KR20200047735A - 스펙트럼 산란 유세포 분석을 위한 광학적 구성 방법 - Google Patents
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Abstract
장치는 나노 태그를 포함할 수 있는 미세 유체 타겟으로 다중 파장 조명 빔을 생성하고 지향시키도록 형성된 조명원; 미세 유체 타겟으로부터 다중 파장 검출 빔을 수신하고 검출 신호를 생성하며, 여기서 다중 파장 검출 빔은 다중 파장 조명 빔 및 나노 태그 사이의 상호작용에 의하여 탄성적으로 측면 산란되는 광을 포함하는 검출기; 검출 신호를 수신하고 검출 신호의 다중 파장 측면 산란 강도 특성을 하나 이상의 나노 태그 유형의 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일을 가지는 검출 신호와 비교함으로써 미세 유체 타겟 내의 나노 태그의 존재를 결정하도록 형성된 프로세서를 포함한다.
방법은 또한 검출 신호 및 상이한 나노 태그 유형에 대한 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일에 기초하여 다중 파장 검출 빔에 대응하는 상이한 나노 태그의 존재를 결정하는 것이 개시되어 있다.
방법은 또한 검출 신호 및 상이한 나노 태그 유형에 대한 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일에 기초하여 다중 파장 검출 빔에 대응하는 상이한 나노 태그의 존재를 결정하는 것이 개시되어 있다.
Description
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2016 년 10 월 21 일에 출원된 미국 가출원 제 62 / 411,324 호 및 2017 년 10 월 23 일에 출원된 " Molecular Nanotags(분자 나노 태그)"라는 PCT 출원과 관련이 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 2017 년 10 월 23 일자로 출원 된 미국 가출원 제 62 / 575,988 호의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야는 유세포 분석을 포함하는 미세 유체 장치 및 방법에 관한 것이다.
정부 지원의 알림
본 발명은 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 프로젝트 번호 Z01BC011502로 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
단일 나노입자 검출, 분해능 및/또는 분류를 위한 개선된 방법 및 소자는 임상 및 연구 목적에 모두 유리할 것이다. 예를 들어, 이들은 치료제, 표적 또는 바이오 마커로서 사용하기 위한 중요한 생물학적 기능 및 상당한 생체 의학적 잠재력을 갖는 세포에 의해 방출되는 세포외 소포(EV) 및 다른 나노 스케일 입자를 확인하고 분석하는데 유용할 것이다. EV의 구성 성분 및 생물학적 기능은 이를 생성하는 세포의 유형 및 이들이 생성되는 조건에 따라 다양하다는 것이 일반적으로 인정된다(Raposo and Stoorvogel, J Cell Biol 200 (4) : 373-383, 2013). 그러나, 세포 계통 및 서브 세트가 정의된 방식으로 이들 입자의 서브 세트를 특성화하는 것은 이전에는 불가능 하였다. 유사하게, 다른 나노 스케일 입자 뿐만 아니라 이들 나노 스케일 입자의 개별 분자 성분을 검출, 분류 및 계수하는 것은 이전에는 어려웠다. 이 기술의 중요한 장애물은 특정 속성에 따라 개별적인 나노 스케일 입자를 분석, 분류 및 기능적으로 연구할 수 있는 이용 가능한 도구 및 시약이 부족하다는 점이다.
형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)는 1972년 Herzenberg와 동료들이 세포의 표지된 서브 세트를 식별하고 분류하기 위해 도입한 이래로 사용되었지만(Julius et al., Proc Natl Acad Sci USA 69 (7) : 1934-1938, 1972; Bonner et al., Rev Sci Instrum 43 : 404-409, 1972), 서브 마이크론 소집단은 대략 500 nm 미만의 입자에 대해 실현 가능한 것으로 간주되지 않았다. 유세포 분석 미세 유체에 대한 통상적인 지식은 500 nm 미만의 입자로부터의 신호가 샘플 파편 및 전자 노이즈로부터의 신호에서 손실되어 검출할 수 없는 상태가 된다고 유지된다. 또한, EV 표면의 단일 수용체와 같은 단일 분자의 검출을 가능하게 하는 유세포 분석 또는 유세포 분석기와 같은 시약 방법의 개선의 필요가 존재한다.
개시된 기술의 일 측면에 따르면, 장치는 다중 파장 조명 빔을 생성하고 나노 태그를 포함할 수 있는 미세 유체 타겟으로 지향시키도록 형성된 조명원, 미세 유체 타겟으로부터 다중 파장 검출 빔을 수신하고 검출 신호를 생성하도록 형성되며, 여기서 상기 다중 파장 검출 빔은 다중 파장 조명 빔 및 미세 유체 타겟 내의 나노 태그 사이의 상호작용에 의하여 탄성적으로 측면 산란되는 광을 포함하는 검출기 및 검출 신호를 수신하고, 검출 신호의 다중 파장 측면 산란 강도 특성을 하나 이상의 나노 태그 유형의 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일과 비교함으로써 미세 유체 타겟 내의 나노 태그의 존재를 결정하도록 형성된 프로세서를 포함한다.
