CN101493455A - 一种糖类物质生物芯片标记和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种糖类物质生物芯片标记和检测方法。该方法以多肽修饰的金纳米粒子作为糖类物质生物芯片的标记物；以共振光散射光谱法为糖类物质生物芯片的检测手段；通过亲和素与生物素反应标记反应过程。该方法具有通用性，并具有灵敏度高，达到32ng/mL；选择性好以及样品消耗量少的特点。该方法获得的单糖检测限为：8μM，凝集素检测限为100pg/mL；二者的线性范围均为：3个数量级；得的糖蛋白检测限为：32ng/ml，凝集素检测限为25.6pg/mL；二者的线性范围均为：3个数量级。该方法可实现对单糖，糖蛋白检测以及糖类物质与相应凝集素之间相互作用的研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖类物质生物芯片标记和检测方法。
技术背景
由于无机纳米粒子(金，银，量子点等)具有特殊的物理和化学性质，近十年来被广泛应用于各种纳米技术，生物纳米技术和生物医学检测技术等领域(化学综述，Chem.Rev.，2004，104，293-346；Chem.Rev.，2005，105，1547-1562)。共振光散射技术(RLS)是近年迅速发展起来的新的仪器分析技术，因其灵敏度高，操作简单等显著特点而备受关注(科学，Science，1995，269，935-939；科学，Science，2000，289，1757-1760)。生物芯片是目前基因组学，蛋白质组学研究的重要工具，具有高通量，并对检测样品消耗量少等优点(基因生物学，Genome Biol.2001，2，research 0004.1～0004.13)。但目前，糖类物质生物芯片主要以荧光为检测手段，因而在检测灵敏度，选择性等方面尚具有一定的缺点；拓展糖类物质生物芯片的检测手段对其发展有重要意义(Nature，2007，4，437-444)。将金纳米粒子标记糖类物质生物芯片和共振光散射光谱检测糖类物质生物芯片方法相结合，有助于提高糖类物质生物芯片的灵敏度，重现性和选择性。
发明内容
以多肽混合物(胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸)修饰金纳米粒子具有合成方法简单，快速并且稳定性好，生物相容性好等优点。而亲和素-生物素(avidin-biotin)是目前发现的最稳定的配合物。本发明利用亲和素-生物素反应以多肽(胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸)修饰的金纳米粒子标记物；通过荧光染料修饰亲和素与生物素反应标记糖类物质生物芯片，并结合表面银增强技术以RLS为检测手段，研制一种新型的糖类物质生物芯片；并实现单糖，糖蛋白检测以及糖类物质与相应凝集素之间相互作用的研究。
本发明的目的是提供一种糖类物质生物芯片标记和检测方法。(1)以多肽修饰的金纳米粒子作为糖类物质生物芯片的标记物；(2)以共振光散射光谱法为糖类物质生物芯片的检测手段；(3)通过亲和素与生物素反应标记反应过程。
实现本发明方法的具体技术方案如下：
1)多肽修饰金纳米粒子的合成
胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸，按摩尔比9∶1制备多肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比1∶50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分钟的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4℃下保存；
2)制作糖类物质生物芯片
由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作并处理糖类物质生物芯片：点样量为1nL/点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液为含有：体积浓度为40％的甘油，体积浓度为0.005％的吐温-20(Tween-20)，pH＝8.5的0.15M NaCl和0.3M磷酸盐缓冲溶液；在温度为25℃，湿度为75％反应12小时；用1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到糖类物质生物芯片；所述的糖类物质为单糖或糖蛋白；
3)标记糖类物质生物芯片
将步骤2)制作好的糖类物质生物芯片分别与25.6pg/ml-100μg/mL的生物素标记的凝集素，浓度为50μg/mL亲和素(avidin)和浓度为2.5×10-9M的步骤1)制得的多肽修饰的金纳米粒子溶液，在37℃反应1小时，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干，得到标记的糖类物质生物芯片；
4)银增强反应
为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在步骤3)标记后的糖类物质生物芯片上，反应5-10分钟，用18.2MΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1∶1混合所得；
5)以RLS检测糖类物质生物芯片
将步骤4)信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TeleChem.International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪(ArrayIt SpotWare ColorimetricMicroarray Scanner)检测，得到糖类物质生物芯片的共振光散射光谱(RLS)检测信号。
有益效果：(1)本发明提供的方法具有通用性，并具有灵敏度高，达到32ng/mL，选择性好以及样品消耗量少的特点。应用本方法可实现对单糖，糖蛋白检测以及糖类物质与相应凝集素之间相互作用的研究。
(2)本发明提供一种多肽修饰金纳米粒子标记方法，与其他金纳米粒子标记方法相比具有简单，稳定，检测限低等优点。利用这一方法所获得的单糖(Gal-β)检测限为：8μM，凝集素(RCA 120)检测限为100pg/mL；二者的线性范围均为：3个数量级，见表1。
这一方法所获得的糖蛋白(Asf)检测限为：32ng/ml，凝集素(RCA 120)的检测限为25.6pg/mL；二者的线性范围均为：3个数量级，见表2。
附图说明
图1是用本发明的方法所获得的蓖麻凝集素-120浓度为1.5μg/ml时，4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷检测的标准曲线图。
图2是本发明的方法所获得不同浓度蓖麻凝集素-120与25mM Gal-β相互作用检测的标准曲线图。
图3是用本发明的方法所获得的蓖麻凝集素-120浓度为2μg/ml时，无唾液酸胎球蛋白(Asf)检测的标准曲线图
图4是不同浓度蓖麻凝集素-120与250μg/ml Asf相互作用检测的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖苷(Man-α)的标记和检测
(1)多肽修饰金纳米粒子的合成
胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸按摩尔比9∶1制备多肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比1∶50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分钟(～16100g)的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4℃下保存；
(2)制作糖类物质生物芯片
