CN111344551B - 光谱散射流式细胞仪的光学配置方法 - Google Patents
光谱散射流式细胞仪的光学配置方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种微流控设备，包括：照射源，其被配置成产生多波长照射光束并将多波长照射光束引导至可包括纳米标签的微流控靶；检测器，其被配置成从微流控靶接收多波长检测光束并产生检测信号，其中，多波长检测光束包括通过多波长照射光束与微流控靶中的纳米标签之间的相互作用而弹性地侧向散射的光；以及处理器，其被配置成接收检测信号，并通过将检测信号的多波长侧向散射强度特征与一种或多种纳米标签类型的预定多波长弹性侧向散射强度分布进行比较，确定微流控靶中纳米标签的存在。还公开了基于检测信号和针对不同纳米标签类型预定的多波长弹性侧向散射强度分布，响应于多波长检测光束而确定不同纳米标签的存在的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请涉及2016年10月21日提交的美国临时专利申请第62/411,324号以及2017年10月23日提交的名称为“分子纳米标签”的PCT申请，其每一个的公开内容在此都通过引用以其整体并入。
本申请要求2017年10月23日提交的美国临时专利申请第62/575,988号的权益，其公开内容在此通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明的领域是包括流式细胞仪的微流控设备和方法。
致谢政府支持
本发明是在美国国家癌症研究所的美国国立卫生研究院的项目编号Z01BC011502的政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
用于单个纳米颗粒检测、分辨率和/或分选的改进方法和装置对于临床和研究目的都是有利的。例如，它们对于识别和分析细胞释放的细胞外囊泡(EV)和其它纳米级颗粒将很有用，这些颗粒具有重要的生物学功能和巨大的生物医学潜力，可用作治疗剂、靶标或生物标记物。人们普遍认为，EV的组成成分和生物学功能会根据产生它们的细胞类型和产生条件而有所不同(Raposo和Stoorvogel，J Cell Biol 200(4):373-383,2013)。然而，以前不可能通过定义细胞谱系和子集来表征这些颗粒的子集。类似地，以前难以检测、分选和计数其它纳米级颗粒以及这些纳米级颗粒的单个分子组分。这项技术的重要障碍在于缺乏基于特定属性来分析、分选和功能性研究单个纳米级颗粒的可用工具和试剂。
自从1972年Herzenberg及其同事引入荧光激活细胞分选(FACS)以来，一直在使用荧光激活细胞分选(FACS)来识别和分选标记的细胞子集(Julius等人，Proc Natl AcadSci USA69(7):1934-1938,1972；Bonner等人，Rev Sci Instrum43:404-409,1972)，但是对于小于约500nm的颗粒，认为亚微米亚群的分选是不可行的。流式细胞仪微流控技术的传统观点认为，小于500nm的颗粒的信号会在样本碎片和电子噪声的信号中丢失，因而无法检测。此外，需要增强试剂方法和设备，诸如允许检测单个分子，诸如EV表面上的单个受体的流式细胞仪和流式细胞仪设备。
发明内容
根据所公开技术的一方面，一种设备，包括：照射源，其被配置成产生多波长照射光束并将其引导至可包括纳米标签的微流控靶；检测器，其被配置成从微流控靶接收多波长检测光束并产生检测信号，其中，多波长检测光束包括通过多波长照射光束与微流控靶中的纳米标签之间的相互作用而弹性地侧向散射的光；以及处理器，其被配置成接收检测信号，并通过将检测信号的多波长侧向散射强度特征与一种或多种纳米标签类型的预定的多波长弹性侧向散射强度分布进行比较，确定微流控靶中纳米标签的存在。
在一些示例中，确定微流控靶中纳米标签的存在包括确定单个纳米标签的存在。在一些示例中，处理器被配置成基于比较而确定具有附着于细胞外囊泡(EV)的至少一个纳米标签的EV的存在。在另一些示例中，处理器被配置成从检测信号确定同时存在于微流控靶中的多种纳米标签类型的存在。在一些示例中，多种纳米标签类型附着在共同的细胞外囊泡(EV)上。在另一些示例中，通过使用预定的多波长弹性侧向散射强度分布对检测信号进行解卷积来执行比较。在一些示例中，单个纳米颗粒具有球形或非球形特征，并且具有与球形特征相关联的直径，或与非球形特征相关联的特征尺寸，其中该直径或特征尺寸为100nm或更小。在另外的示例中，弹性侧向散射强度分布对应于峰值散射。在一些示例中，纳米标签类型包括由金制成的一种或多种纳米标签类型和由银制成的一种或多种纳米标签类型。在另一些示例中，一种或多种纳米标签类型包括具有在10nm至30nm的范围内选择的直径的纳米标签类型。根据一些示例，照射源包括宽带照射源，该宽带照射源被设置为产生具有预定波长光谱的宽带照射光束，并且该设备包括波长分离系统，该波长分离系统光学耦合至宽带照射光束并且被设置成将宽带照射光束分离为多个子光束，每个子光束都具有预定波长光谱的单独的波长子带，并沿着不同的相应光路引导和聚焦子光束，以便基于相应的波长子带的色彩聚焦距离将子光束聚焦在微流控靶上。在一些示例中，宽带照射源包括超连续谱激光器。在另一些示例中，波长分离系统包括多个二向色性光学元件，这些二向色性光学元件被设置成将分离的子光束沿着共线或平行的光路引导至微流控靶。在一些示例中，波长分离系统包括光学地耦合到相应的子光束的多个聚焦系统，以便将子光束聚焦到微流控靶的公共位置。在另一些示例中，检测系统包括：收集光学器件，其被设置成接收由微流控靶弹性地侧向散射的光以便形成多波长检测光束；以及棱镜光学器件，其被设置成从收集光学器件接收多波长检测光束，并将多波长检测光束分成基于波长在空间上分离的多个检测子光束。一些示例性检测系统还包括具有单独的微透镜的微透镜阵列，这些微透镜被设置成接收和聚焦相应的检测子光束，并且检测器包括被设置成接收相应的检测子光束的多个检测器通道。在一些示例中，检测器包括一个或多个雪崩光电二极管、单光子检测雪崩光电二极管、光电倍增管、硅光电倍增器，或者3-D高分辨率、高灵敏度、高帧频光场彩色记录装置或其组合。在另一些示例中，照射源包括多个单色激光源，这些单色激光源被设置成产生不同波长的相应激光束，以便对应于多波长照射光束。在一些示例中，照射源还包括光束聚焦光学器件，该光束聚焦光学器件被设置成基于激光束波长的色彩聚焦特性将每个相应的激光束聚焦在微流控靶上。在一些实施例中，照射源还包括多个二向色性光学元件，这些二向色性光学元件被设置成沿着共线的光路引导激光束，使得激光束被聚焦到微流控靶上的共同位置。根据另一些示例，检测器是检测系统的一部分，该检测系统包括收集光学器件，该收集光学器件被设置成接收不同波长的光，该光被微流控靶弹性地侧向散射，以便形成多波长检测光束。在一些示例中，收集光学器件包括：第一收集光学器件，其相对于由微流控靶接收的多波长照射光束的光路垂直地布置；和第二收集光学器件，其相对于光路垂直地布置且与第一收集光学器件相邻。在另一些示例中，第二收集光学器件处于微流控靶的与第一收集光学器件相反的一侧。在一些示例中，第二收集光学器件被配置为具有与第一收集光学器件不同的收集光学器件参数，这些参数使米氏共振在给定波长下偏移预定量。在另一些示例中，收集光学器件参数包括收集光学器件角度和检测孔径几何形状中的一个或两个。在一些示例中，检测器包括耦合到第一收集光学器件的第一检测器和耦合到第二收集光学器件的第二检测器，其中，第一检测器和第二检测器的灵敏度被选择为不同以增加对不同大小的颗粒的动态检测范围。一些示例性检测系统还包括至少一个二向色性光学元件，该二向色性光学元件被设置成会聚地接收多波长检测光束并将多波长检测光束分离成多个检测子光束，每个检测子光束都对应于不同波长之一，其中，检测器包括多个光学检测器，这些光学检测器被设置成从至少一个二向色性元件接收相应的检测子光束，并且被设置成相对于该至少一个二向色性元件成间隔关系，这种间隔关系基于由收集光学器件提供的聚焦距离和在检测子光束之间的焦点的光路长度差，该光路长度差与收集光学器件的色差分布相关联。在一些示例中，该至少一个二向色性光学元件包括第一二向色性光学元件和第二二向色性光学元件，其中，第一二向色性光学元件被设置成将具有不同波长中的第一波长的第一检测子光束引导到相应的光学检测器，第二二向色性光学元件被设置成将具有比第一波长更长的第二波长的第二检测子光束引导到相应的光学检测器。在一些示例中，利用至少一个二向色性光学元件生成检测子光束的生成顺序基于收集光学器件的色差聚焦分布。在一些实施例中，收集光学器件包括一个或多个消色差或复消色差透镜元件。在另一些示例中，第一收集光学器件被设置成检测多波长检测光束的具有第一波长的第一检测子光束，并且第二收集光学器件被设置成检测多波长检测光束的具有第二波长的第二检测子光束。在一些示例中，通过与第一收集光学器件的色差聚焦分布相关联的第一收集光学器件或者第一收集光学器件与被设置成接收第一检测子光束的光学检测器之间的空间关系，基于第一检测子光束与第二检测子光束之间的聚焦距离共通性和聚焦距离差中的一个或两个，将使用第二收集光学器件对第二检测子光束的检测与使用第一收集光学器件对第一检测子光束的检测在空间上分开。一些检测系统示例还包括光纤组件，该光纤组件包括：具有相应的相邻的第一端的多根光纤，每个第一端都包括孔径，该孔径被设置成接收具有不同波长之一的多波长检测光束的相应检测子光束，其中，基于与收集光学器件的色差聚焦分布相关联的检测子光束之间的聚焦距离变化，使孔径沿子光束的公共传播方向关于彼此间隔开；和光学耦合至光纤的与第一端相反的相应的第二端的多个光学检测器。在一些示例中，孔径与相应的检测子光束的图像点对准。一些示例还包括耦合到光纤的至少一个第一端的平移台，以便沿传播方向平移相应的孔径。在一些实施例中，孔径是狭缝孔径，并且每个狭缝孔径都具有比狭缝宽度长的狭缝长度，并且狭缝长度平行于微流控靶的流动方向延伸。在一些示例中，平移台被设置成沿着垂直于传播方向和流动方向的侧向方向平移狭缝孔径。在一些实施例中，光纤的第一端中的每一个都包括光学块，该光学块包括相应的孔径并且光学地耦合或熔合到光纤以形成第一端。在另一些示例中，光学块的与孔径相邻的区域具有吸收率，对吸收率进行选择以便减少在光纤的第一端附近的杂散光。在一些实施例中，每个孔径都基于成型光纤芯或包层的几何形状以及位于端面上的反射率涂层变化中的一个或多个，由光纤的相应端面来限定。在另一些示例中，孔径具有关于米氏共振选择的几何形状。在一些实施例中，几何形状是非圆形和非矩形的。
根据所公开技术的另一方面，方法包括：将利用照射源产生的多波长照射光束引导至微流控靶；通过微流控靶弹性地侧向散射多波长照射光束；用检测器检测通过弹性侧向散射的多波长照射光束形成的多波长检测光束的多个检测子光束，以产生检测信号；以及基于该检测信号和针对不同纳米标签类型的预定的多波长弹性侧向散射强度分布，响应于多波长检测光束而确定不同纳米标签的存在。
在一些示例中，通过使用预定的多波长弹性侧向散射强度分布对检测信号进行解卷积来执行确定。在另一些示例中，引导多波长照射光束包括：将多波长照射光束分成多个照射子光束，每个照射子光束都具有不同的波长子带；和沿着不同的相应的光路将照射子光束引导在微流控靶上，使得基于不同的波长子带的色彩聚焦距离变化，照射子光束被聚焦在微流控靶上。在一些示例中，检测多个检测子光束包括：利用棱镜装置将多波长检测光束分离为检测子光束；使用具有被设置成分别聚焦检测子光束的相应的微透镜的微透镜阵列来接收检测子光束；以及通过光学检测器的相应的检测器通道接收聚焦的检测子光束。在一些示例中，照射源包括多个单色激光器，该多个单色激光器被设置成发射具有不同的相应波长的激光束。在另一些示例中，引导多波长照射光束包括将激光束引导到共线光路，使得激光束聚焦到微流控靶上的共同位置。在一些示例中，检测多个检测子光束包括：利用至少一个二向色性光学元件会聚地接收来自收集光学器件的多波长检测光束，以便将多波长检测光束分离成检测子光束，每个检测子光束都对应于不同的波长之一；和利用相应的光学检测器接收检测子光束，这些光学检测器与该至少一个二向色性光学元件成间隔关系，这种间隔关系基于由收集光学器件提供的聚焦距离和在检测子光束之间的焦点的光路长度差，该光路长度差与收集光学器件的色差分布相关联。在一些示例中，检测多个检测子光束包括：利用第一组收集光学器件接收多波长检测光束的第一部分；检测具有第一波长的第一部分的检测子光束；利用第二组收集光学器件接收多波长检测光束的第二部分，第二组收集光学器件被设置成相对于微流控靶与第一收集光学器件相反；以及通过与第一收集光学器件的色差聚焦分布相关联的第一组收集光学器件，基于具有第一波长的检测子光束和具有第二波长的检测子光束之间的聚焦距离共通性和聚焦距离差中的一个或两个，单独地检测第二部分的具有第二波长的检测子光束。在另一些示例中，检测多个检测子光束包括利用收集光学器件将检测子光束引导到相邻光纤的第一端处的相应孔径，其中，基于与收集光学器件的色差聚焦分布相关联的检测子光束之间的聚焦距离变化，狭缝孔径沿着子光束的共同传播方向相对于彼此间隔开。