일부 예에서, 상기 미세 유체 타겟 내의 나노 태그의 존재를 결정하는 것은 단일 나노 태그의 존재를 결정하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 상기 프로세서는 상기 비교에 기초하여, 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)에 부착된 적어도 하나의 나노 태그를 가지는 세포외 소포의 존재를 결정하도록 형성된다. 다른 예에서, 상기 프로세서는 미세 유체 타겟 내에 동시에 존재하는 복수의 나노 태그 유형의 존재를 상기 검출 신호로부터 결정하도록 형성된다. 일부 예에서, 복수의 나노 태그 유형은 공통의 세포외 소포(EV)에 부착되어 있다. 다른 예에서, 상기 비교는 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일을 사용하는 검출 신호의 디컨볼루션(deconvolution)을 통하여 수행된다. 일부 예에서, 단일 나노 입자는 구형 또는 비구형의 특성을 가지고 100 nm 이하의 구형 특성과 관련된 직경 또는 비구형 특성과 관련된 특성 치수를 갖는다. 다른 예에서, 상기 탄성 측면 산란 강도 프로파일은 피크 산란에 대응한다. 일부 예에서, 상기 나노 태그 유형은 금으로 이루어진 하나 이상의 나노 태그 및 은으로 이루어진 하나 이상의 나노 태그를 포함한다. 다른 예에서, 상기 하나 이상의 나노 태그 유형은 10 nm 내지 30 nm의 범위에서 선택되는 직경을 포함하는 유형의 나노 태그를 포함한다. 일부 예에 따르면, 상기 조명원은 소정의 파장 스펙트럼을 가지는 광대역 조명 빔을 생성하도록 배치된 광대역 조명원을 포함하고, 상기 장치는 상기 광대역 조명 빔과 광학적으로 결합하고, 소정의 파장 스펙트럼의 별개의 파장 서브 밴드를 각각 가지는 복수의 서브 빔 내로 광대역 조명을 분리시키고, 각각의 파장 서브 밴드의 크로매틱 포커싱(chromatic focusing) 거리에 기초한 미세 유체 타겟에서의 서브 빔을 집광하기 위하여 상이한 각각의 광 경로를 따라 서브 빔을 지향 및 집광시키도록 배치된 파장 분리 시스템을 포함한다. 일부 예에서, 광대역 조명원은 초연속 레이저를 포함한다. 다른 예에서 상기 파장 분리 시스템은 미세 유체 타겟에 동일 선상의 또는 평행한 광 경로를 따라 별도의 서브 빔을 지향시키도록 배치된 복수의 이색성 광학 소자를 포함한다. 일부 예에서 상기 파장 분리 시스템은 상기 미세 유체 타겟의 공통 위치에 서브 빔을 집광시키기 위하여 각각의 서브 빔에 광학적으로 결합된 복수의 포커싱 시스템을 포함한다. 다른 예에서, 상기 검출 시스템은 다중 파장 검출 빔을 형성하기 위하여 미세 유체 타겟에 의해 탄성적으로 측면 산란된 광을 수신하도록 배치되는 수집 광학계 및 상기 수집 광학계로부터 상기 다중 파장 검출 빔을 수신하고, 파장에 기초하여 공간적으로 분리된 복수의 검출 서브 빔 내로 상기 다중 파장 검출 빔을 분리하도록 배치되는 프리즘 광학계를 포함한다. 일부 예에서 상기 검출 시스템은 각각의 검출 서브 빔을 수신 및 집광하도록 배치되는 분리된 마이크로 렌즈를 갖는 마이크로 렌즈 어레이를 더 포함하고, 여기서 상기 검출기는 각각의 검출 서브 빔을 수신하도록 배치된 복수의 검출기 채널을 포함한다. 상기 검출기는 하나 이상의 애벌란시 광 다이오드(avalanche photodiode), 단일 광자 검출 애벌란시 광 다이오드(single-photon detecting avalanche photodiode), 광전자증배관(photo-multiplier tube), 실리콘 광전자증배기(silicon photomultiplier), 또는 3D 고해상도, 고감도, 고 프레임 레이트(frame rate) 광 필드 컬러 기록 소자 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 예에서, 상기 조명원은 상기 다중 파장 조명 빔에 대응하도록 상이한 파장에서 각각의 레이저 빔을 생성하도록 배치되는 복수의 단색 레이저 소스를 포함한다. 일부 예에서, 상기 조명원은 레이저 빔의 파장의 크로매틱 포커싱 특성에 기초하여 미세 유차 타겟에 각각의 레이저 빔을 각각 집광시키도록 배치되는 빔 포커싱 광학계를 더 포함한다. 일부 예에서, 상기 조명원은 레이저 빔이 미세 유체 타겟에서 공통 위치에 집광되도록 동일 선상의 광 경로를 따라 레이저 빔을 지향시키도록 배치되는 복수의 이색성 광학 소자를 더 포함한다. 다른 실시예에 따르면, 상기 검출기는 다중 파장 검출 빔을 형성하도록 미세 유체 타겟에 의하여 탄성적으로 측면 산란되는 상이한 파장에서 광을 수신하도록 배치되는 수집 광학계를 포함하는 검출 시스템의 일부이다. 일부 예에서, 상기 수집 광학계는 미세 유체 타겟에 의하여 수신되는 다중 파장 조명 빔의 광 경로에 대하여 수직으로 배열되는 제1 수집 광학계 및 상기 제1 수집 광학계에 인접한 광 경로에 대하여 수직으로 배열되는 제2 수집 광학계를 포함한다. 다른 예에서, 상기 제2 수집 광학계는 상기 제1 수집 광학계로부터 상기 미세 유체 타겟의 반대측에 있다. 