由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作100μM-50mM 4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖苷(Man-α)单糖芯片，通过1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片：点样量为1nL/点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液为含有：体积浓度为40％的甘油，体积浓度为0.005％的吐温-20(Tween-20)，pH＝8.5的0.15M NaCl和0.3M磷酸盐缓冲溶液；在温度为25℃，湿度为75％反应12小时；用1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到100μM-50mM 4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖苷(Man-α)单糖芯片；
(3)标记糖类物质生物芯片
将步骤(2)制作好的100μM-50mM 4-氨基苯基-α-D-甘露吡喃糖苷(Man-α)单糖芯片分别依次与100pg/ml-50μg/ml生物素标记的刀豆凝集素(biotin-ConA)，50μg/mL亲和素(avidin-FITC)和2.5×10-9M多肽修饰的金纳米粒子，在37℃分别反应1h，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干；
(4)银增强反应
为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在标记后的糖类物质生物芯片上，反应8分钟，用18.2MΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1∶1混合所得；
(5)以RLS检测糖类物质生物芯片
将信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TeleChem.International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪(ArrayIt SpotWare ColorimetricMicroarray Scanner)检测，得到糖类物质生物芯片的RLS检测信号。
利用这一方法所获得的Man-α检测限为：100μM，biotin-ConA检测限为100pg/mL；二者的线性范围均为：2个数量级。
实施例2：4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(Gal-β)的标记和检测
(1)多肽修饰金纳米粒子的合成
胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸按摩尔比9∶1制备多肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比1∶50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分钟(～16100g)的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4℃下保存；
(2)制作糖类物质生物芯片
由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作8μM-100mM 4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(Gal-β)单糖芯片，通过1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片：点样量为1nL/点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液为含有：体积浓度为40％的甘油，体积浓度为0.005％的吐温-20(Tween-20)，pH＝8.5的0.15M NaCl和0.3M磷酸盐缓冲溶液；在温度为25℃，湿度为75％反应12小时；用1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到8μM-100mM 4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(Gal-β)单糖芯片；
(3)标记糖类物质生物芯片
将步骤(2)制作好的8μM-100mM 4-氨基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(Gal-β)单糖芯片分别依次与100pg/ml-100μg/ml生物素标记的蓖麻凝集素-120(biotin-RCA 120)，50μg/mL亲和素(avidin-FITC)和2.5×10-9M多肽修饰的金纳米粒子，在37℃分别反应1h，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干；
(4)银增强反应
为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在标记后的糖类物质生物芯片上，反应10分钟，用18.2MΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1∶1混合所得；
(5)以RLS检测糖类物质生物芯片
将信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TeleChem.International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪(ArrayIt SpotWare ColorimetricMicroarray Scanner)检测，得到糖类物质生物芯片的RLS检测信号。
利用这一方法所获得的获得的Gal-β检测限为：8μM，biotin-RCA 120检测限为100pg/mL；二者的线性范围均为：3个数量级。
实施例3：核糖核酸酶B(RNase B)的标记和检测
(1)多肽修饰金纳米粒子的合成
胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸按摩尔比9∶1制备多肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比1∶50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分钟(～16100g)的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4℃下保存；
(2)制作糖类物质生物芯片
由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作0.16μg/ml-1mg/ml核糖核酸酶B(RNase B)的糖蛋白芯片，通过1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片：点样量为1nL/点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液为含有：体积浓度为40％的甘油，体积浓度为0.005％的吐温-20(Tween-20)，pH＝8.5的0.15M NaCl和0.3M磷酸盐缓冲溶液；在温度为25℃，湿度为75％反应12小时；用1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到0.16μg/ml-1mg/ml核糖核酸酶B(RNase B)的糖蛋白芯片；
(3)标记糖类物质生物芯片
将步骤(2)制作好的0.16μg/ml-1mg/ml核糖核酸酶B(RNase B)的糖蛋白芯片分别依次与0.5ng/ml-10μg/ml生物素标记的刀豆凝集素(biotin-ConA)，50μg/mL亲和素(avidin-FITC)和2.5×10-9M多肽修饰的金纳米粒子，在37℃分别反应1h，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干；
(4)银增强反应