通过以下参考附图进行的详细描述，所公开技术的前述和其它特征以及优点将变得更加明显。
附图说明
图1是示例性微流控流式细胞仪设备的示意图。
图2A是示例性多波长照射源的示意图。
图2B至图2C是图2A中所示的多波长照射光束的光束横截面图。
图3A是多波长照射源的另一示例的示意图。
图3B至图3C是图3A中所示的多波长照射光束的光束横截面图。
图4A是多波长照射源的另一示例的示意图。
图4B至图4C是图4A中所示的多波长照射光束的光束横截面图。
图5是示例性多波长侧向散射检测系统的示意图。
图6是微流控检测系统的示意图。
图7是另一微流控检测系统的示意图。
图8A是光学图像滤波单元的透视示意图。
图8B至图8D示出了不同的孔径几何形状。
图9至图13是多波长微流控流式细胞仪方法的流程图。
图14示出了示例性微流控设备。
图15A至图15D示出了用于具有选定直径的各种纳米球的米氏散射材料的视图。
图16A是60nm金球和银球的散射横截面与波长的关系图。
图16B是在不同波长下60nm金纳米和银纳米颗粒的建模散射特性的视图。
图17A至图17B是分别针对40nm球体和20nm球体的Ag/Au散射横截面和其它散射横截面与波长的关系图。Ag/Au线表示Ag与Au的收集的散射功率之比。黑色虚线表示Au的收集的散射能力。点划线表示Ag的收集的散射功率。水平线表示金和银的散射功率比为1。虚线表示所收集的100nm金的散射功率。垂直线表示可以用于光谱散射检测的单色激光二极管源。
图18A至图18B是针对不同收集角的Ag/Au散射横截面与波长的关系图。40nm金、银和100nm聚苯乙烯的光谱散射。每种材料都以2度为增量在20到60度之间建模。每种的光谱特性可以在图17A中找到。
图19A、图19B和图19C是米氏散射模型脚本的示意图。
图20A是变化系数与收集半角的关系图，示出了在图20B上采集的珠数据(beaddata)的最接近拟合收集半角。
图20B是通道数量与粒径的关系图，并且示出了在Astrios EQ流式细胞仪上获得的已知直径和折射率(黑点)的颗粒的拟合，其中使用了从图20A推导的收集角的建模数据。
图21A至图21D示出了对于不同照射波长的散射横截面与粒径的关系图。
图22A至图22D示出了在各种波长下和对于各种颗粒的散射检测的建模和实际性能。图22B、图22D中的数据还示出了由不同分子纳米标签核心材料组成的代表性珠集合，其可以用作仪器校准的参考珠并获得解卷积算法的参考值。
图23示出了聚苯乙烯、金、CdSe、银的折射率以及金、CdSe和银的消光系数的视图。
图24示出了金的光学常数和特性。
图25显示了FACS Symphony和Astrios EQ流式细胞仪针对金、银和聚苯乙烯珠的SSC/FSC图比较。
图26A示出了使用圆形孔径利用5度增量的5至90度的半角进行SSC收集的建模的细胞外囊泡的散射-直径关系。
图26B示出了使用正方形孔径利用5度增量的5至90度的半角进行SSC收集的建模的细胞外囊泡的散射-直径关系。
图27示出了在具有开放孔径(950μm)、450μm和200μm狭缝孔径的Attune NxT上获得的针对100nm、300nm、500nm和900nm珠的计算SSC分离指数。分离指数是使用中值强度差在其标准偏差的总和上计算的。
图28A至图28F示出了纳米颗粒的系列稀释和指示单个颗粒检测的线性下降。
图29示出了针对各种Au、Ag和PS纳米颗粒的关于波长的建模散射横截面。
图30A至图30B分别示出了60nm的Ag至60nm的Au颗粒的建模和实验获得的散射横截面。
图31示出了单个60nm的Au和Ag纳米标签以及CFSE染色EV的检测。
图32示出了在405nm、488nm、635nm的照射波长下直径为100nm、200nm、500nm的聚苯乙烯颗粒的角散射分布。
图33示出了在405nm、488nm、561nm、635nm的照射波长下以30度的收集半角建模的聚苯乙烯球的散射横截面。
具体实施方式
如在本申请和权利要求书中所使用的单数形式的“一”、“一个”和“该(所述)”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。另外，术语“包括…”意指“包含…”。此外，术语“耦合”(包括“光学耦合”)不排除在耦合项之间存在中间元件。
本文所述的系统、设备和方法不应以任何方式解释为限制。相反，本公开单独地并且以彼此的各种组合和子组合的方式针对各种公开实施例的所有新颖和非显而易见的特征和方面。所公开的系统、方法和设备不限于任何特定方面或特征或其组合，所公开的系统、方法和设备也不要求存在任何一个或多个特定优点或待解决问题。任何操作理论都是为了便于解释，但是所公开的系统、方法和设备不限于这些操作理论。
尽管为了方便呈现以特定的顺序次序描述了一些所公开的方法的操作，但是应理解，这种描述方式包括重新布置，除非以下阐述的特定语言要求特定的次序。例如，在某些情况下，顺序描述的操作可以重新排列或同时执行。此外，为了简单起见，附图可能未示出所公开的系统、方法和设备可以与其它系统、方法和设备结合使用的各种方式。另外，该描述有时使用诸如“产生”和“提供”之类的术语来描述所公开的方法。这些术语是所执行的实际操作的高级抽象。对应于这些术语的实际操作将根据特定的实现方式而变化，并且本领域的普通技术人员很容易辨别。
在一些示例中，数值、过程或设备被称为“最低”、“最佳”、“最小”等。应明白，这样的描述旨在指示可以在许多使用的功能选择中进行选择，并且这些选择不必比其它选择更好、更小或以其它方式优选。
本文中使用的“光辐射”是指波长在约100nm至10μm之间，并且通常在约300nm至800nm之间的电磁辐射。基于可用的激光二极管源和光纤的示例通常与约35 0nm至大于1000nm之间的波长相关联。在一些示例中，传播的光辐射是指具有一定直径、光束横截面积和光束发散度的一个或多个光束，这些直径、光束横截面积和光束发散度可能取决于光束波长和用于光束整形的光学系统。为了方便起见，在一些示例中，光辐射被称为光，并且通常处于UV或可见光波长，但是示例可以包括除UV或可见光以外的波长。可以使用通常对应于零强度值、1/e值、1/e2值、半角全宽(FWHM)值或其它合适指标的边界来描述光束的横截面积、直径或其它光束尺寸。
在一些示例中，关于一个或多个轴描述了光束和光学元件。通常，轴包括一个或多个直线段，光束沿该直线段传播或一个或多个光学元件沿着该直线段设置。这些轴可以通过反射或折射表面弯曲或折叠，因此轴不需要为单个直线段。描述了或可以使用各种透镜，包括凸-凸、平-凸、凹-凹、平凹、圆柱、菲涅耳、波带片、全息、球面、非球面透镜，其组合等。圆柱透镜可以具有彼此垂直排列的圆柱表面，以提供交叉圆柱或交叉圆柱透镜或透镜组件。
图1示出了微流控流式细胞仪100的示例，其包括产生多波长照射光束104并将多波长照射光束104引导至微流控流式细胞仪靶106的多波长照射源102。在代表性示例中，流式细胞仪靶106包括以横截面示出的流体流108，使得流体流108流入或流出图1的平面，该流体流包括可以基于由附着在颗粒110上的纳米标签(“nanotag”)112a、112b弹性散射的光而变为可检测到的(包括可单个检测到的)细胞外囊泡(EV)。应明白，在一些示例中，流体流108可以是不动的。多波长照射光束104通常被垂直于流体流108的流动方向被引导至流式细胞仪靶106，并聚焦在流式细胞仪靶106上。前向散射(FSC)检测系统114被设置成关于流式细胞仪靶106与入射到流式细胞仪靶106上的多波长照射光束104相对，以便接收来自流式细胞仪靶106的前向散射检测光束116，前向散射检测光束116以与多波长照射光束104相同的大体方向传播。
分子纳米标签是纳米级的细胞标记，可以基于相应的固有光散射特性进行单独检测或定量枚举。本文的光学设备示例可以收集来自多波长光源的光谱散射光数据，以便识别不同的分子纳米标签，这些分子标签可以是模块化的，并且可以由不同的纳米材料组成，每种材料在很大波长范围内具有可识别的独特的光散射光谱特性。在一些示例中，可以检测光强度或功率值。示例测量多个特定波长下的光散射，并且观察到与金纳米材料在与金的光学特性相对应的波长下相关的增强散射信号。在代表性示例中，等离子振子共振可能与吸收有关，散射可能与分离现象相对应，并且检测吸收和散射的总和，因此使用复数折射率，包括经典折射率以及与消光系数对应并说明吸收的虚部。
在另外的示例中，根据光学特性(包括折射率和消光系数)，材料之间的增强的光散射功率的模式被证明是不同的。这些差异可以与选定波长下的多光谱检测方法一起使用，以区分激光并进一步提高检测灵敏度到检测单个分子(诸如分子纳米标签)的程度，每个分子纳米标签都有不同的标记。侧向散射(SSC)检测系统118被设置成接收和检测多波长检测光束120，其通常传播到流式细胞仪靶106和多波长照射光束104的一侧，例如垂直于流体流108和多波长照射光束104的方向。在代表性示例中，术语“侧向散射”是指由悬浮在流(例如流体流108)中的颗粒散射的光，这种光是以相对于由颗粒从照射源接收的光的传播方向通常在5至180度范围内的角收集的。多波长检测光束120是由多波长照射光束104与流式细胞仪靶106的颗粒110和纳米标签112a、112b之间的弹性碰撞产生的。代表性SSC检测系统118包括光学检测器，该光学检测器包括一个或多个雪崩光电二极管、单光子检测雪崩光电二极管、光电倍增管、硅光电倍增器，或者3-D高分辨率、高灵敏度、高帧频的光场彩色记录装置或其组合。在代表性示例中，可以针对不同波长或波长带的纳米标签的米氏散射特性进行数值建模，以便可以确定检测到的散射与流式细胞仪靶106中一个或多个纳米标签的存在之间的对应关系。例如，在405nm或附近的检测到的弹性散射可以对应于结合到EV的银纳米标签，并且在532nm或附近的检测到的弹性散射可以对应于结合到EV的金纳米标签。因而，可以用多波长照射光束104询问流式细胞仪靶106，以便可以通过侧向散射检测系统118来检测在不同波长下产生不同的相应散射特性的不同类型的纳米标签，例如纳米标签112a、112b。在一些示例中，可以将具有SSC检测系统118的多光谱侧向散射检测与非弹性散射(拉曼)检测或荧光检测结合。此外，SSC检测系统118的收集光学器件(或微流控细胞仪100的其它部件)可以被配置成利用米氏共振特性，其中相对散射功率随特定波长下的颗粒直径而变化(并且随波长变化而移位或移动)。通过利用米氏共振特性，可以进一步增强确定预定的纳米标签的存在，或通过预定的纳米标签光谱分布解卷积检测信号的过程。通过提供米氏共振的形状和/或位置的选择，可以将建模配置为更准确地确定检测到的颗粒的尺寸或折射率。例如，在检测系统118包括单组收集光学器件或定义了单组收集参数(例如，特定的收集角度)的情况下，根据波长的米氏共振的移位(如图32所示)可以提供散射横截面中的预定变化，其指示特定尺寸颗粒的存在或不存在。在一些示例中，检测系统118可以包括一个或多个另外的收集参数集，或者流式细胞仪系统可以包括提供另外的收集参数集的另外的检测系统(诸如下文的另外的SSC检测系统144)，另外的收集参数集可以提供在相对于初始收集参数集的选定波长(因此其它波长)下的米式共振的预定移位。这允许多波长检测光束120的不同散射波长具有互补的散射直径曲线(如图20B所示)，互补的散射直径曲线利用了允许以低收集角看到校正(如图26A至图26B所示)的照射波长(如图32中所示)引起的米氏共振的移动。例如，具有30度收集半角的检测系统会在直径为200-300nm的聚苯乙烯颗粒中看到米氏共振(照射波长为405nm)，然而如果照射波长为635nm，则这种米氏共振直到380-500nm才可见。因此，可以使用635nm的照射波长校正其中来自200-300nm颗粒的在405nm信号中存在米氏共振的区域，并且可以类似地利用图33的405nm信号校正其中在380-500nm下在635nm信号中具有米氏共振的区域。
