CN112033949B - 一种水产品腐败菌的sers生物传感器快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于水产品检测技术领域的一种水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，该方法基于金属有机框架MOFs基底的SERS增强因子可高达到106，检出限低至10‑8M，这归功于MOFs材料的孔隙结构优化、表面改性、电荷转移、带间和分子共振以及基态电荷传递相互作用；同时由手性双金属纳米材料中两个金属具有协同作用，因此通过合成手性双金属Fe3O4‑AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)‑1/Fe3O4‑AuNPs复合材料，获得高增强的SERS活性基底，将双链DNA修饰其上，得到SERS生物传感器；即可用于腐败菌的高灵敏检测。

Description

一种水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法
技术领域
本发明属于水产品检测技术领域，特别涉及一种水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，具体涉及一种水产品储运过程中的腐败菌的SERS纳米生物传感器快速检测方法。
背景技术
水产品因具有高水分、高蛋白等特点，在贮运过程中极易受到腐败菌微生物侵染而发生腐败变质。水产品中优势腐败菌种类一般与水产品类别有关，不同类别之间存在较大差异，因此仅依靠传统培养鉴定微生物的方法对于大批量研究水产品优势腐败菌并不合理。所以，对水产品特定腐败菌的现场快速检测技术研究显得尤为必要。这不仅能为水产品中优势菌的研究提供技术支持，也能提高水产品优势腐败菌研究的效率，不仅具有重要的理论意义和实际价值，还具有潜在的经济效益。目前常规的腐败菌检测方法主要有传统微生物培养法、分子生物学鉴定法、仪器分析技术和免疫学分析技术等。利用上述传统检测技术检测腐败菌结果准确、技术成熟，但是存在以下缺陷：检测分析时间长、样品前处理复杂和满足不了现场快速检测要求等。
中国专利202010131767.3公开了基于仿生纳米微结构芯片、内毒素毒SERS定量检测系统、方法及应用，其仿生纳米微结构芯片是将蝉翅作为仿生SERS模板，在其表面溅射金膜作为SERS基底，以载玻片为衬底粘贴具有阵列小孔的亚历克板形成的阵列式三维SERS纳米仿生基底，对位并键合在基底上的PDMS打孔层，由阵列小孔和对应的PDMS.打孔层上的孔共同形成的阵列孔就形成阵列式微米培养腔，溅射有金膜的蝉翅粘贴在每个微米培养腔内。其在阵列式三维SERS芯片中合金属纳米粒子与适配体修饰的复合式SERS标签，解决内毒素本身拉曼信号较弱的缺陷，建立内毒素快速高效检测系统与方法，可实现注射液等生物制剂中内毒素的快速定量检测，也可应用于监测细菌与抗菌药物作用后内毒素含量的变化。
专利号为200680025731.5公开了表面增强的光谱法、挠性结构化基底及其制备方法；本发明涉及挠性聚合物基底(100),其用于表面增强拉曼光谱(SERS)和表面等离子体激元谐振(SPR)的测定。所述基底包括聚合物膜(125),其中纳米结构化部件(152)被压花在一个表面上,并被镀金属层(130)覆盖,所述镀金属层(130)由金、银等制得；从而提供SERS活性表面。本发明还包括DNA感测的应用。上述专利均在表面增强拉曼光谱(SERS)表面被镀金属层(金、银)覆盖,从而提供SERS活性表面。但是SERS表面被镀金属层材料的孔隙结构并没有得到优化；仍然存在SERS生物传感器使用一个拉曼信号来定量分析目标，由于其不可控的环境因素限制了SERS生物传感器检测的可靠性。-
人们熟知的表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)具有诸多优点，例如可作为分子的指纹光谱进行无标检测，其超高的灵敏度可以实现单分子检测，窄峰宽可实现多元检测等，在生物传感器上有着广泛的应用，但是仍然存在SERS生物传感器使用一个拉曼信号来定量分析目标，由于其不可控的环境因素限制了SERS生物传感器检测的可靠性。为了解决SERS生物传感器用于检测的可靠性问题，在SERS检测中引入比值法，即比率型SERS生物传感方法，以减少背景干扰，显著提高其SERS生物传感器的可靠性和稳定性。
基于金属有机框架(MOFs)基底的SERS增强因子可高达到106，检出限低至10-8M，这归功于MOFs材料的孔隙结构优化、表面改性、电荷转移、带间和分子共振以及基态电荷传递相互作用。由手性双金属纳米材料所构成的多级结构中两个金属具有协同作用，将体现出来更好的表面结构性能。高曲率纳米颗粒(NPs)及颗粒之间狭小的纳米间隙能产生大量的SERS热点。磁性金属纳米材料Fe3O4磁化后能得到定向有序排列的结构间隙，也就能产生大量的SERS热点。因此，本发明通过合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，这样获得的是均匀、可重复、大面积、高增强的SERS活性基底，将双链DNA修饰其上，即可用于腐败菌的高灵敏检测。