CN111812064B - 一种生物传感器及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生物传感器及制备方法和应用，本发明所述的生物传感器为包括金银核壳纳米颗粒‑含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体。其制备方法包括以下步骤：制备金银核壳纳米颗粒；制备含偶氮苯分子的四面体结构DNA；(3)组装金银核壳纳米颗粒‑含有偶氮苯分子的四面体DNA组装体。本发明的金银核壳纳米颗粒‑含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体的生物传感器，可在单纳米颗粒尺度上实现miR‑21的高灵敏度检测，而且miR‑21的浓度与金银核壳纳米颗粒‑含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体散射光谱的红移量呈线性关系，对早期癌症的诊断和预后治疗具有重要的意义。

Description

一种生物传感器及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物传感领域，具体涉及一种基于金银核壳纳米颗粒构建四面体DNA等离子体组装体检测miR-21的生物传感器及制备方法和使用方法。
背景技术
关于肿瘤的诊断，对其生物标志物(如：DNA、RNA或蛋白质)的检测灵敏度要比传统的分析方法高很多。MicroRNAs是一类长度在20-24个核苷酸的内源性非蛋白编码的RNAs。通常在早期发育，细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中起着非常重要的作用。MicroRNAs的异常表达发生在癌症前期的恶性肿瘤细胞中，与许多癌症(如：肺，肝细胞，大肠和乳腺癌等)相关。MicroRNA-21(miR-21)存在于上述许多人类的癌症组织中，尤其是肺鳞癌组织中表达水平是正常组织中的2倍之多，因此，MicroRNAs可以作为生物标志物用于早期癌症的诊断和预后治疗，发展一种高灵敏的分析方法跟踪检测MicroRNAs用于早期癌症诊断对于生物学和诊断学是至关重要的。
等离子激元是纳米光子学新兴的一个子领域，因为其在纳米尺度控制和操纵光的潜在应用而吸引了越来越多的关注。表面等离子共振是贵金属粒子表面和限制在纳米粒子表面上的入射光电子之间的相互作用，由于等离子共振的发生使得金属纳米颗粒具有优异的光学和物理性质，包括强吸收和散射光谱，光稳定性等。随着暗场显微镜的出现促进了对纳米颗粒等离子激元，特别是贵金属尺寸、形状、组成以及局部环境的影响的研究，这进一步促进其在生物标记和检测中的使用，同时基于纳米颗粒等离子共振性质使它们能够用作灵敏的传感器、功能性纳米探针、生物检测以及药物筛选。
目前检测miRNA的分析包括荧光分析法、电化学法和比色法等，其中前用于单分子水平检测miRNA的可行方法通常需要荧光分子作标记，但是荧光分子构建的生物传感器容易发生光漂白等现象且信噪比较低，颜色的微小区别难以通过肉眼识别等问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术荧光分子构建的生物传感器容易发生光漂白等现象且信噪比较低，颜色的微小区别难以通过肉眼识别等问题，本发明提供了一种生物传感器，该传感器是基于金银核壳-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体，可以快速、高灵敏地检测miR-21。本发明一种基于等离子体的生物传感器，使用绿色能源——光作为检测miRNA的开关，可以实现对miRNA环保、快速、灵敏的检测，避免上述问题的发生，且使用光能源进行控制，无污染。
本发明还提供所述生物传感器的制备方法和使用方法。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种生物传感器，所述生物传感器为金银核壳纳米颗粒(Au@AgNCs)-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA(tsDNA)组装体，所述组装体由金银核壳纳米颗粒和含有偶氮苯分子的四面体结构DNA(Au@Ag NCs-tsDNA)通过Ag-S键组装而成。
其中，所述含有偶氮苯分子的四面体DNA由四条DNA单链组成，所述四条DNA单链分别为A链、B链、C链及D链，所述A链44个碱基，B链55个碱基，C链55个碱基，D链55个碱基，且D链嵌入偶氮苯分子。
作为优选，所述A链、B链、C链、D链分别如序列SEQ ID NO.1-4所示，其中SEQ IDNO.4中的R为偶氮苯分子。
本发明所述的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备金银核壳纳米颗粒：采用种子生长法制备金种子，逐滴加入硝酸银进行反应，所获得的金银核壳纳米颗粒溶液；