SSC检测系统118可以包括或耦合到流式细胞仪控制环境122，控制环境122可以包括一个或多个计算装置，这些计算装置包括处理器124和联接到处理器124的存储器126。控制环境122可以包括：检测器阈值选择器128，其被设置成调节信号阈值，以检测SSC检测系统118的一个或多个光学检测器的所选检测器通道的散射光；和检测器触发通道选择器130，其被设置成选择SSC检测系统118的一个或多个检测器通道，以基于通过检测器阈值选择器128选择的信号阈值或多个阈值而触发检测事件。可以将每个检测事件的FSC和SSC数据与预定的SSC/FSC散射分布比较，预定的SSC/FSC散射分布与诸如颗粒110和/或纳米标签112a、112b之类的所选对象相关联，并且一个或多个对象计数器132a、132b可以基于肯定的确定而增量。
在一些示例中，选择在添加流体流108(但不包含任何微粒110)的情况下具有最小添加噪声的检测器通道作为触发器，并且将所选通道的检测器阈值选择为等于或接近与流体流108相关联的噪声水平。在随后用多波长照射光束104询问包含颗粒110和纳米标签112a、112b的流体流108之后，与多波长检测光束120相关联的事件可以包括：可以将噪声样本与无微粒参考噪声进行比较，以确定在流式细胞仪靶106中是否存在对象，这些对象将无法通过被配置成将背景噪声最小化的噪声设置进行检测。
在代表性实施例中，流式细胞仪控制环境122包括SSC聚焦控制器138，SSC聚焦控制器138联接到SSC检测系统118，以便针对一个或多个相应的光学检测器处的多波长检测光束120或流式细胞仪靶106处的多波长照射光束104的不同波长调节聚焦位置。一些示例还包括可以存储在存储器126中的多波长侧向散射分布140，诸如针对一个或多个纳米颗粒，特别是多个纳米颗粒的依赖于波长的侧向散射特性(例如强度、功率)，以便可以将多波长检测光束120的检测特性与多波长侧向散射分布140进行比较，以便确定纳米颗粒的存在。在另外的示例中，使用一种或多种解卷积算法142分离对应于不同纳米颗粒的光信号。
在不同实施例中，可以使用各种类型的多波长照射源102，包括多个单色激光器和宽带或超连续谱激光器源。在一些示例中，照射光束控制器136可以用于基于波长选择、检测器就绪等来控制多波长照射光束104的时序和/或生成。在一些示例中，另外的SSC检测系统144可以耦合到邻近多波长检测光束120和SSC检测系统118，包括例如在流式细胞仪靶106的相对侧上的流式细胞仪靶106，以便接收和检测单独的多波长检测光束140，其包括由流式细胞仪靶106散射的光。在一些示例性设备中，SSC检测系统118、144中的一个或多个可以被设置成检测除侧向散射波长之外的光，诸如荧光、拉曼或其它光学波长和/或感兴趣的光学效果。在一些示例中，另外的SSC检测系统144可以被配置为具有不同的部件特性，诸如不同的收集光学器件，该不同的收集光学器件具有不同的收集角度、不同的狭缝孔径几何形状等，影响颗粒的直径与由于颗粒的角度散射分布中的米氏共振而收集的光散射量之间的关系(如图32中所示)。如图32中所示，随着照射波长的增大，米氏共振的位置移动。虽然图32在颗粒水平上证明了这种效果，但图33进一步示出了在系统水平上的效果，其中可以看出从较小颗粒到较大颗粒的米氏共振移位(30度的相对低的收集角度)。通过利用几种波长，并因此使用多个或所有这些曲线，可以发现散射信号随粒径不断增加并因此允许尺寸的精确外推的区域。因而，通过还获得与不同的特征米氏共振位置相关联的分离检测信号，可以在其中将在一个波长出现米氏共振的区域中获得尺寸和折射率的确定，这是由于该区域被解释为处于在该直径范围内不具有米氏共振的不同波长下。
流式细胞仪控制环境122可以包括由数字计算机执行的软件或固件指令。例如，任何公开的流式细胞仪检测技术都可以部分地由计算机或作为流式细胞仪控制系统的一部分的其它计算硬件(例如，ASIC、FPGA、PLC、CPLD、GPU等中的一个或多个)执行。流式细胞仪控制环境122可以被连接或以其它方式与多波长照射源102、FSC检测系统114、SSC检测系统118和另外的SSC检测系统144通信，被编程或被配置为控制多波长照射光束104，检测FSC、SSC和/或荧光，并比较或分选检测光束数据，以确定是否存在流式细胞仪颗粒和/或纳米标签。该计算机可以为包括处理器124(处理装置)和存储器126中的一个或多个的计算机系统，存储器126包括有形的非暂时性计算机可读介质(例如，一个或多个光学介质盘、易失性存储装置(诸如DRAM或SRAM)或者非易失性存储器或存储装置(诸如硬盘驱动器、NVRAM和固态驱动器(例如闪存驱动器))。一个或多个处理器124可以执行存储在一个或多个有形的非暂时性计算机可读介质上的计算机可执行指令，由此执行任何公开的技术。例如，用于执行任何公开的实施例的软件可以作为计算机可执行指令而存储在一个或多个易失性、非暂时性计算机可读介质上，当被该一个或多个处理器执行时，这些指令致使该一个或多个处理器执行任何所公开的照射/检测技术。计算结果和流式细胞仪靶106所检测的光学特征可以被存储(例如，以适当的数据结构)在一个或多个有形的、非暂时性的计算机可读存储介质中和/或还可以例如通过在显示装置134上显示计数对象的数量、FSC/SSC强度或功率数据、卷积或解卷积的SSC数据、通道选择、噪声/触发电平等，诸如作为图形用户界面输出给用户。
图2A示出了多波长照射源200的示例，多波长照射源200包括宽带激光器装置202(例如，超连续谱激光器、白激光器)，宽带激光器装置202被设置成产生多波长照射光束204并将整形的多波长照射光束206聚焦在流式细胞仪靶208处。多波长照射光束206可以具有通常大于单色激光源的预定发射或滤波波长范围。示例通常跨越可见光谱，并且可以包括约350nm至1200nm、350nm至900nm的范围，但是其它范围也是可能的。基于流式细胞仪靶208的预期光学散射特性来选择范围。在代表性实施例中，激光束沿着一个或多个所选横向尺寸聚焦到5-10μm或更小的束腰尺寸，具有高斯、超高斯、横向高斯Top-Hat或其它聚焦几何形状，包括不对称光束分布或在垂直轴上的不同分布，并且可以基于衍射极限以及聚焦深度和距离对照射波长提供实际约束。一些示例性束斑可以具有椭圆形横截面而不是圆形横截面，这可以利于光束对准。在特定的椭圆形光束示例中，与流式细胞仪靶208相交的束腰高度(高度与流动方向相对应)可以在5-10μm的范围内，而束腰的宽度(对应于横向于流动的方向)的范围可以为5-50μm。
诸如透镜(例如，平凸、凸-凸、球形、非球面、消色差、复消色差、圆柱、交叉圆柱透镜等)、反射镜或透镜和反射镜的组合的光束整形光学器件210被设置成接收来自宽带激光器装置202的多波长照射光束204，并减小沿垂直于与多波长照射光束204的传播方向相对应的光轴212的一个或多个轴的发散。在典型示例中，光束整形光学器件210(以及其它示例中的光束整形光学器件)可以通过光纤与宽带激光器装置202光学耦合，但是通过空气、另一种介质或其它元件耦合的自由空间也是可能的。在代表性示例中，光束整形光学器件210被设置成将具有相关联的预定波长范围的多波长照射光束204聚焦在流式细胞仪靶208处，且由于光束整形光学器件210的色差，所以具有沿光轴212的基于波长的聚焦误差。
多个二向色性光学元件214、216(例如，低通、高通、带通)被设置成接收正被朝着流式细胞仪靶208聚焦的多波长照射光束204，并将多波长照射光束204分成多个相应的照射子光束218、220、222，这些照射子光束具有与二向色光学元件214、216的滤光特性相关联的相应波长子带Δλ1、Δλ2、Δλ3。多个光束定向器224、226、228、230、232、234被设置成将照射子光束218、220、222引导至多个二向色光学元件236、238，这些二向色光学元件将照射光束218、220、222重新组合以重叠，如图2C中的横截面所示，或者在一个或多个选定方向上变得相邻并间隔开，如图2B中的横截面所示。在一些示例中，光束定向器224、226、228、230、232、234和/或二向色光学元件214、216、236、238中的一个或多个按角度或成形为将照射子光束218、220、222定位成相邻构造。在一些实施例中，整形的多波长照射光束206的照射子光束218、220、222以不同角度入射到流式细胞仪靶208。
光束定向器224、226、228被设置成关于光束整形光学器件210与流式细胞仪靶208之间的照射子光束220、222的光路长度改变照射子光束218的光路长度，并且光束定向器230、232被设置成关于照射光束218、222的光路长度改变照射光束220的光路长度。照射光束218、220、222的光路长度的变化可以选择，以使在流式细胞仪靶208处的照射光束218、220、222之间的聚焦误差减小或最小化。应明白，尽管示出了借助于反射元件的光路长度变化，但是也可以使用其它元件和元件数量来改变光路长度，包括棱镜。在一些示例中，可以将一个或多个透射光学元件(例如，透明材料的矩形块)放置在一个或多个照射子光束218、220、222的路径中，以缓动或移动光束位置从而选择性地增大相应的照射子光束218、220、222的路径长度。在一些示例中，二向色性光学元件214、216、236、238或光束定向器224、226、228、230、232、234中的一个或多个可以具有不平行的相对透射表面。
图3示出了多波长照射源300的另一示例，该多波长照射源300包括宽带激光器装置302，宽带激光器装置302被设置成产生多波长照射光束304(包括例如光纤耦合光束)并将整形的多波长照射光束306聚焦在流式细胞仪靶308处，并且在某些方面可以与多波长照射源200相似或相同。光束整形光学器件310被设置成从宽带激光器装置302接收多波长照射光束304并减小沿垂直于与多波长照射光束304的传播方向相对应的光轴312的一个或多个轴的发散，从而形成整形光束314。在一些示例中，整形光束314对应于准直光束，在其它示例中可以产生发散或会聚光束。多个二向色性光学元件316、318被设置成接收整形光束314并形成具有不同的相应波长子带Δλ1、Δλ2、Δλ3的照射子光束320、322、324。光束定向器325、327被设置成引导相应的照射子光束320、324，并且另外的多个二向色性光学元件326、328被设置成例如通过重叠来重组照射子光束320、322、324，如图3C所示，或者为间隔关系，如图3B中所示，并形成聚焦在流式细胞仪靶308上的整形多波长照射光束。多个聚焦光学器件330、332、334被设置成将相应的照射子光束320、322、324聚焦在靶308上。可以通过沿着相应的子光束轴336、338、340定位相应的聚焦光学器件330、332、334或改变光学特性，诸如焦距(或两者)来调整不同照射子光束320、322、324的焦距，以便可以减少或最小化与色差相关联的流式细胞仪靶308处的聚焦误差。在一些示例中，照射子光束320、322、324中的至少一个的聚焦距离可以由光束整形光学器件310提供，即，不使用聚焦光学器件330、332、334之一。
图4示出了多波长照射源400的示例，多波长照射源400包括多个单色激光二极管402a、402b、402c，这些单色激光二极管被设置成以不同的相应波长λ1、λ2、λ3发射相应的激光束404a、404b、404c。虽然通常被称为“单色”，但相对于超连续谱或宽带光源，此类光源通常会在窄波段内发射光束。在一些示例中，单色激光束可以具有全宽半最大值、1/e2，或50nm或更小、10nm或更小、5nm或更小、1nm或更小或更窄的其它合适的波长带度量。在流式细胞仪应用中，可以基于感兴趣的流式细胞仪对象的弹性或非弹性侧面或前向散射或荧光特性来选择单色激光源的波长特性。多个光束整形光学器件406a、406b、406c分别耦合至激光束404a、404b、404c(例如，经由自由空间、光纤等)，以将激光束404a、404b、404c引导至相应的反射元件408a、408b、408c。在一些示例中，反射元件408a是反射器，其被设置成沿光束方向410引导激光束404a，并且反射元件408b、408c是二向色性光学元件，其被设置成在光束方向410上组合激光束404a、404b、404c，以便在流式细胞仪靶412上重叠(图4C)或相对于彼此相邻地间隔开(图4B)。