일부 예에서, 상기 제2 수집 광학계는 주어진 파장에서 소정의 양만큼 미에 공명(Mie resonance)을 이동시키는 제1 수집 광학계와는 상이한 수집 광학계 파라미터로 구성된다. 다른 예에서, 상기 수집 광학계 파라미터는 수집 광학계 각도 및 검출 개구 기하학적 구조(detection aperture geometry) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 예에서, 상기 검출기는 상기 제1 수집 광학계에 결합되는 제1 검출기 및 상기 제2 수집 광학계에 결합된 제2 검출기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 검출기의 민감도는 상이한 크기의 입자를 감지하기 위한 동적 범위를 증가시키도록 상이하게 선택된다. 일부 예의 검출 시스템은 상기 다중 파장 검출 빔을 수렴적으로 수신하고 상이한 파장 중 하나에 각각 대응하는 복수의 검출 서브 빔 내로 상기 다중 파장 검출 빔을 분리하도록 형성되는 적어도 하나의 이색성 광학 소자 더 포함하고, 여기서 상기 검출기는 적어도 하나의 이색 소자로부터 각각의 검출 서브 빔을 수신하도록 배치되고, 수집 광학계에 의하여 제공되는 포커싱 거리 및 수집 광학계의 색수차(chromatic aberration) 프로파일과 관련된 검출 서브 빔 사이 초점의 광 경로 차이를 기초로 하는 적어도 하나의 이색 소자에 대하여 이격된 관계로 배치되는 복수의 광학 검출기를 포함한다. 일부 예에서, 상기 적어도 하나의 이색성 광학 소자는 제1 이색성 광학 소자 및 제2 이색성 광학 소자를 포함하고, 여기서 제1 이색성 광학 소자는 각각의 광학 검출기로 상이한 파장 중 제1 파장을 가지는 제1 검출 서브 빔을 지향시키도록 배치되고, 상기 제2 이색성 광학 소자는 각각의 광학 검출기로 제1 파장보다 긴 제2 파장을 가지는 제2 검출 서브 빔을 지향시키도록 배치된다. 일부 예에서, 적어도 하나의 이색성 광학 소자를 가지는 검출 서브 빔의 생성 순서는 상기 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 기초한다. 일부 예에서, 상기 수집 광학계는 하나 이상의 아크로매틱(achromatic) 및 아포크로매틱(apochromatic) 렌즈를 포함한다. 다른 예에서, 상기 제1 수집 광학계는 제1 파장을 가지는 다중 파장 검출 빔의 제1 검출 서브 빔을 검출하도록 배치되고, 상기 제2 수집 광학계는 제2 파장을 가지는 다중 파장 검출 빔 중 제2 검출 서브 빔을 검출하도록 배치된다. 일부 예에서, 제2 수집 광학계로의 제2 검출 서브 빔의 검출은 제1 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일 또는 제1 수집 광학계 및 제1 검출 서브 빔을 수신하도록 배치되는 광학 검출기 사이의 공간적인 관계에 관련된 제1 수집 광학계에 의한 제1 검출 서브 빔 및 제2 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 공통성 및 포커싱 거리 차이 중 하나 이상을 기초로 하여 제1 수집 광학계로 제1 검출 서브 빔의 검출로부터 공간적으로 분리된다. 일부 검출 시스템 예는 상이한 파장 중 하나를 가지는 다중 파장 검출 빔의 검출 서브 빔 각각을 수신하도록 배치되는 개구를 각각 포함하는 각각 인접한 제1 단부를 가지고, 상기 개구는 상기 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 관련된 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 변화에 기초하여 서브 빔의 공통 전파 방향을 따라 서로에 대하여 이격된 관계를 가지는 복수의 광섬유 및 제1 단부에 대향하는 광섬유의 제2 단부에 대하여 광학적으로 결합하는 복수의 광학 검출기를 포함하는 광섬유 어셈블리를 더 포함한다. 일부 예에서, 상기 개구는 각각의 검출 서브 빔의 이미지 스팟에 맞추어 정렬된다. 일부 예는 전파 방향에 따라 대응하는 개구를 병진시키도록 제1 광섬유의 적어도 하나의 제1 단부에 결합된 병진 스테이지를 더 포함한다. 일부 예에서, 상기 개구는 슬릿 개구이고, 각각의 슬릿 개구는 슬릿 폭보다 더 긴 슬릿 길이를 가지고 슬릿 길이는 미세 유체 타겟의 유동 방향에 평행하게 연장된다. 일부 예에서, 상기 병진 스테이지는 전파 방향 및 유동 방향에 수직인 측면 방향을 따라 슬릿 개구를 병진시키도록 배치된다. 일부 예에서, 광섬유의 각각의 제1 단부는 각각의 개구를 포함하고 제1 단부를 형성하기 위하여 광섬유에 광학적으로 결합 또는 융합되는 광학 블록을 포함한다. 다른 예에서, 상기 개구에 인접한 광학 블록의 영역은 광섬유의 제1 단부에 근접한 미광(stray light)을 감소시키도록 선택되는 흡수율을 갖는다. 일부 예에서, 각각의 개구는 형성화된 광섬유 코어 또는 클래딩 기하학적 구조 및 단면 상에 위치된 반사성 코팅 변형 중 하나 이상을 기초로 하는 각각의 단면에 의해 정의된다. 다른 예에서, 상기 개구는 미에 공명에 관하여 선택된 기하학적 구조를 갖는다. 일부 예에서, 상기 기하학적 구조는 비원형 (non-circular)및 비장방형(non-rectangular)이다.