(2)制备四面体DNA：将四条DNA单链混合于缓冲液中，变性，迅速降低温度并静置，即可获得所需的DNA四面体结构；
(3)组装金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体：将步骤(1)获得的金银核壳纳米颗粒溶液稀释，将其吸附固定在透明基底片上；然后将步骤(2)获得的四面体DNA按稀释，然后滴加到上述含金银核壳纳米颗粒透明基底片上，孵育，冲洗，吹干。
其中，步骤(1)所述硝酸银溶液的体积为500～600μL，浓度为0.01M。
其中，步骤(2)所述将四条DNA单链按等摩尔比混合于缓冲液中。
作为优选，步骤(3)中所述透明基底片为ITO玻璃、石英片、有机玻璃或者云母片。
其中，步骤(3)所述金银核壳纳米颗粒以1:100比例稀释，四面体DNA按1:1000-1000000的比例稀释，孵育为暗室下常温反应1-3h。
作为优选，本发明所述的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备金银核壳纳米颗粒：采用种子生长法制备直径约30nm的金种子，逐滴加入硝酸银进行反应，所获得的金银核壳纳米颗粒溶液，其中的金银核壳纳米颗粒的粒径大小为50nm；
(2)制备四面体DNA：使用TM buffer(20mM Tris+50mM MgCl2)作为缓冲溶液，通过紫外可见光分光光度仪精确定量DNA单链，然后将四条DNA单链按1:1:1:1的摩尔比例混合于TM Buffer中，其中每条单链的浓度为1μM；通过PCR仪中设定的95℃变性10分钟，迅速降低至4℃并静置8min，即可获得所需的DNA四面体结构，浓度为1μmol/L；
(3)组装金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体：将步骤(1)获得的金银核壳纳米颗粒以1:100比例稀释后，取200μL滴加至ITO玻璃片上，约1min之后用超纯水冲洗并用氮气吹干；然后将步骤(2)获得的四面体DNA按1:1000000的比例稀释，取200μL浓度为1pM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上，孵育3h，用超纯水冲洗并用氮气吹干，得到固定于ITO表面的金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体。
本发明所述的生物生物传感器在制备检测miR-21的工具中的应用。
进一步地，所述应用的具体过程为：
(a)选取与四面体DNA结构中D链碱基互补配对的miR-21；
(b)将步骤(a)中的miR-21滴加至金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体上进行反应；
(c)暗场显微镜下观察组装体等离子散射光谱的红移量，将miR-21浓度对散射光谱红移量作线性相关分析，得到miR-21浓度与散射光谱红移量的线性相关图；
(d)将步骤(b)合成的组装体通过365nm波长的光照射，观察等离子体散射光谱的移动情况；在此基础上再经过555nm波长的光照射观察等离子体散射光谱的移动情况。
作为优选，所述应用的具体过程为：
(a)选取与四面体DNA结构中D链碱基互补配对的miR-21，且稀释浓度为1pM；
(b)将步骤(a)中的miR-21滴加至金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体上反应3h；
(c)暗场显微镜下观察组装体等离子散射光谱的红移量，将miR-21浓度对散射光谱红移量作线性相关分析，得到miR-21浓度与散射光谱红移量的线性相关图；
(d)将步骤(b)合成的组装体通过365nm波长的光照射0.5h后，观察等离子体散射光谱的移动情况；在此基础上再经过555nm波长的光照射2h后观察等离子体散射光谱的移动情况。
本发明的生物传感器检测miR-21的原理：含有偶氮苯分子的D链DNA，在自然状态下，插入DNA链中的偶氮苯分子为反式结构，在室温下，能够与目标链miR-21反应，进而导致组装体等离子散射光谱发生一定程度的红移。在波长为365nm的光照射后，由于偶氮苯分子的结构发生异构，由反式结构变为顺式结构，从而影响了DNA链的互补配对，使得miR-21从四面体DNA结构中解链，进而导致组装体等离子散射光谱发生蓝移。再经过555nm的光照射后，偶氮苯分子的结构又变为反式结构，又能与miR-21反应，进而导致组装体等离子散射光谱再次发生红移。经过不同波长光照射后，构建可应用于检测miR-21的生物传感器，并实现生物传感器的光控存储。