在代表性示例中，激光束404a、404b、404c平行于光束方向410或在光束方向410上共线。在一些实施例中，二向色性滤波被配置成使得λ1<λ2<λ3，但是可以选择其它布置和滤波器。可以校正与光束整形光学器件406a、406b、406c相关联的色彩聚焦误差(特别是当具有相同特征时)，以便激光束404a、404b、404c中的每一个都可以以各种方式聚焦在流式细胞仪靶412上。在一些示例中，诸如通过对单色激光二极管402a、402b，402c(λ1<λ2<λ3)进行排序来调整光束整形光学器件406a、406b、406c与流式细胞仪靶412之间的激光束404a、404b、404c的相应光路长度以减小聚焦误差。对于是消色差或复消色差透镜的光束整形光学器件406a，406b，406c，可以根据透镜的色彩校正曲线对激光二极管402a、402b、402c的位置进行重新排序，并调整光路长度。在一些示例中，光束整形光学器件406a、406b、406c可以沿着相应激光束404a、404b、404c的光轴具有不同的位置，和/或可以具有不同的焦距。在一些示例中，光束整形光学器件406a、406b、406c可以准直相应的激光束404a、404b、404c和通常设置在反射元件408c与流式细胞仪靶412之间的附加聚焦光学器件。在附加示例中，反射元件408b、408c是在y方向上具有足够间隙的反射器，以接收聚焦的或准直的激光束404a、404b而不会截断传播的光束。
图5示出了示例性的侧向散射检测系统500，其被设置成检测由流式细胞仪靶504弹性散射的多波长检测光束502。侧向散射检测系统500包括诸如高数值孔径透镜(例如，1.2)的收集光学器件506，收集光学器件506可以凝胶耦合至流式细胞仪靶504或与另一种合适的浸入材料耦合。在一些示例中，收集光学器件506可以被颜色校正。多个楔形棱镜508a-508g被设置成接收多波长检测光束502，并按波长增大(或减小)顺序将多波长检测光束502在空间上分离为多个检测子光束510a-510e。微透镜阵列512包括多个微透镜514a-514e，这些微透镜被设置成将相应的检测子光束510a-510e聚焦到相应光电倍增管、雪崩光电二极管或其它合适的光学检测器的检测器组516。
图6示出了检测系统600的示例，检测系统600被设置成检测来自多波长照射光束602的光，多波长照射光束602被流入或流出图6的平面的流式细胞仪靶604散射。前向散射检测系统606包括被设置成遮挡入射的前向散射光束610的中心部分的遮挡杆608。收集光学器件612被设置成收集前向散射光束610并将其引导至光电倍增管614或其它合适的光学检测器。侧向散射检测系统616包括具有或不具有色彩校正的诸如高数值孔径透镜之类的收集光学器件618，收集光学器件被设置成收集、引导并聚焦多波长检测光束620到目标平面上，以用于诸如雪崩光电二极管的波长特定的光学检测器622a-622d。
多个二向色性光学元件624、626、628被设置成根据不同的波长将多波长检测光束620分成多个检测子光束630a-630d。在一个示例中，光学检测器622a-622d被设置成分别检测以445nm、488nm、532nm和561nm为中心的波长，每个检测器都具有例如10nm带通滤波器以缩小被相应的光学检测器622a-622d接收的检测子光束630a-630d的光的波长范围。在代表性示例中，利用收集光学器件618将检测子光束630a-630d选择性地聚焦到目标平面，并且将二向色性光学元件624、626、628和相应的光学检测器622a-622d选择性地间隔开以提供光路长度差，光路长度差校正与检测子光束630a-630d的波长差相关联的聚焦误差，使得检测子光束630a-630d被在焦点处接收。如图所示，收集光学器件618和光学检测器622a-622d之间的光路长度随着待检测的波长的增加而增加。在一些示例中，可以基于与收集光学器件618相关联的色差聚焦分布来选择光学检测器622a-622d的不同空间顺序，并且可以基于高数值孔径透镜的焦距选择二向色性光学元件、带通滤波器和光学检测器之间的距离。在一些示例中，一个或多个光学图像滤波孔径631a-631d被设置成对相应的入射检测子光束630a-630d进行图像滤波，并且可以被定位在各种位置，包括靠近光学检测器622a-622d或二向色性光学元件624、626、628。在一个示例中，可以在收集光学器件618和二向色性光学元件624之间定位单个孔径。
在另外的示例中，可以用单独的侧向散射检测系统632来检测多波长检测光束620的选定波长，侧向散射检测系统632被设置成接收与多波长检测光束620相反的单独的多波长检测光束634。侧向散射检测系统632包括另一组收集光学器件636，另一组收集光学器件636被设置成收集多波长检测光束634并将其引导至一个或多个光学检测器，例如雪崩光电二极管。根据配置，可以使用二向色性光学元件形成的装置来将多波长检测光束634分离为多个待检测的子光束。在一个示例中，用诸如雪崩光电二极管之类的相应的光学检测器638检测多波长检测光束634的单个波长(在405nm)。在一些示例中，光学图像滤波孔径639被设置在收集光学器件636和光学检测器638之间，以便对多波长检测光束634进行光学图像滤波。在一些示例中，用侧向散射检测系统632而不是侧向散射检测系统620，基于与另外的光学检测器和二向色性光学元件对的定位相关联的空间约束来检测多波长检测光束634的选定子光束波长，其中另外的光学检测器和二向色性光学元件的定位与光学检测器622a-622d(诸如在收集光学器件618和二向色性光学元件624之间或者在相邻的检测器之间)和/或选定子光束波长的相关联的色差聚焦相关。例如，可以利用侧向散射检测系统632而不是侧向散射检测系统616来检测特定波长(诸如UV)的大的焦点变化。在一些示例中，包括消色差或复消色差分布的收集光学器件618的色差聚焦分布可以使在波长上相对间隔开的选定波长具有相对接近的焦点变化。
在图7中示出了检测系统700的示例，检测系统700被设置成检测来自多波长照射光束702的光，多波长照射光束702被流入或流出图7的平面的流式细胞仪靶704所散射。前向散射检测系统706包括被设置成遮挡入射的前向散射光束710的中心部分的遮挡杆708。收集光学器件712被设置成收集前向散射光束710并将其引导至光电倍增管714或其它合适的光学检测器。侧向散射检测系统716包括诸如高数值孔径透镜之类的收集光学器件718，收集光学器件718被设置成收集多波长检测光束720并将其引导至光学图像滤波单元722和波长特定的光学检测器724，诸如雪崩光电二极管。在一些示例中，可以对高数值孔径透镜进行色彩校正。光学图像滤波单元722可以包括多个光学滤波器，以接收和滤波多波长检测光束720的相邻入射散射光束，并且光学图像滤波单元722可以将滤波后的侧向散射光束光学耦合到光纤726中，光纤726将耦合光束引导到相应的波长特定的光学检测器724。
图8A示出了光学图像滤波单元800的示例，光学图像滤波单元800利用诸如颜色校正的多元件高数值孔径透镜之类的收集光学器件804光学地耦合至流式细胞仪靶802。光学图像滤波单元722的一些实施例可以包括光学图像滤波单元800。在代表性示例中，流式细胞仪靶802在流动池803中传播，并且收集光学器件804凝胶耦合至流动池803以接收光。具有不同的相应波长λ1、λ2、λ3的多个激光束806a、806b、806c形成多波长照射光束，并且通常平行地指向流式细胞仪靶802，并且使得激光束806a-806c的各个束焦点位于流式细胞仪靶802处或附近。收集光学器件804收集激光束806a-806c的相应波长的弹性侧向散射光，并形成且将相应的检测光束808a、808b、808c定向到多个相应光纤810a、810b、810c。光纤810a-810c包括相应的第一端812a、812b、812c，第一端包括相应的孔径814a、814b、814c，这些孔径被设置成分别接收聚焦的检测光束808a-808c。光纤810a-810c的相应的相反端可以光学地耦合到相应的光学检测器，诸如雪崩光电二极管。在一些示例中，光学图像滤波单元800可用作在流式细胞仪的流动池荧光/散射收集光学器件的相对侧上的常规流式细胞仪的模块化附加装置。
在另外的示例中，光学图像滤波单元800可以用于提高高分辨率仪器上每个激光器的特定荧光团的分辨率。光学图像滤波单元800可以增加用于在特定波长下进行检测的信噪比。将光学图像滤波单元800与选定的波长对准，包括荧光团的侧向散射和峰值发射波长，可以允许选定波长下的信噪比增加。常规的荧光细胞仪通常经过优化，以检测几种颜色的荧光，因此对于不在所选波长的最佳焦点处的信号，其信噪比会降低，因为选定波长下收集角度的减小会减少到达检测器的光量。另外，常规的流式细胞仪不能在多个通道上检测到侧向散射，因为可以在单个通道上实现前向散射和侧向散射之间的典型大小粒度比较。
在一些示例中，孔径814a-814c可以是圆形的，并且也可以形成为狭缝，狭缝的较长尺寸平行于流式细胞仪靶802的移动方向延伸。图8B至图8D示出了孔径815a、815b、815c的其它示例。垂直轴817a、817b、817c可以对应于流式细胞仪靶802的移动方向。在一些实施例中，可以基于不同波长(以及相应的散射颗粒)的特征标记，选择不同的孔径几何形状，包括在不同的所选波长之间。在一些示例中，基于与其它颗粒或散射波长相关联的所选米氏共振的减少来选择几何形状。在区分纳米颗粒的存在或不同类型的纳米颗粒之间，孔径几何形状的选择可以有助于光谱解卷积或改善散射直径关系。在一些示例中，选定的孔径几何形状不必在一个或多个轴上对称。
在不同示例中，狭缝或圆形孔径的宽度(直径)可以延伸50μm或更小、100μm或更小、200μm或更小、300μm或更小或者500μm或更小，并且可以关于聚焦激光束806a-806c的图像尺寸、光纤810a-810c的波导尺寸以及光纤810a-810c的数值孔径定义孔径尺寸，光纤810a-810c的数值孔径可以小于收集光学器件804的数值孔径。可能有其它尺寸，然而，关于聚焦激光束806a-806c的图像尺寸的较窄狭缝尺寸可以提供改善的光学噪声滤除效果，包括与背景噪声相关联的入射检测子光束(例如检测光束808a)的波长的光。背景噪声可以包括与绕着流式细胞仪靶802延伸的衍射环相关联，并且处于由入射到流式细胞仪靶802的入射检测光束808a和对应的照射光束(诸如激光束806)形成的平面中的光。
在一些示例中，第一端812a-812c耦合到相应的平移台816a、816b、816c，这些平移台耦合到平移台控制器818，并且被设置成沿着一个或多个方向，包括沿着入射检测光束808a-808c的方向(例如，如图8A中所示的z轴)分别平移第一端812a-812c。独立平移可以提供小调整，这些小调整可以允许相应的第一端812a-812c沿着入射检测光束808a-808c的方向彼此间隔开，以校正检测光束808a-808c之间的聚焦距离变化，聚焦距离变化与收集光学器件804的色差聚焦分布相关联。在一些示例中，平移台816a-816c被设置成分别沿侧向方向(例如，如图8A中所示的x轴)平移第一端812a-812c，侧向方向大致垂直于入射检测光束808a-808c的传播方向和流式细胞仪靶802的流动方向。
在一些实施例中，孔径814a-814c被设置在相应的光学块820a、820b、820c上，这些光学块例如通过经由插入来接收端面822a-822c、通过光学融合在一起、通过在空气或另一介质中间隔开，或者以其它方便的方式光学耦合至光纤810a-810c的端面822a、822b、822c。光学块820a-820c的示例材料可以包括金属，诸如阳极氧化铝。在一些示例中，光学块820a-820c的与孔径814a-814c相邻的区域是光学吸收性的(通常是宽泛的)并且是非荧光性的，以便减少入射或反射的杂散光，否则这些杂散光可能会光学耦合到一个或多个光纤810a-810c中，并且会降低信号质量。在另外的实施例中，基于波导几何形状(例如，圆形芯或矩形狭缝形芯)或与所选孔径形状相对应的选择性反射涂层应用，在光纤的相应端面822a-822c上限定孔径814a-814c。
图9示出了流式细胞仪中的纳米标签检测的方法900的示例。在902处，利用照射源产生多波长照射光束，并将多波长照射光束导向流式细胞仪靶。在904处，通过流式细胞仪靶对多波长照射光束进行弹性侧向散射，并且在906处，对通过弹性侧向散射多波长照射光束形成的多波长检测光束的多个检测子光束进行检测，以便确定响应于多波长照射光束的不同波长的不同纳米标签的存在。
图10示出了组合多波长照射光束以对准流式细胞仪靶的方法1000的示例。在1002处，利用诸如超连续谱激光器的宽带源产生宽带多波长照射光束。在1004处，将宽带多波长照射光束分成多个照射子光束，每个照射子光束都具有不同的波长子带。在1006处，将照射子光束沿着不同的相应光路指向流式细胞仪靶，使得照射子光束基于不同波长子带的色彩聚焦距离变化而聚焦在流式细胞仪靶上。在一些示例中，宽带多波长照射光束和单独的照射子光束可以在流式细胞仪靶中产生弹性散射，弹性散射产生多波长检测光束。可以通过借助于棱镜布置将多波长检测光束分成根据波长而分离的多个检测子光束，来检测多波长检测光束。可以用微透镜阵列接收检测子光束，该微透镜阵列具有被设置成分别聚焦检测子光束的相应微透镜，并且检测子光束可以用微透镜聚焦到光学检测器的相应检测器通道。