为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在标记后的糖类物质生物芯片上，反应5分钟，用18.2MΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1∶1混合所得；
(5)以RLS检测糖类物质生物芯片
将信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TeleChem.International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪(ArrayIt SpotWare ColorimetricMicroarray Scanner)检测，得到糖类物质生物芯片的RLS检测信号。
利用这一方法所获得的RNase B检测限为：0.16μg/mL，biotin-ConA的检测限为0.5ng/mL；二者的线性范围均为：3个数量级。
实施例4：无唾液酸胎球蛋白(Asf)的标记和检测
(1)多肽修饰金纳米粒子的合成
胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸按摩尔比9∶1制备多肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比1∶50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分钟(～16100g)的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4℃下保存；
(2)制作糖类物质生物芯片
由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作32ng/ml-1mg/ml无唾液酸胎球蛋白(Asf)的糖蛋白芯片，通过1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片：点样量为1nL/点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液为含有：体积浓度为40％的甘油，体积浓度为0.005％的吐温-20(Tween-20)，pH＝8.5的0.15M NaCl和0.3M磷酸盐缓冲溶液；在温度为25℃，湿度为75％反应12小时；用1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到32ng/ml-1mg/ml无唾液酸胎球蛋白(Asf)的糖蛋白芯片；
(3)标记糖类物质生物芯片
将步骤(2)制作好的32ng/ml-1mg/ml无唾液酸胎球蛋白(Asf)的糖蛋白芯片分别依次与25.6pg/ml-100μg/mL生物素标记的蓖麻凝集素-120(biotin-RCA 120)，50μg/mL亲和素(avidin-FITC)和2.5×10-9M多肽修饰的金纳米粒子，在37℃分别反应1h，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干；
(4)银增强反应
为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在标记后的糖类物质生物芯片上，反应8分钟，用18.2MΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1∶1混合所得；
(5)以RLS检测糖类物质生物芯片
将信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TeleChem.International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪(ArrayIt SpotWare ColorimetricMicroarray Scanner)检测，得到糖类物质生物芯片的RLS检测信号。
利用这一方法所获得的Asf检测限为：32ng/ml，biotin-RCA 120的检测限为25.6pg/mL；二者的线性范围均为：3个数量级。
Claims (1)
1、一种新型糖类物质生物芯片标记与检测方法，其步骤和条件为：
1)多肽修饰金纳米粒子的合成
胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸和胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰(生物素)甘氨酸，按摩尔比9∶1制备多肽混合物的混合溶液，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液的混合物以摩尔比1∶50000混合，室温反应1-2小时后，在转速为13000转/分钟的条件下通过离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中4℃下保存；
2)制作糖类物质生物芯片
由北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 48芯片制作系统上制作并处理糖类物质生物芯片：点样量为1nL/点；为获得好的阵列点并保持生物分子的活性，点样液含有：体积浓度为40％的甘油，体积浓度为0.005％的吐温-20，pH＝8.5的0.15M NaCl和0.3M磷酸盐缓冲溶液；在温度为25℃，湿度为75％反应12小时；用重量体积浓度为1％的牛血清蛋白以及0.1M乙醇胺封闭芯片后得到糖类物质生物芯片；所述的糖类物质为单糖或糖蛋白；
3)标记糖类物质生物芯片
将步骤2)制作好的糖类物质生物芯片分别与25.6pg/ml-100μg/mL的生物素标记的凝集素，浓度为50μg/mL亲和素和浓度为2.5×10-9M的步骤1)制得的多肽修饰的金纳米粒子溶液，在37℃反应1小时，之后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干，得到标记的糖类物质生物芯片；
4)银增强反应
为了进一步提高检测灵敏度，滴加即制即用的银增强溶液使其完全覆盖在步骤3)标记后的糖类物质生物芯片上，反应5-10分钟，用18.2MΩ水冲洗得到信号增强糖类物质生物芯片；所述的银增强溶液是将美国西格玛(Sigma)公司生产的银增强溶液A与银增强溶液B按体积比1∶1混合所得；
5)以共振光散射光谱检测糖类物质生物芯片
将步骤4)信号增强后所得的糖类物质生物芯片放入美国TeleChem.International Inc.公司生产的色度阵列扫描仪检测，得到糖类物质生物芯片的共振光散射光谱检测信号。
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|---|---|---|---|
| CNA2009100665593A CN101493455A (zh) | 2009-02-24 | 2009-02-24 | 一种糖类物质生物芯片标记和检测方法 |
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Publications (1)
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|---|---|
| CN101493455A true CN101493455A (zh) | 2009-07-29 |
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| CNA2009100665593A Pending CN101493455A (zh) | 2009-02-24 | 2009-02-24 | 一种糖类物质生物芯片标记和检测方法 |
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2009
- 2009-02-24 CN CNA2009100665593A patent/CN101493455A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090729 |