本发明利用偶氮苯分子在不同波长光照下顺反异构性质，将偶氮苯修饰到DNA序列和目标物靶分子miR-21序列中，通过采用四面体结构的DNA分子(tsDNA)作为支架，将tsDNA修饰到Au@AgNCs，构建“自上而下”的生物传感器，在纳米尺度内，通过改变光照，来控制tsDNA与miR-21碱基互补配对，从而导致组装体等离子散射光谱发生不同程度的移动，且目标物靶分子miR-21浓度与光谱红移量呈线性相关性，从而构建可应用于检测miR-21的生物传感器(本发明的具体检测过程原理如图1所示)，对许多癌症及时发现诊断具有重要意义。
本发明是基于贵金属纳米颗粒构建的四面体结构DNA生物传感器，通过不同波长的光实现对miRNA-21的检测控制，达到了miRNA-21检测无污染、绿色环保、实时的目的。采用光开关技术是一种新颖的检测驱动方式，利用不同波长的光代表输入与输出，在单个纳米颗粒上研究光致异构化过程，对于开发纳米尺寸的“读写”存储设备具有重要意义。具体的，本发明采用不同波长的光照射生物传感器可以控制其对miRNA-21的检测，365nm的紫外光时，嵌入在DNA链中的偶氮苯分子发生光致异构化，从而促使miRNA-21从生物传感器中解链；接着采用555nm的可见光照射时，偶氮苯分子再次发生光致异构化，使得miRNA-21重新被生物传感器识别上，实现光开关。
本发明中由于贵金属纳米颗粒独特的尺寸、形貌、组分和微环境依赖的光学性质，使得等离子体在化学和生物传感领域可以广泛应用，制备的传感器基于贵金属纳米颗粒(如金、银纳米颗粒)的局域表面等离子体共振(LSPR)特性，通过颗粒的LSPR峰的移动作为检测信号。LSPR传感器可用于测量金属纳米颗粒表面的分子间相互作用，并且从单个金属纳米颗粒获得的信号可以提供更加详细的信息。
有益效果：与现有技术比，本发明具有如下优点：
本发明的金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体的生物传感器，可在单纳米颗粒尺度上实现miR-21的高灵敏度检测，而且miR-21的浓度与金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体散射光谱的红移量呈线性关系，对早期癌症的诊断和预后治疗具有重要的意义。
本发明制备了一种基于金银核壳纳米立方体的等离子体生物传感器用于靶分子miRNA-21的检测，可以实现无污染、快速、绿色环保的检测，并且制备简单快速。利用四面体纳米结构的优势，将四面体结构DNA作为支架用来构建生物传感器，更易与靶分子miRNA-21相结合，可以提高检测效率。并且该生物传感器与传统的生物传感器相比，检测灵敏度可提高至1fM，并且靶分子miRNA-21的浓度与生物传感器的LSPR散射峰呈线性相关。并且采用不同波长的光照控制miRNA-21的检测，将不同波长的光代表输入与输出，可以对于开发纳米尺寸的“读写”存储设备具有重要意义。
附图说明
图1是本发明生物传感器的原理示意图；
图2是本发明金银核壳纳米颗粒的TEM图；
图3是本发明DNA四面体结构聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图；
图4是本发明实施例中miR-21浓度与组装体散射光谱红移量的线性相关图；
图5为金银核壳纳米颗粒与1pM的四面体DNA结合形成组装体，然后与1pM的miRNA-21反应时，采用365nm的激发光和555nm的激发光前后照射后，组装体的散射光谱峰位移图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
按照如下步骤制备金银核壳-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体生物传感器：
(1)制备金银核壳纳米颗粒
取硼氢化钠还原制备3nm金种子，利用种子生长法将3nm金种长大到30nm金球，逐滴加入0.01M的硝酸银溶液，测得紫外光谱为505nm，获得大小为50nm的金银核壳纳米颗粒(Au@AgNCs)。
具体过程如下：
a、制备约3nm GNPs
选取干净的已处理过的20mL玻璃瓶作为反应瓶。将洗净的磁子放入反应瓶中，确保整个反应装置处于搅拌的正中间。然后向反应瓶中加入0.1M CTAB(水溶液，aqueous:aq)10mL和0.01M HAuCl4(aq)0.25mL，在加样的过程中，通过磁力搅拌器搅拌，使溶液均匀混合。然后向混合溶液中快速加入现配的冰水浴后0.01M的NaBH4(aq)0.6mL。溶液颜色瞬间由无色变为茶褐色。将所得溶液放入恒温水浴锅中，温度控制在30℃并反应2h，得到3nm的金种溶液。
b、制备约10nm GNPs
选取干净的已处理过的20mL玻璃瓶作为反应瓶。将洗净的磁子放入反应瓶中，确保整个反应装置处于搅拌的正中间。然后向反应瓶中加入0.1M CTAC(aq)6mL和5mM HAuCl4(aq)6mL，在加样的过程中，通过磁力搅拌器搅拌，使溶液均匀混合。接着向混合溶液中加入0.01M的抗坏血酸AA(aq)3mL，然后加入0.3mL稀释5倍的上述所制的金种溶液。在搅拌过程中溶液由无色逐渐变为红色。将所得溶液放入恒温水浴锅中，温度控制在36℃反应2h，得到10nm的金种溶液。