图11示出了检测通过多波长照射光束形成的多波长检测光束的方法1100的示例，该多波长照射光束包括在空间上相邻、共线或聚焦到流式细胞仪靶的公共位置的多个单色激光束。在代表性示例中，将收集光学器件光学耦合至流式细胞仪靶。在1102处，通过至少一个二向色光学元件从收集光学器件会聚性地接收多波长检测光束，以将多波长检测光束分离成多个检测子光束，每个检测子光束都对应于多波长检测光束的不同单色波长之一。在1104处，利用与二向色性光学元件成间隔关系设置的相应光学检测器来接收检测子光束，该二向色性光学元件基于由收集光学器件提供的聚焦距离和检测子光束之间的焦点的光路长度差，该光路长度差与收集光学器件的色差分布相关联。
图12示出了检测流式细胞仪靶的相反两侧上并且垂直于流动的多波长检测光束的方法1200的示例。在1202处，用第一组收集光学器件接收多波长检测光束的第一部分。在1204处，用光学检测器检测具有第一波长的第一部分的检测子光束。在1206处，通过被设置成相对于流式细胞仪靶与从第一收集光学器件相反的第二组收集光学器件接收多波长检测光束的第二部分。在1208处，通过与第一收集光学器件的色差聚焦分布相关联的第一组收集光学器件，基于具有第一波长的检测子光束和具有第二波长的检测子光束之间的聚焦距离共通性和聚焦距离差中的一个或两个，单独地检测第二部分的具有第二波长的检测子光束。
图13示出了利用光学图像滤波单元检测从流式细胞仪靶接收的多波长检测光束的方法1300的示例。在1302处，将多个单色激光束聚焦在流式细胞术靶的相邻位置。在1304处，收集光学器件将弹性侧向散射的检测子光束引导至在相邻光纤的第一端处的相应的孔径，包括圆形孔径或狭缝孔径。在代表性示例中，基于与收集光学器件的色差聚焦分布相关联的检测子光束之间的聚焦距离变化，孔径沿着子光束的共同传播方向相对于彼此间隔开。
图14示出了微流控装置1400的配置的示例，微流控装置1400被设置成在包括连续波长范围的多个波长下检测弹性散射或准弹性散射。在一些示例中，超连续谱白色激光器1402或包括多个单色激光器或宽带源的替代类型的多波长照射被光学耦合至光束整形光学器件1404，光束整形光学器件1404被光学耦合至微流控或其它流控装置的询问室1406，样本1408悬浮在询问室1406中。来自被照射的样本1408的准弹性颗粒散射在通过视频记录装置1412记录之前与一个或一系列收集光学器件1410耦合。在代表性示例中，视频记录装置1412为3-D高分辨率、高灵敏度、高帧率、光场彩色记录装置。
示例1：纳米标签组分的光谱特性
具有光学特性的单个分子纳米标签包括可单独量化的高弹性散射功率核心或具有高非弹性散射(荧光或拉曼散射)的成分，因此使得能够基于与感兴趣的单个表位的结合来检测和分选EV或其它纳米材料。表型化子集是一种功能强大的工具，其需要一次标记多个表位。为了同时标记多个表位，使用具有独特光学特性的第二个或多个纳米标签将它们彼此区分开将是有益的。如图23中所示，不同的金属相对于折射率和消光系数在UV-可见光谱中具有独特的分散特性。这些光学特性，诸如图24中所示的那些光学特性，可以在诸如RefractiveIndex.info的在线数据库中找到。
分子纳米标签可以使用具有不同组分的纳米颗粒的特征光学特性，以允许利用弹性侧向散射检测信号而非荧光检测信号对单个分子靶进行表型化。使用基于米氏理论的激光散射物理模型研究了不同纳米颗粒直径和组分的散射特性，并基于预测的散射特性选择了可以适用于流式细胞仪检测的纳米标签组分。使用米氏理论，可近似估计球体的散射横截面，并因此推断出由于在不同波长下的散射分布中有明显的峰或谷，可以如何同时区分多个颗粒。这种方法可用于预测具有多个侧向散射(SSC)检测器的流式细胞仪在不同激光波长下的能力，诸如通过AstriosEQ，例如405nm SSC、488nm SSC、561nm SSC、640nm SSC，检测不同直径和组分的颗粒。
这种建模技术被应用于不同的材料，包括金、银、聚苯乙烯、铂、二氧化钛、氧化铁和铜，参见图15A至图15D。如图15A至图15D中所示，较小的颗粒，大约20-60nm的球体，产生了独特的光谱峰和谷，诸如金和银。另外，可以看出，预测金属(诸如金、铜和银)以增强颗粒检测(例如，与聚苯乙烯相比)。例如，20nm的Ag球在380nm的照射波长下的散射横截面为～1x10-16 m2 sr-1，而40nm的Au球在532nm的照射波长下的散射横截面为～1x10-16 m2 sr-1。
具有不同组分的颗粒的这些固有散射特性将允许光谱方法进行标记，因为使用了荧光，然而可以通过采用散射来代替。例如在图15B和图16A中，在405nm的照射波长下，60nm银颗粒的收集光散射是60nm金颗粒的约100倍。然而，在561nm的照射波长下，60nm金颗粒的收集光散射比60nm银颗粒高5-10倍。通过在Astrios EQ仪器上以405nm、488nm、561nm和640nm的照射波长采集60nm的银和金球体来验证这种建模数据，从而获得了如何利用光谱散射的原始见解(图16B)。正如模型预测的那样，在561nm散射通道上收集的60nm银颗粒(红色或浅灰色)的散射比60nm金的散射(蓝色或深灰色)少，而在405nm散射通道上收集的60nm银颗粒的散射大于60nm金。
因而，基于人们可以在其仪器上使用的特定SSC，可以选择合适的材料制成本文所述的分子纳米标签。例如，如果仪器具有405nm SSC检测器，则可以使用银纳米颗粒；例如，如果仪器具有561nm或532nm SSC检测器，则可以使用金纳米颗粒，依此类推。下表1显示了具体示例。
| 纳米颗粒材料示例 | 峰值SS检测器波长 |
| 银纳米球 | 350至500nm，诸如405nm |
| 金纳米球 | 500至650nm，诸如532nm、561nm |
| 金纳米海胆 | 650至800nm，诸如700nm |
| 银和金 | 银和金之间，取决于组分的比例 |
表1.示例纳米颗粒和相关的峰值SSC波长
图17至图17B示出了从20nm和40nm金和银颗粒收集的散射的关系，以便确定金和银纳米颗粒之间的光谱解卷积分析的实现。绘制了金和银纳米颗粒的收集的散射以及银散射与金散射的比率。Ag/Au线表示Ag与Au的收集的散射功率之比。黑色虚线表示Au的收集的散射功率。点划线表示Ag的收集的散射功率。水平线表示金和银的散射功率比率为1。虚线表示100nm金的收集的散射功率。银与金的散射比率可以用于确定在哪些波长下来自银颗粒的散射光将比金的散射光更多(在Ag/Au＝1水平线以上——350nm至510nm)，以及金颗粒的收集的散射将大于银颗粒的收集的散射(在Ag/Au＝1水平线以下——510nm至800nm)。单色激光照射波长作为垂直线覆盖在图表上，以显示可以用于光谱散射检测的光谱照射的一种实现方式。
收集光学器件的收集角度和几何形状可以影响颗粒散射与其直径和组分之间的关系(如图26A至图26B所示)。创建了上述模型的第二变化(图18A)，从而针对40nm Au、40nmAg和100nm聚苯乙烯(PS)，通过以2度增量从20至60度的典型流式细胞仪收集半角度对模型颗粒进行分层。具体的光谱特性可以在图17A中看到。图18A示出了收集半角影响由光学检测器收集的散射功率。然而，图18B示出了当覆盖所有收集半角的银与金的比率重叠时，该比率保持不变。由于球体处于瑞利范围内，并且各向同性地散射光，因此可以使用一种解卷积方法来检测具有不同收集半角的仪器上的球体。图21A至图21B示出了侧向散射收集光学器件的收集角度对金和银之间的散射关系的影响，所述金和银之间的散射关系以30度的收集半角建模，直径范围为0至500nm。
基于上述模型和发现，创建了在AstriosEQ上使用405、488、561和640nm照射波长进行金和银光谱解卷积的方法。图22A和图22C示出了通过照射波长分层的不同直径的金和银纳米颗粒的模型化的、收集的散射功率。图22B和图22D示出了与建模数据相比较的金和银纳米颗粒散射的实际性能，以便验证本文的光谱建模技术。这种数据再次表明，预测的建模数据和采集的数据具有高度的可比性。在一些示例中，图22B和图22D中所示的数据可以被用作代表性的参考珠组，代表性的参考珠组由不同的分子纳米标签核心材料组成，用于流式细胞仪仪器校准并获得解卷积算法的参考值。解卷积算法可以使用采集的参考珠数据来校准仪器，以允许针对每个波长进行颗粒散射建模(图20A至图20B)。可以基于采集的信号的光谱散射特性和仪器的散射模型对校正后的采集信号进行解卷积。例如，采集信号h可以对应于散射的颗粒光谱分布f，该分布通过函数g进行卷积(*)，函数g可以具有各种函数分量，这些函数分量用于遮盖散射的光谱分布f，包括来自流式细胞仪靶中的其它颗粒的散射、仪器特定的响应特征以及噪声。在一些示例中，仪器特定的响应特性可以通过部件选择进行调整(例如，宽带或超连续谱照射源、流式细胞仪靶在其中流动的比色杯几何形状、诸如NA的收集透镜特征、狭缝孔径几何形状、通过检测器和/或滤波器选择的检测器灵敏度调节)，以便使检测灵敏度与米氏共振匹配或明确不匹配。在实施例中，设置多个检测单元以检测侧向散射，每个检测单元具有包括不同的预定收集角度的收集透镜，以便在检测期间利用米氏共振。在进一步的实施例中，单个检测单元可以被配置成在检测期间利用米氏共振。在代表性示例中，可以对流式细胞仪收集光学器件进行建模以提供对收集光学器件收集角度的预测，可以对该预测进行验证以对应于实际收集角度。可以用已知大小和折射率的珠对代表性仪器进行校准。可以基于检测到的散射特性和收集角度来推断检测到的颗粒的直径或折射率。散射特性和收集角度还能够用于辅助对包含关于具有不同光谱散射特性的多个不同颗粒的信息的检测信号进行解卷积。在不同的示例中，可以检测到不同大小的纳米标签，或者可以检测到相同大小但具有不同光谱特征的纳米标签，或者可以检测特定的EV，包括带有附着的纳米标签的EV。
通过在BD FACS Symphony流式细胞仪上获取各种金和银纳米颗粒，还显示了其它商用流式细胞仪检测单个金和银纳米颗粒以显示其作为检测技术的适用性的能力(图25)。
示例2：用于检测纳米标签的示例性激光对准
将纳米标签用于基于在多个侧向散射波长下的侧向散射检测的表位检测可能依赖于不同颗粒组分的弹性散射。因此，代表性实施例使用具有跨紫外可见光谱的波长或波长范围的多波长照射输入，以便增加可以同时使用和检测的纳米标签组分的数量。在不同的示例中，能够检测纳米标签的光学设备可以使用超连续谱白色激光源，诸如图1和图2A中所示的那些激光源，通过示例的方式，以便提供纳米标签的宽光谱照射。在另外的示例中，可以使用单色激光。在一些流式细胞仪系统的示例中，可以将分离的光束布置成空间上分离的波长，作为共线对准的波长，或者为其它配置。流式细胞仪照射光束输入示例可以说明波长特定焦距的差异，以确保激光束的最高强度部分聚焦在流式细胞仪靶的核心流上，例如，如图2A至图4A中所示。在一些示例中，滤波器还可以用于在空间上分离不同波长的激光束。在具有白光超连续谱光源的一些示例中，可以在滤波器之前、之间或之后包括光束整形光学器件。在单色激光源的情况下，光束整形光学器件本身或光束定向镜可以移动以在空间上分离激光束。
示例3：使用白光以检测纳米标签
可以使用白色或宽带的光照射(例如，代替单色激光)来检测所公开的分子纳米标签。可以通过下列步骤实现单分子纳米标签的光谱散射分析：将具有白光照射的检测光束引导通过棱镜组件从而基于波长分离照射；借助于微透镜阵列聚焦分离的光束；以及借助于PMT/APD检测器阵列(诸如32通道的PMT/APD检测器阵列)检测聚焦的光束。在该示例中，全光谱散射流式细胞仪可以使用超连续谱白激光，其提供所有紫外线可见波长的照射。白光可以聚焦在核心流中的悬浮颗粒上。使用高数值孔径的色彩校正透镜可以垂直于照射光收集颗粒光散射。这种光聚焦在一系列棱镜上，以分离多个波长的光，这些波长的光顺序地聚焦在多通道光电检测器上，该多通道光电检测器提供紫外可见光谱散射检测。带通滤波器可以位于棱镜和多通道光电检测器之间。在一些示例中，选定的通道可以检测更大波长范围内的散射，以提高检测灵敏度。可以使用光束整形光学器件或光束整形系统，以使多波长照射的焦点变化很小。例如，来自白光源的多波长照射可以被分成照射带，并与多个光束整形光学器件共线对准。
示例4：纳米颗粒散射和流式细胞仪建模