以解决现有检测技术过程繁琐、成本高昂、耗时长、便携性差、不利于现场检测等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，其特征在于，基于金属有机框架(MOFs)基底的SERS增强因子可高达到106，检出限低至10-8M，这归功于MOFs材料的孔隙结构优化、表面改性、电荷转移、带间和分子共振以及基态电荷传递相互作用；同时由手性双金属纳米材料所构成的多级结构中两个金属具有协同作用，将体现出来更好的表面结构性能；因此通过合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，获得均匀、可重复、大面积、高增强的SERS活性基底，将双链DNA修饰其上，得到SERS生物传感器；即可用于腐败菌的高灵敏检测；具体包括以下步骤：
(1)合成二维金属有机框架纳米片Cu(HBTC)-1；
(2)合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，并通过表征分析其性能后，用作SERS活性基底；
(3)针对不同种类的腐败菌，配置不同浓度的腐败菌样品溶液作为待测液；
(4)将双链DNA修饰在步骤(2)中的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的SERS活性基底上，得到SERS生物传感器；对待测液进行测试，获得待测液的SERS光谱数据；以Cy5的拉曼强度Icy5为内标信号，ROX的拉曼强度IROX为检测信号，取两者比值
Figure BDA0002667519350000041
得到腐败菌样品的SERS比率信号；
(5)建立标准腐败菌样品的SERS光谱数据与浓度之间的线性回归模型；
(6)将步骤(4)中测试过的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料进行冲洗、干燥、磁化后将双链DNA重构并修饰其上，得到SERS生物传感器；
(7)用步骤(6)经过重建的SERS生物传感器，对步骤(3)中的某一种腐败菌样品再进行测试，依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(8)采集鲜活水产品表面黏液获取含有腐败菌的待测液，用磁化后的SERS活性基底的SERS生物传感器进行测试；依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(9)根据上述测试建模结果，对SERS生物传感器检测方法进行评估和性能优化。
所述腐败菌为水产品特定腐败菌(SSO)，其中淡水环境中主要包括黄绿假单胞菌、杆菌、棒状杆菌、黄杆菌、芽孢杆菌和沙雷氏菌；海水产品含有的腐败菌主要为假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、弧菌和肠杆菌。
所述采集鲜活水产品表面黏液，经过基于免疫磁分离技术预处理后，得到分离和富集的水产品特定腐败菌的溶液，该特定腐败菌的溶液作为待测液。
所述使用比率型SERS纳米生物传感器对腐败菌的快速检测，将合成和表征后的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料用作SERS活性基底，将双链dsDNAⅠ固定在SERS活性基底表面，形成双链体系；双链dsDNAⅠ由核酸适配体和其互补链cDNA组成；互补链cDNA被分成两条不连续的片段，末端分别修饰两种不同的信标分子：DNA-C1修饰了5’-Cy5；DNA-C2修饰了3’-ROX；其中，以Cy5的拉曼强度Icy5为内标信号，ROX的拉曼强度IROX为检测信号，DNA-C1通过Au-S键共价修饰在SERS活性基底上；当腐败菌存在时，核酸适配体和腐败菌结合形成复合物导致DNA-C2从双链体系中解离，使得ROX远离基底表面因而产生减弱的检测信号，与此同时，通过杂交新的核酸适配体，刚性的dsDNAⅡ得以重新构建，恢复Cy5与基底表面之间的距离，并使得内标信号保持不变；由此得到内标信号与检测信号X的比率信号，即为内标信号与检测信号的比值
Figure BDA0002667519350000051
该比率信号与腐败菌的浓度具有良好的线性关系，通过建立一元线性回归模型，可用于腐败菌的定量检测。
本发明有益效果是本发明通过合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，因此获得均匀、可重复、大面积、高增强的SERS活性基底，将双链DNA修饰其上，即可用于腐败菌的高灵敏检测。其次，在SERS检测中引入比值法，即比率型SERS生物传感方法，以减少背景干扰，显著提高其SERS生物传感器的可靠性和稳定性。本发明实现了对水产品特定腐败菌的快速精确检测，有潜力应用于水产品储运过程的现场检测。
附图说明
图1为水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测的流程图。
图2为使用比率型SERS纳米生物传感对腐败菌的检测示意图。
图3为信标分子Cy5和ROX的SERS光谱图
具体实施方式