c、制备约30nm GNPs
选取干净的已处理过的25mL玻璃瓶作为反应瓶。将洗净的磁子放入反应瓶中，确保整个反应装置处于搅拌的正中间。然后向反应瓶中加入0.1M CTAC(aq)8mL和5mM HAuCl4(aq)8mL，在加样时，通过磁力搅拌器搅拌，使溶液均匀混合。接着向混合溶液中加入0.01M的AA(aq)3mL，然后加入1mL的10nm金种溶液。在搅拌过程中溶液由无色逐渐变为紫红色。将所得溶液放入恒温水浴锅中，温度控制在36℃反应2h，得到30nm的金种溶液。
d、Au@Ag纳米颗粒的制备
选取干净的已处理过的20mL玻璃瓶作为反应瓶。将洗净的磁子放入反应瓶中，确保整个反应装置处于搅拌的正中间。将0.1M的CTAC(aq)7mL、0.01M的AA(aq)3mL、3mL配制完成的30nm金球溶液依次加入反应瓶中，加样的过程中，通过磁力搅拌器搅拌，使溶液均匀混合。再置于60℃恒温水浴锅，然后采用注射泵在10分钟内匀速将0.1M的AgNO3(aq)0.6mL加入到反应瓶中，搅拌均匀后取出磁子并在恒温60℃反应4h，溶液颜色由淡红色变为橙黄色，得到初步合成的金银核壳纳米颗粒(Au@Ag NCs)。
待初步合成完金银核壳纳米颗粒后，接着进行提纯，包括三次离心处理，离心具体操作如下：
首先将得到的Au@Ag NCs以1000r/min低速离心约8min，主要目的是除掉大颗粒杂质，离心结束后取上清液，然后以5000r/min高速离心8min，除掉多余的表面活性剂，取下层沉淀后再加入7ml左右的超纯水。接着以4800r/min高速离心8min后得到下层沉淀，加0.5mL超纯水溶解稀释。最后密封避光保存在4℃冰箱中待用。图2是制备完成的金银核壳纳米颗粒TEM图，图2说明合成的金银核壳纳米颗粒形貌规整均一，可以为生物传感器的制备提供较好的材料
(2)制备四面体DNA：设计四条DNA序列，在TakaRa生物公司合成如下所示的四条单链：(序列表表中的碱基序列未标出修饰基团，以表格中为准)
Figure BDA0002520276130000071
其中，D链嵌入偶氮苯分子R，具体嵌入过程参考文献(Kou B,Guo X,Xiao S-J,etal.Highly Efficient Room-Temperature Photoresponsive DNA Tethering Azobenzenethrough Backbone-Inserted Glycerol Via Ether Bond[J].Small,2013,9(23):3939-3943.)。
miR-21的RNA序列(SEQ ID NO.5)为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
使用TM buffer(20mM Tris+50mM MgCl2)作为缓冲溶液，通过紫外可见光分光光度仪精确定量DNA单链，然后将四条DNA单链按1:1:1:1的摩尔比例混合于TM Buffer中，其中每条单链在缓冲溶液中的浓度为1μM；通过PCR仪中设定的95℃变性10分钟，迅速降低至4℃并静置8min，即可获得所需的DNA四面体结构(tsDNA)，浓度为1μmol/L。
同时采用上述方法分别将A链与B链双链结合样品、A链、B链以及C链三条链结合样品以及AC，AD，BC，BD，CD，ACD，BCD，ABD多种组合方式，将合成好的DNA四面体结构、双链结合样品、三链结合样品，以及单独的A链、B链、C链，使用8％的聚丙烯酞胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)进行结构的表征。
如图3所示，本实施例制备的DNA四面体电泳条带，该结构成功组装。
(3)组装形成金银核壳-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体
将步骤(1)获得的金银核壳纳米颗粒以1:100比例稀释后(取50μL的金银核壳纳米颗粒溶液，加入到5mL的超纯水水中)，取200μL滴加至ITO玻璃片上，约1min之后用超纯水冲洗并用氮气吹干；然后将步骤(2)获得的四面体DNA按1:1000000的比例稀释(具体取1μL的制备好的浓度为1μM的四面体DNA，加入到1mL超纯水中，此时四面体DNA的浓度为1nM；接着继续取1μL的浓度为1nM的四面体DNA，加入到1mL超纯水中，此时四面体DNA的浓度为1pM)，取200μL浓度为1pM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上，暗室下温室孵育3h，用超纯水冲洗并用氮气吹干，得到固定于ITO表面的金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体。
实施例2
本实施例与实施例1的制备方法相同，不同的是：