为了对流式细胞仪从给定的具有预定直径和折射率的颗粒接收的光量建模并产生散射直径曲线，诸如图20B所示，使用HAD(半角确定)建模脚本来确定收集半角，参见图20A。这种建模方法建立在Welsh,Joshua(2016)Flow cytometer optimisation andstandardisation for the study of extracellular vesicles as translationalbiomarkersUniversity of SouthamptonDoctoral Thesis,209pp的工作基础上，这种技术最初被设计用于产生散射直径关系曲线(图26B)，并使用已知直径和折射率的颗粒确定流式细胞仪仪器(图20A)的收集半角(在此通过引用以其整体并入)。这种确定到达光电检测器的光的极限收集角度的方法允许对流式细胞仪进行进一步建模，诸如“仅预测曲线”1000方法或“波扫描”2000方法和“波扫描”3000方法。
如图19A中所示，“仅预测曲线”1000方法用于预测在不同波长和收集角度下的各种直径颗粒的散射关系，无需将获得的流式细胞仪数据拟合/归一化到预测的颗粒散射数据。从“HAD方法”将AuRI 116和AgRI 117脚本添加到一组先前开发的脚本(114、115、200、201、202、203、220、221、222、223、2200、2210、2220)中，以便将金和银两者的光学特性输入该模型。
该方法可以用于预测在不同照射波长下具有不同组分的纳米标签的散射功率的收集差异，参见21A至图21D。这种了解每种组分收集到的颗粒散射的方法允许识别具有最佳分离度的直径/组分，从而允许区分采集的数据。例如，如果具有带有散射收集光学器件的405nm照射激光流式细胞仪配置并且将两个40nm球体用作标记，则它们的组分可以使用图21A确定，其中40nm的聚苯乙烯球和银球显示出最高的分离度。
“仅预测曲线”1000方法的外推法是“波扫描”2000和3000方法，参见图19B至图19C，这些方法被设计成为一组具有已知直径和组分的颗粒找到最佳照射波长，由此能够设计用于颗粒纳米标签组分的照射或收集光学器件。对于所讨论的流式细胞仪(已知或使用“HAD”方法确定)，跨紫外可见光谱的多个波长(图19B)，或跨多个收集半角的设定分子纳米标签尺寸(图19C)，也可以通过分析不同分子纳米标签组分在预定半角下的光谱散射特性来使用这些方法以帮助光谱解卷积。
脚本2000、3000两者都使用通用的下标，但是被实现为提供不同的输出。可在2017年10月23日提交的名称为“Molecular Nanotags”的相关PCT申请中找到与此类脚本有关的图和描述，该申请通过引用以其整体并入。脚本2000对预定直径的各种颗粒组分在UV-可见光谱中的波长上的散射功率进行建模。脚本2000可以提供不同颗粒组分的光谱散射特性的估计，以便确定或选择对于特定波长具有合适散射特性的组分。而且，建模方法2000的输出可以为应用于光谱散射检测的通用光谱解卷积算法提供基础。“波扫描”3000通过收集角度将颗粒在多个波长上的散射功率分层。因此，可以研究收集角度对颗粒散射直径特性的影响。使用“波扫描”3000方法，可以示出金和银的纳米标签组分之间收集散射功率的比率由于颗粒各向同性地散射光而与收集角度无关地保持，参见图18A至图18B。
此外，通过理解诸如金和银的不同的纳米标签组分的光谱散射特性，在单色激光二极管源的情况下，可以推断出最佳照射输入，参见图17A至图17B。图17A中示出40nm金球和银球、100nm聚苯乙烯球的光谱散射特性，以及在每个波长下银与金散射的比率。如果流式细胞仪未使用宽照射源(例如超连续谱白激光)，则几个单色激光二极管源的实现将需要洞悉正被检测的纳米标签的光谱散射特性。在金和银的情况下，如图17A中所示，探测405nm、445nm、488nm、532nm、561nm的照射波长(所有这些波长都是市售的激光源)将从金和银照射波长相关的散射中的峰和谷提供足够的数据，以允许光谱解卷积。这已经以一种初始的方式，利用市售流式细胞仪(Astrios EQ)，通过在405、488、561、640nm波长下的照射和散射检测而实现，如图19A至图19B所示。
本文讨论的波长模型也建立在HAD脚本的基础上，然而，为了允许输入几种颗粒组分，将各种材料的分散特性输入数据库，以允许输入脚本，包括金：AuRI 116；银：AgRI 117；聚苯乙烯：聚RI计算114；铂：PtRI 118；二氧化钛：TiORI 2010；氧化铁：Fe3O4 RI 119；铜：CuRI 120和铅：PbRI 121。
示例5：光学孔径对检测到的颗粒散射的影响
已经证明，如图27中所示，通过使用分离指数(平均大珠散射功率-平均小珠散射功率)/(大珠散射功率标准偏差+小珠散射功率标准偏差)，使用狭缝孔径可以增加信噪比。较大的分离指数对应于较大的信噪比。在增加一个波长下的信噪比的同时施加狭缝孔径通常会损害其它波长的信噪比。这意味着其在常规流式细胞仪光学器件中的实现无法使其同时检测几种不同的波长，就像常规的细胞仪不能通过使用相同的激发波长检测以不同波长发射的不同荧光团一样。此外，利用光纤而不是固定光学器件的流式细胞仪上的收集光学器件在固定平面中收集光，因此对于一个散射波长使用狭缝孔径通常会损害另一激光的散射波长。这里讨论的光学图像滤波单元(OIFU)的实现方式可以调整到每个激光不同的收集波长。此外，它可以在流通池的另一侧实现，因此允许在保持荧光灵敏度的同时进行高灵敏度的散射检测。
尽管OIFU的使用提供了选择性散射波长的高灵敏度，但是与使用光谱散射波长检测的配置相比，在应用解卷积处理时，其使用受到了限制。通过仅使用选择性散射波长检测，通常可以使用有限程度的解卷积，这减少了可以使用的分子纳米标签的数量，最终导致了颗粒表型的能力降低。
光学孔径的实现与流式细胞仪散射模型的发展相结合，诸如图20B中所示，允许在流式细胞仪收集光学器件设计中获得进一步的理解。如图26A至图26B中所示，其收集角度和孔径类型可以影响颗粒的散射直径关系。可以看出，如果在具有10度收集半角的仪器上使用圆形光圈，则散射直径关系曲线中的米氏共振(谷)要比使用相同收集半角的方形收集孔径的那些谷更深。因此，可以使孔径特性(例如，几何形状)适合于感兴趣的颗粒的散射分布，以产生将有助于检测或解卷积的独特散射直径关系。
示例6：光谱分布比较和解卷积
如Welsh等人的，“Prospective Use of High-Refractive Index Materials forSingle Molecule Detection in Flow Cytometry,”Sensors 2018,18,2461；doi:10.3390/s18082461(通过引用以其整体并入)中所述，本文所述的建模方法可以用于表征各种流式细胞仪的灵敏度，以确定纳米标签(或其它颗粒)尺寸(通常为直径)和折射率的检测极限。一经表征，便可以使用本文所述的光谱分析方法，包括在一些示例中通过对现有流式细胞仪仪器进行改造，通过解卷积侧向散射检测信号并将数据与不同组分和/或尺寸的颗粒的特征光谱分布进行比较，确定流式细胞仪靶中纳米标签和其它颗粒的存在。在代表性示例中，特征光谱分布可以通过强度随选定光谱范围内的波长的变化来定义，并且在一些示例中，这样的比较和解卷积可以提供单颗粒检测。
如Welsh等人所述，细胞外囊泡(EV)是小(30-1000nm)膜状囊泡，大部分直径小于150nm。由于其表面积小，所以与细胞相比，大多数EV表面标志物的表位表达低于传统的高通量、多参数检测技术(诸如流式细胞仪)的可检测范围。
当前的流式细胞仪能够区分数千至数百个荧光分子。高度丰富的淋巴细胞表面标记(诸如CD14)的表面表达在每个淋巴细胞100,000份左右。如果将该表位密度缩放至100nmEV，则相当于每个囊泡的<30CD14份。因此，EV领域未满足的需求是开发能够在单个EV上进行单表位检测的标签，理想地利用当前可用的检测设备和流式细胞仪。
当前基于荧光的流式细胞仪使用荧光探针定量蛋白质的表达，荧光探针倾向于为荧光缀合抗体的形式。尽管这些荧光探针已被证明是免疫学领域细胞分析的有力工具，但以它们目前的形式，它们不足以量化大多数可用流式细胞仪上的EV表面蛋白表达。尽管出现了诸如QDots之类的新一代荧光标记，但它们通常不足以实现低表面表位定量。由于随机光学波动(通常称为“闪烁”)，将QDots用作用于限时检测单个靶的标签也很复杂。
当分析的目标是枚举样本中特定标记为阳性的EV数量时，枚举方法必须能够检测具有一个或多个特定表面标记的每个EV。在这种情况下，重要的是使用标记物和能够检测单个标记物且具有单个标记物灵敏度的仪器。另一方面，当目标是量化或比较单个EV上存在多少个受体时，必须具有恒定的标记物与靶标比率，并且EV上的单分子检测和表面受体量化需要具有单价靶标结合位点的标记物。枚举EV时，还应考虑其它标准化步骤，诸如稀释液控制、MESF珠和/或散射建模。利用QDots的大多数市售技术以多价形式使用这些标记物，但是已经出现了尝试产生单价QDots的新途径，该单价QDots可以直接转移到其它纳米颗粒的结合中。
本文所述的新一类的纳米分子标签(NanoTag)可以使用流式细胞仪进行单个标记物并因此进行单个分子的检测。在代表性示例中，纳米标签可以由具有高折射率和/或高光学吸收以及独特的光谱散射特性的材料组成，这将使低表位数枚举和小颗粒(诸如细胞外囊泡)的光谱表型都能够实现。如本文所述，显示出可以选择纳米标签组分以用于明确的光学检测，并且可以同时使用纳米标签组分以进行颗粒表型并且仍然彼此区分。分析基于纳米颗粒对波长依赖性光散射的数值建模以及与流式细胞仪数据的比较。
为了首先识别具有有助于增加光散射的有用光学特性的颗粒，整理了折射率和消光系数。文献中针对以下组分汇编了300-800nm波长范围内的颗粒折射率和消光系数：金、银、氧化铁、二氧化钛、铜、铂、铅和锆。使用相应的Sellmeier方程在每个波长下计算聚苯乙烯和水的折射率。基于纳米颗粒的可用性和高折射率(例如，二氧化钛)或消光效率(例如，铅)或具有中等折射率和消光系数(例如，金、银、铜)，进一步缩小了组分选择。
流式细胞仪测量是在MoFlo Astrios EQ(美国印第安纳州印第安纳波利斯Beckman Coulter Life Sciences公司)和FACS Symphony(美国新泽西州富兰克林湖的BDLife Sciences)流式细胞仪上进行的。Astrios EQ是一种带有5个激光器(355、405、488、561和640nm波长)的空中喷射系统，并可以在405、488、561和640nm下进行侧向散射收集(SSC)检测。有关Astrios EQ的设置和检测阈值的详细说明，请参见文献。FACS Symphony是一种具有5个激光器(355、405、488、532和640nm)的细胞分析仪，只有在默认装置配置下，才可以在488nm下进行SSC检测。通过SSC进行枚举的仪器参数被设置为触发阈值200、电压350和低流率。为了测量散射功率与直径的关系，在0.1–1x108颗粒/mL浓度下分析NIST可追踪的聚苯乙烯珠(直径100、125、147、203、296、400、600、799、994nm)(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific,受益于E.van der Pol)和二氧化硅珠(182、315、359、405、548、800、1000nm)(荷兰阿姆斯特丹Kisker Biotech,受益于E.van der Pol)并使用先前发布的流式细胞仪方法确认了预测的散射与获得的散射的拟合。
对于高折射率颗粒采集建模比较，将直径为20、40、60、80和100nm的Ag颗粒(加拿大安大略省伯灵顿的Cytodiagnostics)，直径为20、40、60和80nm的Au颗粒(Cytodiagnostics)和100nm聚苯乙烯NIST可追踪珠(Thermo Fisher Scientific)和200nm荧光聚苯乙烯珠(Thermo Fisher Scientific)稀释至0.1–1x107颗粒/mL之间的浓度，然后在每种仪器上进行采集。如图28A至图28F中所示，对40、60、80nm的Au颗粒进行线性稀释以确认维持单颗粒检测的工作细胞仪采集浓度。即，在图28A至图28B中示出了40nm Au纳米颗粒的系列稀释，在图28E至图28F中示出了80nm Au纳米颗粒的系列稀释。将金纳米颗粒稀释到1e7、1e6和1e5颗粒mL-1，并以1e7颗粒mL-1加标200nm荧光聚苯乙烯珠。将检测到的Au与200nm聚苯乙烯的比率对所制备的Au浓度作图。可以看出，稀释的金与加标珠的比例与制备的金浓度的比值呈线性下降。这指示了单颗粒检测。此外，在不同稀释度下，颗粒散射信号没有明显的差异，进一步表明了单个颗粒检测。使用制造商百分比固体来确定颗粒浓度。使用纳米颗粒跟踪分析来确定加标颗粒浓度。