本发明提供一种水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，基于金属有机框架(MOFs)基底的SERS增强因子可高达到106，检出限低至10-8M，这归功于MOFs材料的孔隙结构优化、表面改性、电荷转移、带间和分子共振以及基态电荷传递相互作用；同时由手性双金属纳米材料所构成的多级结构中两个金属具有协同作用，将体现出来更好的表面结构性能；因此通过合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，获得均匀、可重复、大面积、高增强的SERS活性基底，将双链DNA修饰其上，即可用于腐败菌的高灵敏检测；如图1水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测的流程图所示，具体包括以下步骤：
(1)合成二维金属有机框架纳米片Cu(HBTC)-1；
(2)合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，并通过表征分析其性能后，用作SERS活性基底；
(3)针对不同种类的腐败菌，配置不同浓度的腐败菌样品溶液作为待测液；
(4)将双链DNA修饰在步骤(2)中的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的SERS活性基底上，得到SERS生物传感器；对待测液进行测试，获得待测液的SERS光谱数据；以Cy5的拉曼强度Icy5为内标信号，ROX的拉曼强度IROX为检测信号，取两者比值
Figure BDA0002667519350000071
得到腐败菌样品的SERS比率信号；
(5)建立标准腐败菌样品的SERS光谱数据与浓度之间的线性回归模型；
(6)将步骤(4)中测试过的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料进行冲洗、干燥、磁化后将双链DNA重构并修饰其上，得到SERS生物传感器；
(7)用步骤(6)经过重建的SERS生物传感器，对步骤(3)中的某一种腐败菌样品再进行测试，依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(8)采集鲜活水产品表面黏液获取含有腐败菌的待测液，用磁化后的SERS活性基底的SERS生物传感器进行测试；依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(9)根据上述测试建模结果，对SERS生物传感器检测方法进行评估和性能优化。
列举实施例来说明如下；
实施例一,SERS生物传感器构建。
(1)二维金属有机框架纳米片Cu(HBTC)-1的合成
向40mL的高纯水中加入氯化铜分析纯CuCl2·2H2O(0.1mmol)和0.1g的聚乙烯吡咯烷酮PVP，搅拌5min后，逐滴加入2.5mL的NaOH(0.2M)，搅拌5min后，再逐滴加入2.5mL的新鲜配置的抗坏血酸(0.1M)，继续搅拌5min，此时得到的产物为黄色的立方Cu2O纳米颗粒。随后，通过离心分离收集固体，用乙醇清洗2次后，将固体重新分散在10mL的乙醇溶液中(此时Cu的浓度约为10mM)。再称取0.4g的PVP溶于60mL高纯水中，加入0.2g的1,3,5-均苯三甲酸H3BTC(溶于4mL乙醇中)，白色混合物搅拌5min后，加入10mL上述制备的立方Cu2O乙醇分散液，1min内混合物变为透明颜色。继续搅拌2h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成了Cu(HBTC)-1)，混合液继续在室温下搅拌14h后，通过离心分离收集固体产物，用乙醇和水分别清洗两次，室温下真空干燥，得到浅蓝色粉末，置于干燥条件下保存。
(2)手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的合成
取上述实施例中的浅蓝色粉末，超声分散，形成Cu(HBTC)-1水分散液(1.30mg/mL)。取10mL的Cu(HBTC)-1水分散液，加入336μL的氯金酸分析纯HAuCl4·3H2O(0.01M)，室温下混合搅拌20min后，加入40μL新鲜配置的硼氢化钠分析纯NaBH4(0.13M)，混合液瞬间变紫红色，搅拌15s后，产物离心分离后用高纯水清洗两次，得到的固体产物再加入10mL高纯水超声分散均匀，此时得到的产物为Cu(HBTC)-1/Au纳米片分散液，浓度约为1.30mg/mL。取Cu(HBTC)-1/Au分散液10mL，在搅拌条件下，通氮气曝气以除去溶液中的氧气，30min后分别加入504μL的FeCl3(0.01M)和336μL的FeCl2(0.01M)。混合液在通氮气的条件下加热搅拌至60℃。随后，向混合液中缓慢滴加NaOH，将混合液pH调至11-12，溶液变黑。把所得的溶液平均分成四份，转移到四个反应瓶中。把反应瓶放置到一个加热到80℃的水浴槽中的不同区域，两个南北极相对的钕-铁-硼磁铁、紧贴在水浴槽外的两端来产生外加磁场。反应4小时后,四个反应瓶里面均有黑色沉淀生成，用磁铁分别收集反应瓶里面的黑色沉淀产物，先后用去离子水洗涤产物若干次后在真空干燥箱中干燥,然后进行下一步的表征。