步骤(3)中四面体DNA按1:100000的比例稀释，取200μL浓度为10pM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上。
实施例3
本实施例与实施例1的制备方法相同，不同的是：
步骤(3)中四面体DNA按1:10000的比例稀释，取200μL浓度为100pM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上。
实施例4
本实施例与实施例1的制备方法相同，不同的是：
步骤(3)中四面体DNA按1:1000的比例稀释，取200μL浓度为1nM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上。
实施例5
本实施例与实施例1的制备方法相同，不同的是：
步骤(3)中取200μL浓度为1pM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上，孵育2h。
实施例6
本实施例与实施例1的制备方法相同，不同的是：
步骤(3)中取200μL浓度为1pM的四面体DNA滴加至固定在ITO表面的金银核壳纳米颗粒上，孵育1h。
实施例7
实施例7与实施例1的制备方法相同，不同的是：步骤(3)中透明基底片为石英片。
实施例8
实施例8与实施例1的制备方法相同，不同的是：步骤(3)中透明基底片为有机玻璃。
实施例9
实施例9与实施例1的制备方法相同，不同的是：步骤(3)中透明基底片为云母片。
实施例10
实施例1～6制备的金银核壳-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体的结构相同，作为生物传感器用于检测miR-21，具体步骤如下：
(a)选取与四面体DNA结构中D链碱基互补配对的miR-21，且稀释浓度为1pM；
(b)将步骤(a)中的miR-21取200μL滴加至金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体上暗室室温反应3h，形成Au@Ag NCs-tsDNA-miRNA-21组装体；
(c)暗场显微镜下观察组装体等离子散射光谱的红移量，将miR-21浓度对散射光谱红移量作线性相关分析，得到miR-21浓度与散射光谱红移量的线性相关图，其结果如4和表1所示。其中，图4中为不同miR-21浓度(100、101、102、103、104fM)与实施例1制备的组装体(生物传感器)散射光谱红移量的线性相关图。
表1为不同miR-21浓度配比及性能参数
Figure BDA0002520276130000091
表1中Au@Ag NCs-tsDNA散射波长表示金银核壳连上tsDNA后散射光谱的移动量，由于tsDNA和Au@Ag NCs的浓度是不变的，所以散射波长一直是550nm，第二个是Au@Ag NCs-tsDNA加上miRNA-21后散射光谱的移动量，由于miRNA-21的浓度是变化的，所以散射光谱移动有变化。
由表1可知，本发明实施例所获得的金银核壳-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体结构一致，加入miR-21后组装体散射光谱会发生明显的红移现象，红移量在暗场显微镜下能够明显地看出颗粒颜色的变化，且miR-21浓度与散射光谱红移量呈线性关系，实现了肉眼可测的miR-21检测。
图4中的第一个图表明是构建的Au@Ag NCs-tsDNA对不同浓度的miRNA-21具有识别性，根据浓度不同，其散射光谱移动量也有所不同，第二个图是根据不同浓度对应不同的光谱红移量做出的一个线性拟合图，表明miRNA-21的浓度和光谱红移量存在线性相关的关系。
由表1和图4可知，本发明制备的生物传感器，可以有效识别检测不同浓度的miRNA-21，并且检测限低，有高灵敏度、高特异性、检测范围广、实时、快捷等优点。
(d)将步骤(b)合成的组装体通过365nm波长的光照射0.5h后，观察等离子体散射光谱的移动情况；在此基础上再经过555nm波长的光照射2h后观察等离子体散射光谱的移动情况。
实施例1制备的传感器在原始状态下，在ITO玻璃片上固定Au@Ag NCs，通过Ag-S键的作用组装上tsDNA分子，在自然状态下，步骤(b)实现Au@Ag NCs-tsDNA与miRNA-21的碱基互补配对，形成Au@Ag NCs-tsDNA-miRNA-21组装体。此时Au@Ag NCs的LSPR散射峰为576nm。
采用365nm的紫外激发光对步骤(b)形成的Au@Ag NCs-tsDNA-miRNA-21组装体照射30分钟，照射结束后，测定Au@Ag NCs的LSPR散射峰为568nm，颗粒的LSPR散射光谱蓝移，移动量为6nm；接着采用555nm的白光照射Au@Ag NCs-tsDNA-miRNA-21组装体2小时，待光照结束后，测定Au@Ag NCs的LSPR散射峰为580nm，颗粒的LSPR散射峰红移12nm；结果如图5和表2所示。