数据是使用Astrios EQ上的采集软件Summit Summit v6和FACS Symphony的Divav8采集的。数据采集完成后，从采集软件中导出文件，并将其导入FlowJo v10(TreeStar)中以进行采集后分析。可以在下列网站找到流式细胞仪文件：https://flowrepository.org/id/FR-FCM-ZYL7和https://flowrepository.org/id/FR-FCM-ZYL6。
上面测试的几种不同的流式细胞仪仪器据称具有很高的荧光分子检测灵敏度。然而，在测量了MESF值的检测下限(近似于等效可溶性荧光团(MESF)分子检测)后，发现即使是所测试的最敏感的仪器也只能检测>25的荧光分子的对象。这种基于灵敏度和荧光的方法不足以检测细胞外囊泡的成分，这可能是因为在数量上低至每个囊泡1或2个分子。该数据进一步支持了从诸如金属之类的标记物中检测侧向散射光谱的重要性。因而，本文公开的技术的代表性示例可能分析荧光和非荧光的光散射。
为了提供用于纳米颗粒检测的光谱分布，使用MATLAB v9.3.0(美国马萨诸塞州内蒂克市的MathWorks公司)对流式细胞仪和颗粒光谱散射进行了数值建模。使用米氏理论计算固定直径(20、40、60、80、100nm)的球形颗粒散射的到达检测器的光的累积功率，并使用基于Matzler的那些脚本对脚本进行数字化实现，Matzler描述了米氏散射和吸收的函数。所使用的计算类似于van der Pol等人和Fattaccioli等人的计算。该软件可从以下网站获得：http://www.joshuawelsh.co.uk/scatter-diameter-software/(通过引用并入本文)。颗粒光散射建模侧重于侧向散射，也就是垂直于照射方向收集的光。Astrios EQ流式细胞仪的侧向散射收集光学器件具有圆形收集孔径，其限制半角约为29°。使用水的光学特性对颗粒悬浮介质进行建模。为了产生散射功率(或等效地，散射横截面)关于颗粒直径的曲线，所以将模型化数据与实验数据进行拟合，使用van der Pol等人的方法，使用单个比例因子在模拟散射横截面和实验测量的功率水平之间进行转换而执行。使用来自建模的预测的值与采集的值之间的线性回归，将流式细胞仪数据从任意单位转换为以nm2为单位的散射横截面。
使用配备有405nm LM12模块和EMCCD相机(英国贝尔法斯特安道尔公司DL-658-OEM-630)的具有NanoSight LM10仪器(英国，马尔文公司)的NTA测量金和银的粒径分布和浓度。使用14级相机，通过NTA软件v3.2进行视频采集。每个样本捕捉了三个30s视频。采集后视频分析使用以下设置：最小追踪长度＝5，检测阈值＝4，自动模糊大小＝2次通过，最大跳跃大小＝12.0。
使用本文所述的流式细胞仪颗粒散射建模方法，可以将散射直径关系(诸如图20B中所示)与文献中的参考折射率和消光系数相结合，以预测可以检测到哪些粒径和组分。已经对Astrios EQ细胞仪的侧向散射收集光学器件进行建模，以确定在紫外可见光谱范围内的Au和Ag纳米颗粒的相对检测到的散射功率，如图29中所示(并且也可以在图15A至图15D中看到)。还对其它组分(铂、二氧化钛、氧化铁、铜、铅、锆)进行了建模，如关于图15A至图15D中的波长的横截面光谱分布所示(类似于强度和功率)。在解卷积过程中，可以使用每个分布的组分和大小之间的光谱变化差异来识别流式细胞仪靶中的纳米标签和其它颗粒。通常，通过在多个波长下进行检测来提高光谱检测能力可以提高多波长检测信号解卷积期间颗粒识别的置信度。
由于可以在各种流式细胞仪平台上检测到它们，因此使用100nm聚苯乙烯(PS)珠作为横截面散射参考，可以从图29中看出，以约400nm照射的20nm银纳米颗粒具有比100nmPS颗粒更高的散射横截面。此外，在约532nm的照射波长下，40nm的金颗粒超过了100nm PS球的散射横截面，而40nm的Ag颗粒在约350-450nm的照射波长范围内具有高散射横截面。此外，除硒化镉、氧化铁和二氧化钛外，所有组分的60nm球在大部分紫外可见光谱范围(在落入红色光谱区域(>700nm)之前)内都具有比100nm PS球更高的散射横截面。
如图25中所示，在Astrios EQ和FACS Symphony仪器上对PS、Au和Ag纳米颗粒进行分析，以确定使用488nm的常规散射收集波长是否可检测到颗粒。未染色的100nm PS珠在两种仪器上均可分辨。在两种仪器上100、80、60和40nm Ag颗粒均可与背景区分开，其中40nm群在Astrios EQ和FACS Symphony上仅与背景噪声部分解析。在任何一种仪器上均未解析到20nm的Ag或Au颗粒。80、60和40nm Au颗粒在两种仪器上均被解析，同样地，40nm Au仅在每种仪器上部分解析。
使用Astrios EQ的多波长建模研究PS、Au和Ag颗粒(如图22C所示)，并将它们与从488和561nm SSC通道采集的数据进行比较(如图22D中所示)。还对在405、488、561、640nm下的建模数据和采集数据进行了比较。使用仪器背景噪声作为参考，40nm Ag颗粒在561nm、488nm和405nm SSC通道上部分解析，而在640nm SSC通道上未解析。40nm Au颗粒在561nm和488nm SSC通道上完全解析，在640nm SSC通道上部分解析，在405nm SSC通道上未解析。100nm PS颗粒在488nm和561nm SSC通道上完全解析，在405nm SSC通道上部分解析，而在640nm SSC通道上未解析。所有其它颗粒都可以从所有SSC通道上的仪器背景噪声中解析出来。
在图22C和图22D之间的相似性中可以看出，在所有通道上的Au、Ag和PS颗粒散射之间的关系在建模的数据和采集的数据之间得到了很好的保持，Au颗粒在488nm和561nmSSC通道之间的散射呈线性增加，PS颗粒看起来也线性增加，但是在488nm下比Au散射增加，并且Ag看起来在488nm和561nm散射通道之间线性散射，之后开始在488nm散射通道上在60-80nm之间逐渐消失，但是在561nm散射中继续增加。
为了在流式细胞仪中一次实现几个纳米标签的使用，基于可分辨的光谱散射特性选择颗粒，从而为通过解卷积提取和识别信号提供基础。显示出独特的光谱散射特性的两种材料的示例是60nm Au和Ag，如图30A中所示(类似于图18B)。通过绘制Ag与Au散射的比率，可以确定最可能发生分离的波长。可以看出，在510nm至800nm的逆过程发生之前，60nmAg颗粒将在350-510nm的波长之间散射超过60nm的Au颗粒。这种分离在从Astrios EQ采集的数据中得到证实，该数据收集了405、488、561和640nm的散射，如图30B所示(尽管未针对相对功率进行归一化)。然而，可以看出，与通过建模预测的一样，在561nm和640nm波长上逆转之前，采集的60nm Ag颗粒在405nm和488nm下具有比60nm Au更高的散射强度。因而，可以对包含具有附着的纳米标签的EV的流式细胞仪靶的侧向散射检测信号进行解卷积，以确定具有附着的纳米标签的EV的存在。
将CFSE染色的EV的散射特性与60nm Au和60nm Ag颗粒的散射特性进行比较，以显示它们用作标记物如何能够区分表位染色，如图31所示。可以看出，如果将CFSE染色的EV用Ag纳米标签进行阳性染色，则它们的488nm和561nm SSC通道强度将会增加。如果将CFSE染色的EV用Au纳米标签阳性染色，则它们的561nm SSC通道强度主要会增加。用Au和Ag纳米标签观察到的特征通道强度彼此不同，这些差异提供了一种在一个测定中标记两个不同表位或检测两个不同EV相关分子的方法。这些结果是基于图29和图22D中Au和Ag的散射特性而预期的。
根据所公开的技术，可以使用Astrios EQ和FACS Symphony流式细胞仪部分或完全解析由Ag或Au组成的直径为40、60和80nm的颗粒。然而，此类细胞仪可能被认为是更复杂的“高端”仪器，并非所有常规流式细胞仪都能检测100nm聚苯乙烯球(用作参考标准)。尽管本文中的仪器显示了在多个散射检测波长下检测40nm颗粒的能力，但可以获得颗粒检测方面的改进(更小尺寸、单个个别颗粒、多种颗粒类型)，包括同时检测和分析多个(>3)光谱散射标签。为了获得这样的改进，本文公开的示例仪器可以使用宽范围的照明波长，诸如利用超连续谱白激光以及多个散射检测通道。然而，使用现有的带有散射收集滤波器的流式细胞仪配置，仅使用一个或两个标记物是可行的。
由于有限的表面积以及因此EV上的表面蛋白质，所以对于目前直径大约为15nm的免疫球蛋白标记物，空间位阻可能会成为问题。尽管这存在问题，尤其是对于用一些在当前仪器上无法检测到的荧光团标记的免疫球蛋白而言，只有一个纳米标签需要与EV表面表位结合才能被检测到。100nm EV可以具有结合约20个松散堆积的15nm球形颗粒的能力。因此，纳米标签在EV中的浓度可能更低，不会使EV表面饱和，由此允许靶向于不同蛋白质的多个纳米标签结合。考虑使用纳米颗粒作为标记物时的另一个重要因素是它们的结合。许多现有的纳米颗粒标记物(诸如Qdots)会形成多价标记物。为了确保将单个纳米标签与EV结合，开发单价标记物将很有用。Qdots的单价标记先前已通过将DNA包裹在纳米颗粒上来证明。这种方法留下了可用于结合抗体、适体等的功能化的端基。
根据本文的示例，由于能够检测单个纳米标签而不与诸如EV的靶颗粒结合，所以区分标记的EV与未标记的EV的方法将是有用的。在一些示例中，所有EV均用嵌入膜颜料或非特异性染料(诸如CFSE)荧光标记。在与标记的EV结合后，可以识别纳米标签的荧光变化，以确定其是否标记了EV。在其它示例中，如果感兴趣的特定类型的EV例如为磷脂酰丝氨酸阳性，则可以使纳米标签对感兴趣的群体具有特异性，并使用针对EV子集的第二个纳米标签，例如CD9阳性。然后，对于具有绑定到它们的两个纳米标签(每个都有不同的散射特性)的EV，将出现唯一的散射分布。
因而，在代表性示例中，不仅可以使用现有的流式细胞仪检测到40、60和80nm的Au和Ag颗粒，而且还可以利用它们的光谱散射特性将它们彼此唯一地区别开，并且可以与用荧光标记的EV进行区分。在一些示例中，使用当前可用的标记方法，具有这种直径和组分的颗粒可用作多价或甚至单价检测标记物，用作用于单表位检测的手段并实现为单表位检测标签。使用分子纳米标签作为标记物利用了高折射率或高度等离子激元纳米材料的光散射特性，由此提供足够高的信号以使用当前可用的流动方法检测单个分子，因此可用作低表达、低散射靶，诸如EV。
因而，根据所公开的示例，分子纳米标签可用于填补可用检测方法中的现有空白。例如，当前没有可用的方法使临床实验室能够采集血液样本并确定每单位体积的血液中特定肿瘤标志物阳性的EV数。相反，当前的方法仅能够将EV结合到微米大小的珠上，并使用检测抗体来检测结合到较大珠上的EV。由于单个的分子纳米标签是可以单独解析的标记物，因此用少至一个分子纳米标签标记的受体检测EV是可行的。同样地，以确保标记物为单价的方式组装分子纳米标签可以枚举标记的分子的数量。这种分子计数是超越当前流式细胞仪标记物和仪器的计数能力的重大进步。
已经参考所示实施例描述和示出了所公开技术的原理，应认识到，可以在不脱离这些原理的情况下在布置和细节上修改所示的实施例。例如，以软件示出的所示实施例的元件可以以硬件实现，反之亦然。而且，来自任何示例的技术都可以与在一个或更多其它示例中所述的技术相结合。应明白，诸如参考所示示例所述的那些的过程和功能可以以单个硬件或软件模块实现，或者可以提供单独的模块。上面的特定布置是为了方便说明而提供的，并且可以使用其它布置。
鉴于可以应用所公开技术的原理的许多可能的实施例，应认识到，所示实施例仅是代表性示例，并且不应被视为限制本公开的范围。这些部分中具体解决的替代方案仅是例证性的，并不构成本文所述实施例的所有可能替代方案。例如，本文所述的系统的各种部件可以在功能和用途上组合。因此，我们要求保护所有落入所附权利要求书范围内的内容。
Claims (51)
1.一种微流控设备，所述设备包括：
照射源，所述照射源被配置成产生多波长照射光束并将所述多波长照射光束引导至能够包括纳米标签的微流控靶；
检测器，所述检测器被配置成从所述微流控靶接收多波长检测光束并产生检测信号，其中，所述多波长检测光束包括通过所述多波长照射光束与所述微流控靶中的所述纳米标签之间的相互作用而弹性地侧向散射的光；以及
