甲烷-醋酸)清洗3遍，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；

(5)将步骤(3)中酶切循环反应的溶液加入步骤(4)中的适配体功能化磁性纳米颗粒中孵育，通过碱基互补配对形成捕获探针；

(6)将步骤(5)中的捕获探针与步骤(2)的金-PDA-银卫星结构的SERS标记混合，随着步骤(3)中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体Aptamer S₁，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体Aptamer S₁互补配对后，桥接DNA仍存在部分裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π-π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；

(7)根据miRNA浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对miRNA进行定量检测。

在上述检测miRNA的方法中：

所述的miRNA为人microRNA-31；其序列为：5′-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3′。

步骤(1)中所述的4-MBA是4-巯基苯甲酸；

步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径优选为70nm～85nm；优选为80nm；

步骤(1)中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5～1.5mmol/L；优选为1mmol/L。

步骤(2)中所述的银氨溶液为新制银氨溶液，浓度为1～20mmol/L；优选为6～18mmol/L；更优选为12mmol/L；

步骤(3)中所述的发卡结构适配体序列为：

5′-AGCTATGCCAGCATCTTGCCTGCAAAAAAAATCCTCAGCAGGACCG-3′；

步骤(3)中所述的桥接DNA序列为：

5′-GCAAACAACTGCTGAGGATAAACG-3′；

步骤(3)中所述的发卡结构适配体浓度优选为0.5～1.5μmol/L；更优选为1μmol/L。

步骤(3)中所述的桥接DNA的浓度优选为0.5～1.5μmol/L；更优选为1μmol/L。

步骤(3)中所述的一组具有浓度梯度的标准样品液为0mol、0.2fM、0.4fM、0.6fM、0.8fM、1.0fM、1.2fM、1.4fM、1.6fM、1.8fM、2.0fM、2.2fM、3fM、5fM以及10fM，其中0mol为空白对照；

步骤(3)中所述的发卡结构适配体与miRNA标准样品液的体积比值为6～10；优选为10。

步骤(3)中所述的剪切酶优选为Nb.BbvCI切刻内切酶。

步骤(4)中所述的适配体Aptamer S₁序列为：

5′-GCAGTTGTTTGCTTTTTTTTTT-(CH₂)₇-NH₂-3′；

步骤(4)中所述的适配体Aptamer S₁的浓度优选为0.5～1.5μmol/L；更优选为1μmol/L。

步骤(4)所述的活化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；

步骤(4)中所述的表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe₃O₄，其粒径优选为200～300nm；

步骤(6)中所述的捕获探针和金-PDA-银卫星结构的SERS标记体积混合比例为15：6～8；更优选为15：8。

步骤(6)中所述的磁分离是指利用磁场物理作用分离磁性结合物与上清液，相比于传统的清洗固相基底来去除残留物的步骤，此方法更加高效；

步骤(6)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得：所述的显微拉曼光谱仪的操作条件优选为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～30s(优选为30s)；

步骤(7)中所述的信号是选取拉曼信号分子的特征拉曼谱峰(1586cm^-1)作为定量峰，并以miRNA浓度对该谱峰光谱强度与硅片基底的特征峰(520cm^-1)拉曼强度比值作图，并以此绘制标准曲线；

本发明的机理：在收集时间一定的情况下，对于同一种拉曼信号分子，所测拉曼信号强度与SERS标记的浓度呈正相关；正是在此基础上实现了定量检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明将免疫光谱标记处理的金-PDA-银卫星结构的SERS标记用于miRNA的定量检测，将拉曼分子的信号强度和待测物质的浓度联系起来，类似于朗伯比尔定律，从而实现对miRNA的定量检测；

(2)本发明采用的拉曼信号分子为4-MBA，通过该分子一端-SH与金纳米颗粒结合，形成金巯键，标记分子稳定在金纳米颗粒表面，不易脱落；

(3)本发明在4-MBA标记的金纳米颗粒表面包裹一层聚多巴胺，利用聚多巴胺的还原特性，原位吸附并还原银氨离子，形成金-PDA-银卫星结构的SERS标记，金银纳米粒子间的缝隙具有独特的局域表面等离子体共振，电场大大增强，极大的放大拉曼信号；

(3)本发明基于金-PDA-银卫星结构的SERS标记和酶切循环系统形成双重放大的分子诊断纳米平台，可以对miRNA进行高灵敏定量检测，克服了传统方法在检测低表达短序列核苷酸的不足，同时结合磁性捕获机制的分离作用，通过检测上清液而得到拉曼信号，达到快速检测的目的；