(3)Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的表征
Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的结构表征采用X射线衍射仪(XRD)，其成分表征采用X射线光电子能谱法，其形貌表征采用扫描电子显微镜(SEM)，其磁性能表征采用多功能磁测量仪。
(4)基于核酸适配体的双链DNA在Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料上的修饰
合成和表征后的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料用作SERS活性基底，将三条单链DNA(DNA-C1(5’-Cy5，3’-SH)，DNA-C2(3’-ROX)，适配体)组装成双链DNA，通过Au-S键和碱基互补配对原则修饰到SERS活性基底表面，制备得到基于核酸适配体的SERS生物传感器；具体实验操作如下：
(1)将10μLDNA-C1与10μL适配体在相同浓度(10μM)下混合(缓冲液体系包含10mMTris-HCl，100mM KCl和1mM MgCl2)，并置于600μL离心管中，于37℃下振荡孵育16h。
(2)向(1)中的离心管中加入20μL DNA-C2(5μM)并混合，于37℃下继续振荡孵育16h；此时，三条单链DNA杂交形成双链dsDNAⅠ。
(3)将0.5cm×0.5cm的SERS活性基底放入离心管中，并加入200μL用10mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)稀释的dsDNAⅠ(终浓度为200nM)，使DNA溶液完全浸没SERS活性基底，于25℃下振荡孵育16h。
(4)向(3)中的离心管中加入NaCl老化，使得DNA末端的巯基与金纳米颗粒表面反应，形成共价的Au-S键。老化过程分5次缓慢加入NaCl溶液，每间隔2h加一次，每次加入1.1μL的NaCl溶液(1M)。五次加盐过程结束后，于25℃下继续振荡孵育12h以充分老化。
(5)将修饰好双链DNA的SERS活性基底用去离子水洗净，去除游离的盐离子和DNA。然后将该SERS活性基底放入10μM巯基乙醇中反应10min。该步骤是为了阻止裸露的金纳米颗粒表面吸附游离的DNA，避免非特异的信号干扰。
(6)将制备好的SERS传感器用去离子水清洗三遍，再用氮气吹干表面剩余的液体，放置备用。
实施例二比率型SERS生物传感器对水产品腐败菌快速检测方法流程。
(1)合成二维金属有机框架纳米片Cu(HBTC)-1；
(2)合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，并通过表征分析其性能后，用作SERS活性基底；
(3)针对不同种类的腐败菌，配置不同浓度的腐败菌样品溶液作为待测液；
(4)将双链DNA修饰在步骤(2)中的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的SERS活性基底上，得到SERS生物传感器；对待测液进行测试，获得待测液的SERS光谱数据；以Cy5的拉曼强度Icy5为内标信号，ROX的拉曼强度IROX为检测信号，取两者比值
Figure BDA0002667519350000101
得到腐败菌样品的SERS比率信号；
(5)建立标准腐败菌样品的SERS光谱数据与浓度之间的线性回归模型；
(6)将步骤(4)中测试过的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料进行冲洗、干燥、磁化后将双链DNA重构并修饰其上，得到SERS生物传感器；
(7)用步骤(6)经过重建的SERS生物传感器，对步骤(3)中的某一种腐败菌样品再进行测试，依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(8)采集鲜活水产品表面黏液获取含有腐败菌的待测液，用磁化后的SERS活性基底的SERS生物传感器进行测试；依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(9)根据上述测试建模结果，对SERS生物传感器检测方法进行评估和性能优化。
所述SERS生物传感器对腐败菌的检测流程如下：
如图所示，合成和表征后的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料用作SERS活性基底，将双链DNA(dsDNAⅠ)固定在SERS活性基底表面，形成双链体系。dsDNAⅠ由核酸适配体(以下简称适配体)和其互补链DNA(cDNA)组成的，cDNA被分成两条不连续的片段，末端分别修饰两种不同的信标分子(DNA-C1修饰了5’-Cy5(花青染料)，DNA-C2修饰了3’-ROX(3’-羧基-X-罗丹明)。其中，Cy5提供内标信号，ROX提供检测信号(如图3所示信标分子Cy5和ROX的SERS光谱图)。DNA-C1通过Au-S键共价修饰在SERS活性基底上。当腐败菌存在时，适配体和腐败菌结合形成复合物导致DNA-C2从双链体系中解离，使得ROX远离基底表面因而产生减弱的检测信号。与此同时，通过杂交新的适配体，刚性的dsDNAⅡ得以重新构建，恢复Cy5与基底表面之间的距离，并使得内标信号保持不变。由此得到的比率信号(即检测信号与内标信号的比值)，可用于腐败菌的定量检测。