개시된 기술의 다른 면에 따르면, 방법은 미세 유체 타겟에 조명원으로 생성된 다중 파장 조명 빔을 지향하는 단계, 상기 미세 유체 타겟과 상기 다중 파장 조명 빔을 탄성적으로 측면 산란시키는 단계, 검출 신호를 생성하도록 탄성적으로 측면 산란되는 다중 파장 조명 빔으로 형성되는 다중 파장 검출 빔의 복수의 검출 서브 빔을 검출기로 검출하는 단계 및 검출 신호 및 상이한 나노 태그 유형에 따른 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일에 기초하여 다중 파장 검출 빔에 대응하는 상이한 나노 태그의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 상기 결정하는 단계는 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일을 사용하는 검출 신호의 디컨볼루션을 통하여 수행된다. 다른 예에서, 상기 다중 파장 조명 빔을 지향하는 단계는 각각 상이한 파장 서브 밴드를 가지는 복수의 조명 서브 빔 내로 다중 파장 조명 빔을 분리시키는 단계 및 조명 서브 빔이 상이한 파장 서브 밴드의 크로매틱 포커싱 거리 변화에 기초하여 미세 유체 타겟에 집광되도록 각각의 광 경로를 따라 미세 유체 타겟에 조명 서브 빔을 지향시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 상기 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는 검출 서브 빔 내로 프리즘 배열을 갖는 다중 파장 검출 빔을 분리시키는 단계, 검출 서브 빔을 각각 집광하도록 배치되는 각각의 마이크로 렌즈를 가지는 마이크로 어레이로 검출 서브 빔을 수신하는 단계 및 광학 검출기의 각각의 검출기 채널로 집광된 검출 서브 빔을 수신하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 상기 조명원은 상이한 각각의 파장을 가지는 레이저 빔을 방출하도록 배치된 복수의 단색 레이저를 포함한다. 다른 예에서, 상기 다중 파장 조명 빔을 지향시키는 단계는 레이저 빔이 미세 유체 타겟에서의 공통 위치에 집광되도록 동일 선상의 광 경로로 레이저 빔을 지향시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는 상이한 파장 중 하나에 각각 대응하고, 검출 서브 빔 내로 다중 파장 검출 빔을 분리시키도록 적어도 하나의 이색성 광학 소자로 수집 광학계로부터 다중 파장 검출 빔을 수렴적으로 수신하는 단계 및 수집 광학계에 의하여 제공되는 포커싱 거리 및 수집 광학계의 색수차 프로파일에 관련된 검출 서브 빔 사이 초점의 광 경로 차이에 기초하는 하나 이상의 이색성 광학 소자로 이격된 관계로 배치되는 각각의 검출기로 검출 서브 빔을 수신하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 상기 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는 수집 광학계의 제1 세트로 다중 파장 검출 빔의 제1 부분을 수신하는 단계, 제1 파장을 가지는 제1 부분의 검출 서브 빔을 검출하는 단계, 제1 수집 광학계로부터 미세 유체 타겟에 대향하도록 배치되는 수집 광학계의 제2 세트로 다중 파장 검출 빔의 제2 부분을 수신하는 단계 및 제1 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 관련된 수집 광학계의 제1 세트에 의하여 제1 파장을 가지는 검출 서브 빔 및 제2 파장을 가지는 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 공통성 및 포커싱 거리 차이 중 하나 이상을 기초로 제2 파장을 가지는 제2 부분의 검출 서브 빔을 개별적으로 검출하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 상기 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는 인접한 광섬유의 제1 단부에서 각각의 개구로 상기 검출 서브 빔을 수집 광학계에 의하여 지향하는 단계를 포함하고, 여기서 슬릿 개구는 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 관련된 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 변화에 기초하여 서브 빔의 공통 전파 방향을 따라 서로에 대하여 이격된다.
개시된 기술의 전술한 특징 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면을 참조하여 진행하는 후술하는 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1은 미세 유체 유세포 측정 장치의 일 예의 개략도이다.
도 2a는 다중 파장 조명원의 일 예의 개략도이다.
도 2b 내지 도 2c는 도 2a에 도시된 다중 파장 조명 빔의 빔 단면이다.
도 3a는 다중 파장 조명원의 다른 일 예의 개략도이다.
도 3b 내지 도 3c는 도 3a에 도시된 다중 파장 조명 빔의 빔 단면이다.
도 4a는 다중 파장 조명원의 다른 일 예의 개략도이다.
도 4b 내지 도 4c는 도 4a에 도시된 다중 파장 조명 빔의 빔 단면이다.
도 5는 다중 파장 측면 산란 검출 시스템의 일 예의 개략도이다.
도 6은 미세 유체 검출 시스템의 개략도이다.
도 7은 다른 미세 유체 검출 시스템의 개략도이다.
도 8a는 광학 이미지 여과 유닛의 개략적인 사시도이다.
도 8b 내지 8d는 상이한 개구의 기하학적 구조를 도시한다.
도 9 내지 도 13은 다중 파장 미세 유체 유세포 측정 방법의 흐름도이다.
도 14는 미세 유체 장치의 일 예를 도시한다.
도 15a내지 도 15d는 선택된 직경의 다양한 나노 구체에 대한 미에 산란 물질의 그래프를 도시한다.
도 16a는 60 nm 금 및 은 구체에 대한 산란 단면 대 파장의 그래프이다.
도 16b는 상이한 파장에서의 60 nm 금 및 은 나노입자에 대한 모델링 된 산란 특성 그래프이다.
도 17a 내지 도 17b는 각각 40 nm 구체 및 20 nm 구체에 대한 Ag/Au 산란 단면 및 다른 산란 단면 대 파장의 그래프이다. Ag/Au 선은 Ag 대 Au의 수집 산란 힘의 비율을 나타낸다. 검은 점선은 Au 수집 산란 힘을 나타낸다. 일점쇄선은 Ag의 수집 산란 힘을 나타낸다. 수평선은 금 및 은의 산란 힘의 비율이 1인 경우를 나타낸다. 점선은 100 nm의 금의 수집 산란 힘을 나타낸다. 수직선은 스펙트럼 산란 검출에 사용될 수 있는 단색 레이저 다이오드 소스를 나타낸다.