(4)本发明是通过检测溶液的拉曼光谱信号得到相应的结果，相比于传统的检测固相基底的方法，溶液中的拉曼光谱信号监测数据更加稳定可靠且可大量重复；

(5)本发明检测稳定性好，检测灵敏度高，得到了检测区间(0.2fM～10fM)和低的检测限(0.2fM)；

(6)本发明操作简单，金-PDA-银卫星结构的SERS标记和适配体功能化磁性纳米颗粒可以提前准备好，操作时只需将酶切循环反应后的孵育液依次加入到功能化磁性纳米颗粒中反应，再与SERS标记反应，反应结束后通过磁分离可以马上进行检测：收集时间30s，然后立刻从标准曲线上读出浓度，从而实现快速定量检测；该诊断平台可以应用于早期癌症的临床诊断筛查。

附图说明

图1是金-PDA-银卫星结构的SERS标记制备流程示意图。

图2是制备的金纳米颗粒(A)、PDA包裹的金纳米颗粒(B-D)的透射电镜图。

图3是使用不同浓度银氨溶液制备金-PDA-银卫星结构得到的透射电镜图，其中，a中银氨溶液为6mmol/L，b中银氨溶液为9mmol/L，c中银氨溶液为12mmol/L，d中银氨溶液18mmol/L。

图4是酶切循环反应的方法流程示意图。

图5是分子诊断纳米平台的诊断流程示意图。

图6是标准溶液中miRNA-31检测的曲线图；其中，横坐标代表miRNA的浓度，纵坐标代表不同浓度miRNA-31时的拉曼信号强度(I₁₅₈₆/I₅₂₀)。I₁₅₈₆是4-MBA分子在1586波数处的峰强，I₅₂₀是用于校准的硅片基底的特征峰(520波数处)的强度。

图7是miRNA特异性检测的拉曼信号强度图，其中，1：MicroRNA，2：M1，3：M3。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下面实施例中，未注明具体条件和环境的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议的条件。本发明中4-MBA为拉曼信号分子4-巯基苯甲酸；PBS表示磷酸盐缓冲液；Tris-HCl表示三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；Tris-Ac表示三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液；EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚氨盐酸盐；NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺；

金-PDA-银卫星结构的SERS标记制备流程示意图，如图1所示。

酶切循环反应的方法流程示意图，如图4所示。

实施例1

(1)、金纳米颗粒的制备

在不断搅拌下将20mL的1mM的抗坏血酸加入40mL 2mM的氯金酸(HAuCl₄)中。此时溶液的颜色变化是：淡黄-无色-黑色-红棕色，等溶液变成红棕色继续搅拌30min。再加热沸腾30min，最后冷却至常温，制备得到80nm的金纳米颗粒。图2A是优化条件下制备金纳米颗粒的透射电镜图。

(2)、聚多巴胺金纳米粒子的制备

取上述1mL 1mmol/L的金纳米颗粒，与50μL 100mM的4-MBA反应30min左右，反应结束后离心(3000rpm，10min)，Tris-HCl重悬，加入200μL 0.02mg/mL盐酸多巴胺碱性溶液，37℃反应1h，反应结束后离心(3000rpm，10min)，三蒸水清洗三次，500μL三蒸水重悬。图2B-D是优化条件下得到的PDA包裹的金纳米颗粒。

(3)、金-PDA-银卫星结构的SERS标记的制备

取上述500μL聚多巴胺纳米粒子，加入500μL 0.012mol/L的银氨溶液，常温搅拌1h，反应结束后离心(3000rpm，10min)，三蒸水重悬，存于4℃环境下。图3是使用不同浓度银氨溶液制备金-PDA-银卫星结构得到的透射电镜图，其中，a中银氨溶液为6mmol/L，b中银氨溶液为9mmol/L，c中银氨溶液为12mmol/L，d中银氨溶液18mmol/L。

(4)、适配体功能化磁性纳米颗粒的制备

取100μL表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe₃O₄，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，用Tris-Ac清洗两次，最后用Tris-Ac定容至500μL。然后配制EDC(4mg/mL)和NHS(1mg/mL)，首先向上述磁珠溶液加入30μL的EDC溶液，30min后加入同样体积的NHS溶液，活化90min。然后用Tris-Ac缓冲液清洗磁珠两次，之后用500μL Tris-Ac重悬，随后加入50μL(1μM)-NH₂修饰的适配体Aptamer S₁，反应3h后用Tris-Ac洗涤去除多余Aptamer S₁，重悬备用，得到适配体功能化磁性纳米颗粒。