选择Cy5在1467cm-1处的特征峰的拉曼强度Icy5作为内标信号，该拉曼峰归属于C＝N伸缩振动，选择ROX在1507cm-1处的特征峰的拉曼强度Icy5作为检测信号，该拉曼峰归属于C-C环状伸缩振动；比率信号即为内标信号与检测信号的比值
Figure BDA0002667519350000111

Claims (4)

1.一种水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，其特征在于，通过合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，获得均匀、可重复、大面积、高增强的SERS活性基底，将双链DNA修饰其上，得到SERS生物传感器；即可用于腐败菌的高灵敏检测；具体包括以下步骤：
(1)合成二维金属有机框架纳米片Cu(HBTC)-1；
(2)合成手性双金属Fe3O4-AuNPs负载MOFs二维纳米片，在外加磁场中磁化后，得到定向有序排列的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料，并通过表征分析其性能后，用作SERS活性基底；
(3)针对不同种类的腐败菌，配置不同浓度的腐败菌样品溶液作为待测液；
(4)将双链DNA修饰在步骤(2)中的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料的SERS活性基底上，得到SERS生物传感器；对待测液进行测试，获得待测液的SERS光谱数据，以修饰在双链DNA上的信标分子Cy5的拉曼强度Icy5为内标信号，信标分子ROX的拉曼强度IROX为检测信号，取两者比值得到腐败菌样品的SERS比率信号
Figure FDA0003051513020000011
(5)建立标准腐败菌样品的SERS光谱数据与浓度之间的线性回归模型；
(6)将步骤(4)中测试过的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料进行冲洗、干燥、磁化后将双链DNA重构并修饰其上，得到SERS生物传感器；
(7)用步骤(6)经过重建的SERS生物传感器，对步骤(3)中的某一种腐败菌样品再进行测试，依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(8)采集鲜活水产品表面黏液获取含有腐败菌的待测液，用磁化后的SERS活性基底的SERS生物传感器进行测试；依步骤(4)-(5)进行测试建模；
(9)根据上述测试建模结果，对SERS生物传感器检测方法进行评估和性能优化。
2.根据权利要求1所述水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，其特征在于，所述腐败菌为水产品特定腐败菌，其中淡水环境中主要包括的杆菌为黄绿假单胞菌、棒状杆菌、黄杆菌、芽孢杆菌和沙雷氏菌；海水产品含有的腐败菌主要为假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、弧菌和肠杆菌。
3.根据权利要求1所述水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，其特征在于，所述采集鲜活水产品表面黏液，经过基于免疫磁分离技术预处理后，得到分离和富集的水产品特定腐败菌的溶液，该特定腐败菌的溶液作为待测液。
4.一种使用权利要求1所述水产品腐败菌的SERS生物传感器快速检测方法，其特征在于，SERS纳米生物传感器对腐败菌的快速检测的步骤：将合成和表征后的Cu(HBTC)-1/Fe3O4-AuNPs复合材料用作SERS活性基底，将双链dsDNAⅠ固定在SERS活性基底表面，形成双链体系；双链dsDNAⅠ由核酸适配体和其互补链cDNA组成；互补链cDNA被分成两条不连续的片段，末端分别修饰两种不同的信标分子：DNA-C1修饰了5’-Cy5；DNA-C2修饰了3’-ROX；其中，Cy5提供内标信号，ROX提供检测信号；DNA-C1通过Au-S键共价修饰在SERS活性基底上；当腐败菌存在时，核酸适配体和腐败菌结合形成复合物导致DNA-C2从双链体系中解离，使得ROX远离基底表面因而产生减弱的检测信号，与此同时，通过杂交新的核酸适配体，刚性的dsDNAⅡ得以重新构建，恢复Cy5与基底表面之间的距离，并使得内标信号保持不变；由此得到内标信号与检测信号的比率信号，即为内标信号与检测信号的比值
Figure FDA0003051513020000021
该比率信号与腐败菌的浓度具有良好的线性关系，通过建立一元线性回归模型，可用于腐败菌的定量检测
Figure FDA0003051513020000022
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