도 18a 내지 18b는 상이한 수집 각도에 대한 Ag/Au 산란 단면 대 파장의 그래프이다. 40 nm의 금, 은 및 10 nm의 폴리스티렌의 스펙트럼 산란이다. 각 물질은 20도에서 60도까지 2도씩 모델링되었다. 각각의 스펙트럼은 도 17a에서 확인할 수 있다.
도 19a, 19b 및 19c는 미에 산란 모델 스크립트의 개략도이다.
도 20a는 변동 계수 대 수집 반각의 그래프로, 도 20b에서 얻어지는 비드 데이터의 가장 가까운 피팅 수집 반각을 나타낸다.
도 20b는 채널 수 대 입자 직경의 그래프로, 도 20a로부터 추론되는 수집 반각을 이용한 모델링된 데이터로 Astrios EQ 유세포 분석기에서 알려진 직경 및 굴절률(검정색 점)의 획득 된 입자의 피팅을 도시한다.
도 22a 내지 도 22d는 다양한 파장에서의 다양한 입자에 대한 산란 검출의 모델링 및 실제 성능을 나타낸다.
도 23은 폴리스티렌, 금, CdSe, 은의 굴절률 및 금, CdSe 및 은의 흡광 계수의 그래프를 도시한다.
도 24는 금에 대한 광학 상수 및 특성을 나타낸다.
도 25는 금, 은 및 폴리스티렌 비드에 대한 FACS Symphony 및 Astrios EQ 유세포 분석 소자 사이의 SSC / FSC 그래프 비교를 나타낸다.
도 26a는 5도씩 증가하는5도 내지 90도의 반각을 갖는 SSC 수집을 위한 원형 개구를 사용하는 모델링 된 세포외 소포의 산란 직경 관계를 나타낸다.
도 26b는 5도씩 증가하는5도 내지 90도의 반각을 갖는 SSC 수집을 위한 사각형 개구를 사용하는 모델링 된 세포외 소포의 산란 직경 관계를 나타낸다.
도 27은 개방 개구(950 ㎛), 450 ㎛ 및 200 ㎛의 슬릿 개구를 가지는 Attune NxT 상에서 획득된 100 nm, 300 nm, 500 nm 및 900 nm의 비드에 대한 SSC 분리 지수를 계산하여 나타낸다.
도 28a 내지 도 28f는 나노 입자의 연속적인 희석 및 단일 입자 검출을 나타내는 선형 감소를 나타낸다.
도 29는 다양한 Au, Ag 및 PS 나노 입자의 파장에 대한 모델링 된 산란 단면을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30b는 각각 60 nm Ag 에서 60 nm Au 입자의 모델링되고 실험적으로 획득된 산란 단면을 나타낸다.
도 31은 단일 60 nm Au 및 Ag 나노태그의 검출 및 CFSE 염색된 EV를 나타낸다.
도 32는 405 nm, 488 nm, 635 nm의 조명 파장에서의 100 nm, 200 nm, 500 nm의 직경을 가지는 폴리스티렌 입자의 각도 산란 분포를 나타낸다.
도 33은 405 nm, 488 nm, 635 nm의 조명 파장을 가지는 30도의 반각 수집에서 모델링 된 폴리스티렌 구체의 산란 단면을 나타낸다.
도 2a는 다중 파장 조명원의 일 예의 개략도이다.
도 2b 내지 도 2c는 도 2a에 도시된 다중 파장 조명 빔의 빔 단면이다.
도 3a는 다중 파장 조명원의 다른 일 예의 개략도이다.
도 3b 내지 도 3c는 도 3a에 도시된 다중 파장 조명 빔의 빔 단면이다.
도 4a는 다중 파장 조명원의 다른 일 예의 개략도이다.
도 4b 내지 도 4c는 도 4a에 도시된 다중 파장 조명 빔의 빔 단면이다.
도 5는 다중 파장 측면 산란 검출 시스템의 일 예의 개략도이다.
도 6은 미세 유체 검출 시스템의 개략도이다.
도 7은 다른 미세 유체 검출 시스템의 개략도이다.
도 8a는 광학 이미지 여과 유닛의 개략적인 사시도이다.
도 8b 내지 8d는 상이한 개구의 기하학적 구조를 도시한다.
도 9 내지 도 13은 다중 파장 미세 유체 유세포 측정 방법의 흐름도이다.
도 14는 미세 유체 장치의 일 예를 도시한다.
도 15a내지 도 15d는 선택된 직경의 다양한 나노 구체에 대한 미에 산란 물질의 그래프를 도시한다.
도 16a는 60 nm 금 및 은 구체에 대한 산란 단면 대 파장의 그래프이다.
도 16b는 상이한 파장에서의 60 nm 금 및 은 나노입자에 대한 모델링 된 산란 특성 그래프이다.
도 17a 내지 도 17b는 각각 40 nm 구체 및 20 nm 구체에 대한 Ag/Au 산란 단면 및 다른 산란 단면 대 파장의 그래프이다. Ag/Au 선은 Ag 대 Au의 수집 산란 힘의 비율을 나타낸다. 검은 점선은 Au 수집 산란 힘을 나타낸다. 일점쇄선은 Ag의 수집 산란 힘을 나타낸다. 수평선은 금 및 은의 산란 힘의 비율이 1인 경우를 나타낸다. 점선은 100 nm의 금의 수집 산란 힘을 나타낸다. 수직선은 스펙트럼 산란 검출에 사용될 수 있는 단색 레이저 다이오드 소스를 나타낸다.