(5)、miRNA标准样品溶液的制备

选择15个浓度的miRNA-31标准样品溶液，分别为0mol、0.2fM、0.4fM、0.6fM、0.8fM、1.0fM、1.2fM、1.4fM、1.6fM、1.8fM、2.0fM、2.2fM、3fM、5fM以及10fM，其中0mol为空白对照。

(6)、酶切循环反应

将上述标样10μL与100μL 1μM的发卡结构适配体于37℃混合孵育30min，加入60μL1μM桥接DNA于37℃混合孵育30min，反应完毕加入8U剪切酶，37℃孵育一小时，80℃加热20min使酶失活，反应完毕，孵育液留存用于捕获探针制备；

(7)分子诊断纳米平台构建以及miRNA的检测

将步骤(6)中孵育液依次加入步骤(4)中的适配体功能化磁性纳米颗粒中，混合反应1h，功能化磁性纳米颗粒上的适配体Aptamer S₁与桥接DNA一端互补序列的杂交，形成捕获探针；将捕获探针与步骤(3)的金-PDA-银卫星结构的SERS标记混合(体积混合比例为15：8)，形成分子诊断纳米平台。图5是分子诊断纳米平台的诊断流程示意图。随着步骤(6)中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体Aptamer S₁，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体Aptamer S₁互补配对后存在多余裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π-π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；

(8)、拉曼信号的测量

利用磁铁的磁场作用分离底物，保留上清液。用日本Nippon Optical System公司的显微拉曼光谱仪，对上清液中的拉曼信号探针进行信号采集，激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为30s。信号采集完毕后通过Origin软件对数据进行基线处理，得到清晰直观的SERS光谱图(如图6A)。

从图6B中可以明显地看到，随着样品中miRNA-31浓度的提高，采集的SERS信号逐渐升高(I₁₅₈₆/I₅₂₀)，两者关系符合Y＝11.729X-1.816，表明在这一区间可以进行有效的定量分析。

实施例2

为了说明本发明的特异性，分别设计了miRNA-31的两个突变体，突变体序列如下：

M1：5′-AGGCAAGAUGTUGGCAUAGCU-3′；

M2：5′-AGGCAAGAUGCUTGCAUAGCU-3′。

具体实施步骤参照实施例1；得到的信号强度可参照图7，说明本发明具有很强的特异性。

实施例3

为了检验此分子诊断纳米平台在实际样品中的应用效果，我们将miRNA-31添加到人血清样品中来作为真实样品的模拟。在此之前，需要对血清进行一系列的处理(过滤、离心、稀释)以消除基质效应对实验结果可能产生的影响。随后，在处理好的血清中，分别加入不同浓度的miRNA-31。这些样品被分别用于检测和分析，具体实施步骤参照实施例1；所得到的结果如表1所示，而健康人体血清中miRNA-31含量一般不超过0.5fM，这些结果表明，该方法能够很好的用于血清中miRNA-31的检测。

表1利用本发明的分子诊断纳米平台测定模拟血清中miRNA-31的结果

miRNA-31(fM)	强度比(I<sub>1586</sub>/I<sub>520</sub>)	测量值(I<sub>1586</sub>/I<sub>520</sub>)	回收率(％)
				0.6	5.2214	5.3102	101.70％
1.0	9.913	9.883	99.70％
				1.4	14.6046	14.4558	98.98％
1.8	19.2962	19.0286	98.61％

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> 一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> microRNA-31

<400> 1

aggcaagaug cuggcauagc u 21

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 发卡结构适配体序列

<400> 2

agctatgcca gcatcttgcc tgcaaaaaaa atcctcagca ggaccg 46

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 桥接DNA序列

<400> 3

gcaaacaact gctgaggata aacg 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 适配体Aptamer S1序列

<220>

<221> modified_base

<222> (22)..(22)

<223> -(CH2)7-NH2修饰

<400> 4

gcagttgttt gctttttttt tt 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> M1

<400> 5

aggcaagaug tuggcauagc u 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> M2

<400> 6

aggcaagaug cutgcauagc u 21

Claims

1.一种基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）选用4-MBA作为拉曼信号分子，通过该分子一端-SH与金纳米颗粒结合，反应完全加入DA溶液，通过多巴胺氧化自聚合反应在金纳米颗粒表面形成PDA壳层；