表2为不同光照下组装体散射光谱的移动量
Figure BDA0002520276130000101
上述实验表明Au@Ag NCs-tsDNA在结合上miRNA-21前后，散射光谱的移动量，紫外光照后，miRNA-21从组装体中解链下来，即散射光谱发生蓝移说明紫外光实现对miRNA-21的解链控制，同时散射光谱会发生蓝移说明miRNA-21已经成功被检测了。说明本发明制备的生物传感器不仅具备常规生物传感器的优点(实时、快捷、高灵敏、高特异性识别)，同时还具有光开关性质，通过不同波长光照实现对检测物的识别控制。
此外，图4、5表明了制备的生物传感器具有光控检测的性质，可以用于开发“读写”设备，可将365nm的紫外光作为“0”，555nm的可见光作为“1”，模拟计算机二进制中的运算，从而实现对“0”和“1”的运算，实现“读写”存储设备的意义。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种生物传感器及制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctgaaacat tacagcttgc tacacgagaa gagccgccat agta 44
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcagatcra crtcrgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims (8)

1.一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器为金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体，所述组装体由金银核壳纳米颗粒和含有偶氮苯分子的四面体结构DNA通过Ag-S键组装而成；所述含有偶氮苯分子的四面体DNA由四条DNA单链组成，所述四条DNA单链分别为A链、B链、C链及D链，所述A链44个碱基，B链55个碱基，C链55个碱基，D链55个碱基，且D链嵌入偶氮苯分子；所述A链、B链、C链、D链分别如序列SEQ ID NO.1-4所示，其中SEQ ID NO.4中的R为偶氮苯分子。
2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备金银核壳纳米颗粒：采用种子生长法制备金种子，逐滴加入硝酸银进行反应，得到金银核壳纳米颗粒溶液；
（2）制备四面体DNA：将四条DNA单链混合于缓冲液中，变性，迅速降低温度并静置，即可获得所需的DNA四面体结构；
（3）组装金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体：将步骤（1）获得的金银核壳纳米颗粒溶液稀释，将其吸附固定在透明基底片上；然后将步骤（2）获得的四面体DNA按稀释，然后滴加到含金银核壳纳米颗粒透明基底片上，孵育，冲洗，吹干。
3.根据权利要求2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述硝酸银溶液的体积为500～600μL，浓度为0.01M。
4.根据权利要求2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述将四条DNA单链按等摩尔比混合于缓冲液中。
5.根据权利要求2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述透明基底片为ITO玻璃、石英片、有机玻璃或者云母片。
6.根据权利要求2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述金银核壳纳米颗粒以1:100比例稀释，四面体DNA按1:1000-1000000的比例稀释，孵育为暗室下常温反应1-3h。
7.一种权利要求1所述的生物传感器在制备检测miR-21的工具中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体过程为：
（a）选取与四面体DNA结构中D链碱基互补配对的miR-21；
（b）将步骤（a）中的miR-21滴加至金银核壳纳米颗粒-含有偶氮苯分子的四面体结构DNA组装体上进行反应；
（c）暗场显微镜下观察组装体等离子散射光谱的红移量，将miR-21浓度对散射光谱红移量作线性相关分析，得到miR-21浓度与散射光谱红移量的线性相关图；
（d）将步骤（b）合成的组装体通过365nm波长的光照射，观察等离子体散射光谱的移动情况；在此基础上再经过555nm波长的光照射观察等离子体散射光谱的移动情况。
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