도 18a 내지 18b는 상이한 수집 각도에 대한 Ag/Au 산란 단면 대 파장의 그래프이다. 40 nm의 금, 은 및 10 nm의 폴리스티렌의 스펙트럼 산란이다. 각 물질은 20도에서 60도까지 2도씩 모델링되었다. 각각의 스펙트럼은 도 17a에서 확인할 수 있다.
도 19a, 19b 및 19c는 미에 산란 모델 스크립트의 개략도이다.
도 20a는 변동 계수 대 수집 반각의 그래프로, 도 20b에서 얻어지는 비드 데이터의 가장 가까운 피팅 수집 반각을 나타낸다.
도 20b는 채널 수 대 입자 직경의 그래프로, 도 20a로부터 추론되는 수집 반각을 이용한 모델링된 데이터로 Astrios EQ 유세포 분석기에서 알려진 직경 및 굴절률(검정색 점)의 획득 된 입자의 피팅을 도시한다.
도 22a 내지 도 22d는 다양한 파장에서의 다양한 입자에 대한 산란 검출의 모델링 및 실제 성능을 나타낸다.
도 23은 폴리스티렌, 금, CdSe, 은의 굴절률 및 금, CdSe 및 은의 흡광 계수의 그래프를 도시한다.
도 24는 금에 대한 광학 상수 및 특성을 나타낸다.
도 25는 금, 은 및 폴리스티렌 비드에 대한 FACS Symphony 및 Astrios EQ 유세포 분석 소자 사이의 SSC / FSC 그래프 비교를 나타낸다.
도 26a는 5도씩 증가하는5도 내지 90도의 반각을 갖는 SSC 수집을 위한 원형 개구를 사용하는 모델링 된 세포외 소포의 산란 직경 관계를 나타낸다.
도 26b는 5도씩 증가하는5도 내지 90도의 반각을 갖는 SSC 수집을 위한 사각형 개구를 사용하는 모델링 된 세포외 소포의 산란 직경 관계를 나타낸다.
도 27은 개방 개구(950 ㎛), 450 ㎛ 및 200 ㎛의 슬릿 개구를 가지는 Attune NxT 상에서 획득된 100 nm, 300 nm, 500 nm 및 900 nm의 비드에 대한 SSC 분리 지수를 계산하여 나타낸다.
도 28a 내지 도 28f는 나노 입자의 연속적인 희석 및 단일 입자 검출을 나타내는 선형 감소를 나타낸다.
도 29는 다양한 Au, Ag 및 PS 나노 입자의 파장에 대한 모델링 된 산란 단면을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30b는 각각 60 nm Ag 에서 60 nm Au 입자의 모델링되고 실험적으로 획득된 산란 단면을 나타낸다.
도 31은 단일 60 nm Au 및 Ag 나노태그의 검출 및 CFSE 염색된 EV를 나타낸다.
도 32는 405 nm, 488 nm, 635 nm의 조명 파장에서의 100 nm, 200 nm, 500 nm의 직경을 가지는 폴리스티렌 입자의 각도 산란 분포를 나타낸다.
도 33은 405 nm, 488 nm, 635 nm의 조명 파장을 가지는 30도의 반각 수집에서 모델링 된 폴리스티렌 구체의 산란 단면을 나타낸다.
본 출원 및 청구 범위에서 사용 된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 또한, "포함하다(include)"라는 용어는 "포함한다(comprise)"를 의미한다. 또한, 용어 "결합된"("광적으로 결합된"포함)은 결합된 항목들 사이에 중간 요소의 존재를 배제하지 않는다.
본 명세서에 설명된 시스템, 장치 및 방법은 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 대신에, 본 개시는 다양한 개시된 실시예의 모든 신규하고 비명확한 특징 및 양태에 대해 단독으로 그리고 서로의 다양한 조합 및 하위 조합에 관한 것이다. 개시된 시스템, 방법 및 장치는 임의의 특정 양태 또는 특징 또는 이들의 조합으로 제한되지 않으며, 개시된 시스템, 방법 및 장치는 임의의 하나 이상의 특정 장점이 존재하거나 문제가 해결될 것을 요구하지도 않는다. 임의의 작동 이론은 설명을 용이하게 하기 위한 것이지만, 개시된 시스템, 방법 및 장치는 그러한 작동 이론으로 제한되지 않는다.
개시된 방법들 중 일부의 동작들이 편리한 표시를 위해 특정의 순차적인 순서로 설명되었지만, 이러한 설명 방식은 아래에 설명된 특정 언어에 의해 특정 순서가 요구되지 않는 한 재배열을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 순차적으로 기술된 동작들은 일부 경우에 재배치되거나 동시에 수행될 수 있다. 또한, 간략화를 위해, 첨부된 도면은 개시된 시스템, 방법 및 장치가 다른 시스템, 방법 및 장치와 함께 사용될 수 있는 다양한 방식을 도시하지 않을 수 있다. 또한, 본 설명은 때때로 "생성(produce)"및 "제공(provide)"과 같은 용어를 사용하여 개시된 방법을 설명한다. 이러한 용어는 수행되는 실제 작업의 높은 단계의 추상화된 개념이다. 이러한 용어들에 대응하는 실제 동작들은 특정 구현에 따라 변할 것이고 당업자에 의해 쉽게 식별될 수 있다.