（2）将步骤（1）中包裹后的SERS标记金纳米颗粒用等体积银氨溶液混合，通过PDA表面丰富的儿茶酚基团和氨基基团原位吸附银离子并原位还原为银纳米颗粒，得到金-PDA-银卫星结构的SERS标记；

（3）将特异性识别miRNA的发卡结构适配体和不同浓度的miRNA标准样品液混合反应，miRNA特异性打开发卡结构适配体，裸露出与桥接DNA互补的碱基序列Ⅲ；加入桥接DNA，使碱基序列Ⅲ与桥接DNA形成杂交DNA双链后，再加入剪切酶，剪切酶特异性识别双链的特定位点，剪切桥接DNA成为两段，从发卡结构适配体中游离出来；剪切完毕后发卡结构适配体的碱基序列Ⅲ区域又裸露出来，再与体系中桥接DNA互补配对，剪切反应循环，体系中切断的桥接DNA在循环反应中随miRNA的增加而增加；酶切循环放大反应完毕，加热使酶失活；

（4）将表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒用活化剂活化羧基，加入与桥接DNA的3′端互补配对的-NH₂适配体Aptamer，反应完成用Tris-Ac清洗3遍，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；

（5）将步骤（3）中酶切循环反应的溶液加入步骤（4）中的适配体功能化磁性纳米颗粒中孵育，通过碱基互补配对形成捕获探针；

（6）将步骤（5）中的捕获探针与步骤（2）的金-PDA-银卫星结构的SERS标记混合，随着步骤（3）中miRNA的增加，切断的桥接DNA数目随之增加，切断的桥接DNA会封闭功能化磁性纳米颗粒上的适配体Aptamer，不会与SERS标记结合，磁分离之后上清液拉曼信号较强；而miRNA加入量较少时，完整的桥接DNA含量多，桥接DNA与功能化磁性纳米颗粒上适配体Aptamer互补配对后，桥接DNA上仍存在部分裸露的碱基序列，裸露的碱基序列会与SERS标记中PDA空位通过π-π共轭结合，磁分离后，上清液拉曼信号较低；

（7）根据miRNA浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对miRNA进行定量检测。

2.根据权利要求1所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的金纳米颗粒的平均粒径为70 nm～85 nm；

步骤（1）中所述的金纳米颗粒的溶液浓度为0.5～1.5 mmol/L；

步骤（2）中所述的银氨溶液为新制银氨溶液，浓度为1～20 mmol/L。

4.根据权利要求2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的发卡结构适配体序列为：

5′-AGCTATGCCAGCATCTTGCCTGCAAAAAAAATCCTCAGCAGGACCG-3′；

步骤（4）中所述的适配体Aptamer为适配体Aptamer S₁，其序列为：

5′-GCAGTTGTTTGCTTTTTTTTTT-(CH₂)₇-NH₂-3′。

5.根据权利要求1或2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的桥接DNA序列为：

5′-GCAAACAACTGCTGAGGATAAACG-3′；

步骤（3）中所述的剪切酶为Nb.BbvCI切刻内切酶。

6.根据权利要求1或2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的发卡结构适配体浓度为0.5～1.5 μmol/L；

步骤（3）中所述的桥接DNA的浓度为0.5～1.5 μmol/L；

步骤（3）中所述的不同浓度的miRNA标准样品液为0 mol、0.2 fM、0.4 fM、0.6 fM、0.8fM、1.0 fM、1.2 fM、1.4 fM、1.6 fM、1.8 fM、2.0 fM、2.2 fM、3 fM、5 fM以及10 fM，其中0mol为空白对照；

步骤（3）中所述的发卡结构适配体与miRNA标准样品液的体积比值为6～10。

7.根据权利要求1或2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（4）所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；

步骤（4）中所述的表面修饰有羧基的磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe₃O₄，其粒径为200～300 nm。

8.根据权利要求1或2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（6）中所述的捕获探针和金-PDA-银卫星结构的SERS标记体积混合比例为15：6～8。

9.根据权利要求1或2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（6）中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得：所述的显微拉曼光谱仪的操作条件为激发光源是波长为632.8 nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1 mW，信号收集时间为10～30 s。

10.根据权利要求1或2所述的基于双重放大SERS信号系统超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于：

步骤（7）中所述的信号是选取拉曼信号分子的特征拉曼谱峰1586 cm^-1作为定量峰，并以miRNA浓度对该谱峰光谱强度与硅片基底的特征峰520 cm^-1拉曼强度比值作图，并以此绘制标准曲线。