处理器，所述处理器被配置成接收所述检测信号，并通过将所述检测信号的多波长侧向散射强度特征与一种或多种纳米标签类型的预定的多波长弹性侧向散射强度分布进行比较，确定所述微流控靶中所述纳米标签的存在。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，确定所述微流控靶中所述纳米标签的存在包括确定单个纳米标签的存在。
3.根据权利要求1所述的设备，其中，所述处理器被配置成基于所述比较而确定具有附着于细胞外囊泡的至少一个纳米标签的所述细胞外囊泡的存在。
4.根据权利要求1所述的设备，其中，所述处理器被配置成从所述检测信号确定同时存在于所述微流控靶中的多种纳米标签类型的存在。
5.根据权利要求4所述的设备，其中，所述多种纳米标签类型附着在共同的细胞外囊泡上。
6.根据权利要求1所述的设备，其中，通过使用所述预定的多波长弹性侧向散射强度分布对所述检测信号解卷积来执行所述比较。
7.根据权利要求1所述的设备，其中，所述纳米标签具有球形或非球形特征，并且具有与所述球形特征相关联的直径，或与所述非球形特征相关联的特征尺寸，其中所述直径或所述特征尺寸为100nm或更小。
8.根据权利要求1所述的设备，其中，所述弹性侧向散射强度分布对应于峰值散射。
9.根据权利要求1所述的设备，其中，所述纳米标签类型包括由金制成的一种或多种纳米标签类型和由银制成的一种或多种纳米标签类型。
10.根据权利要求1所述的设备，其中，所述一种或多种纳米标签类型包括具有在10nm至30nm的范围内选择的直径的纳米标签类型。
11.根据权利要求1至10中的任一项所述的设备，其中，所述照射源包括：
宽带照射源，所述宽带照射源被设置成产生具有预定波长光谱的宽带照射光束；并且
其中，所述设备包括波长分离系统，所述波长分离系统光学耦合至所述宽带照射光束并且被设置成将所述宽带照射光束分离为多个子光束，每个子光束都具有预定波长光谱的单独的波长子带，并沿着不同的相应的光路引导和聚焦所述子光束，以便基于相应的波长子带的色彩聚焦距离将所述子光束聚焦在所述微流控靶上。
12.根据权利要求11所述的设备，其中，所述宽带照射源包括超连续谱激光器。
13.根据权利要求11所述的设备，其中，所述波长分离系统包括多个二向色性光学元件，所述二向色性光学元件被设置成将分离的子光束沿着共线或平行的光路引导至所述微流控靶。
14.根据权利要求11所述的设备，其中，所述波长分离系统包括光学地耦合到相应的所述子光束的多个聚焦系统，以便将所述子光束聚焦到所述微流控靶的公共位置。
15.根据权利要求11所述的设备，其中，所述检测器是检测系统的一部分，所述检测系统还包括：
收集光学器件，所述收集光学器件被设置成接收由所述微流控靶弹性地侧向散射的光以便形成所述多波长检测光束；以及
棱镜光学器件，所述棱镜光学器件被设置成从所述收集光学器件接收所述多波长检测光束，并将所述多波长检测光束分成基于波长在空间上分离的多个检测子光束。
16.根据权利要求15所述的设备，其中，所述检测系统还包括：
具有单独的微透镜的微透镜阵列，所述微透镜被设置成接收和聚焦相应的检测子光束；并且
其中，所述检测器包括被设置成接收相应的所述检测子光束的多个检测器通道。
17.根据权利要求16所述的设备，其中，所述检测器包括一个或多个雪崩光电二极管、单光子检测雪崩光电二极管、光电倍增管、硅光电倍增器，或者3-D高分辨率、高灵敏度、高帧频光场彩色记录装置或其组合。
18.根据权利要求1至10中的任一项所述的设备，其中，所述照射源包括：
多个单色激光源，所述单色激光源被设置成产生不同波长的相应激光束，以便对应于所述多波长照射光束。
19.根据权利要求18所述的设备，其中，所述照射源还包括光束聚焦光学器件，所述光束聚焦光学器件被设置成基于所述激光束的波长的彩色聚焦特性将每个相应的激光束聚焦在所述微流控靶上。
20.根据权利要求19所述的设备，其中，所述照射源还包括多个二向色性光学元件，所述二向色性光学元件被设置成沿着共线的光路引导所述激光束，使得所述激光束被聚焦到所述微流控靶上的共同位置。
21.根据权利要求18所述的设备，其中，所述检测器是检测系统的一部分，所述检测系统包括收集光学器件，所述收集光学器件被设置成接收不同波长的光，所述光被所述微流控靶弹性地侧向散射，以便形成所述多波长检测光束。
22.根据权利要求21所述的设备，其中，所述收集光学器件包括：第一收集光学器件，所述第一收集光学器件相对于由所述微流控靶接收的所述多波长照射光束的光路垂直地布置；和第二收集光学器件，所述第二收集光学器件相对于所述光路垂直地布置且与所述第一收集光学器件相邻。
23.根据权利要求22所述的设备，其中，所述第二收集光学器件处于所述微流控靶的与所述第一收集光学器件相反的一侧上。
24.根据权利要求22所述的设备，其中，所述第二收集光学器件被配置为具有与所述第一收集光学器件不同的收集光学器件参数，所述参数使米氏共振在给定波长下偏移预定量。
25.根据权利要求24所述的设备，其中，所述收集光学器件参数包括收集光学器件角度和检测孔径几何形状中的一个或两个。
26.根据权利要求22所述的设备，其中，所述检测器包括耦合到所述第一收集光学器件的第一检测器和耦合到所述第二收集光学器件的第二检测器，其中，所述第一检测器和所述第二检测器的灵敏度被选择为不同以增加对不同大小的颗粒的动态检测范围。
27.根据权利要求21所述的设备，其中，所述检测系统还包括：
至少一个二向色性光学元件，所述二向色性光学元件被设置成会聚地接收所述多波长检测光束并将所述多波长检测光束分离成多个检测子光束，每个检测子光束都对应于不同波长之一；
其中，所述检测器包括多个光学检测器，所述光学检测器被设置成从所述至少一个二向色性元件接收相应的检测子光束，并且被设置成相对于所述至少一个二向色性元件成间隔关系，所述间隔关系基于由所述收集光学器件提供的聚焦距离和在所述检测子光束之间的焦点的光路长度差，所述光路长度差与所述收集光学器件的色差分布相关联。
28.根据权利要求27所述的设备，其中，所述至少一个二向色性光学元件包括第一二向色性光学元件和第二二向色性光学元件，其中，所述第一二向色性光学元件被设置成将具有不同波长中的第一波长的第一检测子光束引导到相应的光学检测器，所述第二二向色光学元件被设置成将具有比所述第一波长更长的第二波长的第二检测子光束引导到相应的光学检测器。
29.根据权利要求27所述的设备，其中，利用至少一个二向色性光学元件生成所述检测子光束的生成顺序基于所述收集光学器件的色差聚焦分布。
30.根据权利要求27所述的设备，其中，所述收集光学器件包括一个或多个消色差或复消色差透镜元件。
31.根据权利要求22所述的设备，其中，所述第一收集光学器件被设置成检测所述多波长检测光束的具有第一波长的第一检测子光束，并且所述第二收集光学器件被设置成检测所述多波长检测光束的具有第二波长的第二检测子光束。
32.根据权利要求31所述的设备，其中，通过与所述第一收集光学器件的色差聚焦分布相关联的所述第一收集光学器件或者所述第一收集光学器件与被设置成接收所述第一检测子光束的光学检测器之间的空间关系，基于所述第一检测子光束与所述第二检测子光束之间的聚焦距离共通性和聚焦距离差中的一个或两个，将利用所述第二收集光学器件对所述第二检测子光束的检测与利用所述第一收集光学器件对所述第一检测子光束的检测在空间上分开。
33.根据权利要求21所述的设备，其中，所述检测系统还包括光纤组件，所述光纤组件包括：
多根光纤，所述多根光纤具有相应的相邻的第一端，每个第一端都包括孔径，所述孔径被设置成接收具有不同波长之一的所述多波长检测光束的相应的检测子光束，其中，基于与所述收集光学器件的色差聚焦分布相关联的检测子光束之间的聚焦距离变化，所述孔径沿所述子光束的公共传播方向关于彼此间隔开；和
多个光学检测器，所述多个光学检测器光学耦合至所述光纤的与所述第一端相反的相应的第二端。
34.根据权利要求33所述的设备，其中，所述孔径与相应的所述检测子光束的图像点对准。
35.根据权利要求33所述的设备，其中，所述设备还包括耦合到所述光纤的至少一个所述第一端的平移台，以便沿所述传播方向平移相应的孔径。
36.根据权利要求35所述的设备，其中，所述孔径是狭缝孔径，并且每个狭缝孔径都具有比狭缝宽度长的狭缝长度，并且所述狭缝长度平行于所述微流控靶的流动方向延伸。
37.根据权利要求36所述的设备，其中，所述平移台被设置成沿着垂直于所述传播方向和所述流动方向的侧向方向平移所述狭缝孔径。
38.根据权利要求33所述的设备，其中，所述光纤的所述第一端中的每一个都包括光学块，所述光学块包括相应的所述孔径并且光学地耦合或熔合到所述光纤以便形成所述第一端。
39.根据权利要求38所述的设备，其中，所述光学块的与所述孔径相邻的区域具有吸收率，对所述吸收率进行选择以便减少在所述光纤的所述第一端附近的杂散光。
40.根据权利要求33所述的设备，其中，每个孔径都基于成型光纤芯或包层的几何形状以及位于端面上的反射率涂层变化中的一个或多个，由所述光纤的相应端面来限定。
41.根据权利要求33所述的设备，其中，所述孔径具有关于米氏共振选择的几何形状。
42.根据权利要求41所述的设备，其中，所述几何形状为非圆形和非矩形的。
43.一种微流控方法，所述方法包括：
将利用照射源产生的多波长照射光束引导至微流控靶；
利用所述微流控靶弹性地侧向散射所述多波长照射光束；
利用检测器检测通过所述弹性侧向散射的多波长照射光束形成的多波长检测光束的多个检测子光束，以产生检测信号；以及
基于所述检测信号和针对不同纳米标签类型的预定的多波长弹性侧向散射强度分布，响应于所述多波长检测光束而确定不同纳米标签的存在。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，通过使用所述预定的多波长弹性侧向散射强度分布对所述检测信号进行解卷积来执行所述确定。
45.根据权利要求43所述的方法，其中，引导所述多波长照射光束包括：
将所述多波长照射光束分成多个照射子光束，每个照射子光束都具有不同的波长子带；和
沿着不同的相应的光路将所述照射子光束引导在所述微流控靶上，使得基于所述不同的波长子带的色彩聚焦距离变化，所述照射子光束被聚焦在所述微流控靶上。
46.根据权利要求43所述的方法，其中，检测所述多个检测子光束包括：
利用棱镜装置将所述多波长检测光束分离为所述检测子光束；
利用具有被设置成分别聚焦所述检测子光束的相应微透镜的微透镜阵列来接收所述检测子光束；以及
利用光学检测器的相应的检测器通道接收聚焦的检测子光束。
47.根据权利要求43所述的方法，其中，所述照射源包括多个单色激光器，所述多个单色激光器被设置成发射具有不同的相应波长的激光束。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，引导所述多波长照射光束包括将所述激光束引导到共线的光路，使得所述激光束被聚焦到所述微流控靶上的共同位置。
49.根据权利要求47所述的方法，其中，检测多个检测子光束包括：
利用至少一个二向色性光学元件会聚地接收来自收集光学器件的所述多波长检测光束，以便将所述多波长检测光束分离成所述检测子光束，每个检测子光束都对应于不同波长之一；和
利用相应的光学检测器接收所述检测子光束，所述光学检测器被设置成与所述至少一个二向色性光学元件成间隔关系，所述间隔关系基于由所述收集光学器件提供的聚焦距离和在所述检测子光束之间的焦点的光路长度差，所述光路长度差与所述收集光学器件的色差分布相关联。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，检测多个检测子光束包括：
利用第一组收集光学器件接收所述多波长检测光束的第一部分；
检测具有第一波长的所述第一部分的检测子光束；
利用第二组收集光学器件接收所述多波长检测光束的第二部分，所述第二组收集光学器件被设置成相对于所述微流控靶与所述第一收集光学器件相反；以及
通过与所述第一收集光学器件的色差聚焦分布相关联的所述第一组收集光学器件，基于具有所述第一波长的所述检测子光束和具有所述第二波长的所述检测子光束之间的聚焦距离共通性和聚焦距离差中的一个或两个，单独地检测所述第二部分的具有第二波长的检测子光束。
51.根据权利要求47所述的方法，其中，检测多个检测子光束包括：
利用收集光学器件将所述检测子光束引导到相邻光纤的第一端处的相应的狭缝孔径，其中，基于与所述收集光学器件的色差聚焦分布相关联的所述检测子光束之间的聚焦距离变化，所述狭缝孔径沿着所述子光束的共同传播方向相对于彼此间隔开。
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