일부 예에서, 값, 절차 또는 장치는 "최저", "최고", "최소" 등으로 지칭된다. 이러한 설명은 다수의 사용된 기능적 대안들 중에서 선택이 이루어질 수 있으며, 그러한 선택이 다른 선택에 비해 더 양호하거나, 더 작거나, 또는 바람직할 필요는 없음을 나타내는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 광학 방사선은 약 100 nm 내지 10 ㎛, 전형적으로는 약 300 nm 내지 800 nm의 파장에서의 전자기 방사선을 지칭한다. 이용 가능한 레이저 다이오드 소스 및 광섬유에 기초한 예는 일반적으로 약 350 nm 내지 1000 nm 이상의 파장과 관련된다. 일부 예에서, 전파되는 광학 방사선은 하나 이상의 직경, 빔 단면적 및 빔 파장에 의존 할 수 있는 직경 및 빔 성형에 사용되는 광학 시스템에 의존하는 빔 발산을 가지는 하나 이상의 빔으로 지칭된다. 편의상, 광학 방사선은 일부 예에서 광으로 지칭되고, 전형적으로 UV 또는 가시광선 파장에 있지만, 예는 UV 또는 가시광선 이외의 파장을 포함 할 수 있다. 빔 단면적, 직경 또는 다른 빔 치수는 일반적으로 제로 강도 값, 1 / e 값, 1 / e2 값, 반치전폭(FWHM) 값 또는 다른 적절한 메트릭에 대응하는 경계를 사용하여 설명할 수 있다.
광학 빔 및 광학 소자는 하나 이상의 축과 관련하여 일부 예에서 설명된다. 전형적으로, 축은 이를 따라 광학 빔이 전파되거나 하나 이상의 광학 요소가 위치되는 하나 이상의 직선 세그먼트를 포함한다. 이러한 축은 반사 또는 굴절 표면으로 구부러지거나 접힐 수 있으므로 축이 단일 직선 세그먼트 일 필요는 없다. 볼록-볼록(convex-convex), 평면 볼록(planoconvex), 오목-오목(concave-concave), 평면 오목(planoconcave), 원통형, 프레넬(fresnel), 존 플레이트(zone plates), 홀로그램, 구형, 비구형, 이들의 조합 등을 포함하는 다양한 렌즈가 기술되거나 사용될 수 있다. 크로스 실린더 또는 크로스 실린더 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 서로에 수직하게 제공하기 위하여 원통형 렌즈는 수직으로 배열된 원통형 표면을 가질 수 있다.
도 1은 다중 파장 조명 빔(104)을 형성하고, 다중 파장 조명 빔(104)을 미세 유체 유세포 분석 타겟(106)으로 지향시키는 다중 파장 조명원(102)을 포함하는 미세 유체 유세포 분석기(100)의 일 예를 도시한다. 대표적인 예에서, 상기 유세포 분석 타겟(106)은 도 1의 면 내 또는 외로 스트림이 흐르는 단면도에서 볼 수 있듯이, 유체의 스트림(108)을 포함하고, 미립자에 부착되는 나노 스케일 태그("나노 태그", 112a, 112b)에 의하여 탄성적으로 산란되는 광에 기초하여, 단일하게 검출 가능한 것을 포함하여, 검출 가능하게 되는 세포외 소포(EV)와 같은 미립자(110)를 포함한다. 상기 다중 파장 조명 빔(104)은전형적으로 유체 스트림(108)의 흐름 방향에 수직한 유세포 분석 타겟(106)에 지향되고, 유세포 분석 타겟(106)에 초점을 맞춘다. 전방 산란(FSC) 검출 시스템(114)은 다중 파장 조명 빔(104)의 일반적인 방향과 동일하게 전파되는 유세포 분석 타겟(106)으로부터 전방 산란 측정 빔(116)을 수신하기 위하여 유세포 분석 타겟(106) 상에 입사됨으로써 다중 파장 조명 빔(104)으로부터 유세포 분석 타겟(106)의 반대편에 위치된다.
분자 나노 태그는 대응되는 고유 광 산란 특성에 기초하여 개별적으로 검출되거나 또는 정량적으로 열거될 수 있는 나노 사이즈의 세포 분석 라벨이다. 본 명세서의 광학 장치 예는 상이한 분자 나노 태그를 식별하도록 다중 파장 광원으로부터 스펙트럼 광 산란 데이터를 수집할 수 있으며, 넓은 범위의 파장에 걸친 식별 가능하고 독특한 광 산란 스펙트럼 특성을 각각 가지는 상이한 나노 물질을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 광 강도 또는 출력 값이 측정될 수 있다. 예들은 다수의 특정 파장에서 광 산란을 측정하고, 강화된 산란 신호는 금의 광학적 특성에 대응하는 파장에서 금 나노 물질과 연관된다는 것이 관찰된다. 대표적인 예에서, 플라즈몬 공명은 흡수와 관련될 수 있고, 산란은 별도의 현상에 대응될 수 있고, 흡수 및 산란의 합은 검출되어 복합 굴절률이 사용되며, 이는 흡광 계수 및 흡수의 양에 대응하는 허수 부분과 함께 고전적인 굴절률을 포함한다.
일부 예에서, 강화된 광 산란 출력의 패턴은광학적 특성에 따라, 굴절률 및 흡광 계수를 포함하는 물질들 사이에서 상이한 것으로 증명된다. 이러한 차이점들은 레이저 광을 구별하고 각각 고유의 라벨을 가지는 분자 나노 태그와 같은 단일 분자 검출 지점의 검출의 민감도를 더 증가시키기 위하여 선택된 파장에서의 다중 스펙트럼 검출 방법으로 사용된다. 측면 산란(SSC) 검출 시스템(118)은 유세포 분석 타겟(106) 및 다중 파장 조명 빔(104)의 측면으로, 예를 들어 유체 스트림(108) 및 다중 파장 조명 빔(104)의 방향에 수직하게, 일반적으로 전파되는 다중 파장 검출 빔(120)을 수신하고 검출하도록 배치된다. 대표적인 예에서, 측면 산란이란 용어는 유체 스트림(108)과 같은 스트림에 현탁된 입자에 의하여 광 산란되는 것을 의미하며, 조명원으로부터 상기 입자에 의하여 수신되는 광의 전파 방향에 대하여 5도 내지 180도의 전형적인 범위의 각도로부터 수집된다. 다중 파장 검출 빔(120)은 다중 파장 조명 빔(104) 및 미립자 (110) 및 유세포 분석 타겟(106)의 나노 태그(112a, 112b) 사이의 탄성 충돌에 의하여 생성된다. 대표적인 SSC 검출 시스템(118)은 하나 이상의 애벌란시 광 다이오드(avalanche photodiode), 단일 광자 검출 애벌란시 광 다이오드(single-photon detecting avalanche photodiode), 광전자증배관(photo-multiplier tube), 실리콘 광전자증배기(silicon photomultiplier), 또는 3D 고해상도, 고감도, 고 프레임 레이트(frame rate) 광 필드 컬러 기록 소자 또는 이들의 조합을 포함하는 광학 검출기를 포함한다.
대표적인 예에서, 상이한 파장 또는 상이한 대역에 대한 나노 태그의 미에 산란 특성은 수치적으로 모델링될 수 있어, 검출된 산란 및 유세포 분석 타겟(106) 내의 하나 이상의 나노 태그의 존재 사이의 대응이 결정될 수 있다. 예를 들어, 405 nm에서 또는 그 부근에서 검출된 탄성 산란은 EV 에 결합된 은 나노 태그에 대응할 수 있고, 532 nm 에서 또는 그 부근에서 검출된 탄성 산란은 EV 에 결합된 금 나노 태그에 대응할 수 있다. 그러므로 유세포 분석 타겟(106)은 예를 들어, 나노 태그(112a, 112b)와 같은 상이한 파장에서 각각 상이한 산란 특성을 생성하는 상이한 나노 태그 유형이 측면 산란 검출 시스템(118)에 의하여 검출될 수 있도록, 다중 파장 조명 빔(104)으로 조사될 수 있다. 일부 예에서, SSC 검출 시스템(118)으로의 다중 스펙트럼 측면 산란 검출은 비산란(라만) 검출 또는 형광 검출과 결합될 수 있다. 또한, SSC 검출 시스템(118)의 수집 광학계(또는 미세 유체 유세포 분석기(100)의 다른 구성)은 미에 공명 특성을 이용하도록 형성도리 수 있고, 관련된 산란 출력은 구체적인 파장에서 (및 파장이 변함에 따라 뒤바뀌거나 이동되는) 미립자 직경에 따라 달라질 수 있다. 또는 소정의 나노 태그의 존재를 결정 또는 소정의 나노 태그 스펙트럼 프로파일을 가지는 검출 신호를 디컨볼루션 하는 과정은 미에 공명 특성을 이용함에 따라 더 향상될 수 있다.
미에 공명의 형상 및/또는 위치를 선택하는 것을 제공함에 따라, 모델링은 검출된 입자의 결정된 크기 또는 굴절률을 더 정확하게 결정하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 검출 시스템(118)은 단일 수집 광학계 세트를 포함하거나 수집 파라미터(예를 들어, 구체적인 수집 파장)을 정의하는 검출 시스템(118)으로, 파장에 따른 미에 공명의 전위(도 32에 도시)는 특정 크기의 입자의 존재 또는 부재를 나타내는 산란 단면의 소정의 변화를 제공할 수 있다. 일부 예에서, 검출 시스템(118)은 하나 이상의 수집 파라미터의 추가적인 세트를 포함하거나, 또는 유세포 분석 시스템은 수집 파라미터의 초기 세트에 대하여 선택된 파장(및 그에 따른 다른 파장)에서의 미에 공명의 소정의 전위를 제공하는 수집 파라미터의 추가적인 세트를 제공하는 추가적인 검출 시스템(추가적인 SSC 검출 시스템과 같은, 114 , 하단)을 포함할 수 있다. 이는 다중 파장 검출 빔(120)의 상이한 산란 파장이 상보적인 산란-직경 커브(도 26a 내지 26b와 같은)를 갖도록 한다. 예를 들어, 30도의 수집 반각을 가지는 검출 시스템은 405 nm 조명 파장에서 200 내지 300 nm 직경의 폴리스티렌 입자에서의 미에 공명을 보이며, 만약 조명 파장이 635 nm인 경우, 이러한 미에 공명은 380 - 500 nm까지는 보이지 않는다. 200 - 300 nm 입자로부터의 405 nm 신호 에서의 미에 공명이 있는 영역은 그러므로 635 nm 조명 파장의 사용으로 수정될 수 있으며, 380 - 500 nm에서의 635 nm 신호 에서의 미에 공명이 있는 영역은 405 nm 신호로 유사하게 수정될 수 있다(도 33).
SSC 검출 시스템(118)은 프로세서(124) 및 프로세서(124)에 결합된 메모리(126)를 포함하는 하나 이상의 컴퓨팅 소자를 포함할 수 있는 유세포 분석 제어 환경(122)을 포함하거나 이에 결합될 수 있다. 제어 환경(122)은 SSC 검출 시스템(118)의 하나 이상의 광학적 검출기의 선택된 검출기 채널에 대하여 산란된 광을 감지하는 한계 신호를 조정하도록 배치되는 검출기 임계값 선택기(detector threshold select, 128) 및 임계 신호 또는 검출기 임계값 선택기로부터 선택된 임계값에 기초하여 검출 이벤트를 작동시키는 SSC 검출 시스템의 하나 이상의 검출기 채널을 선택하도록 배치된 검출기 트리거 채널 선택기(detector trigger channel select, 130)를 포함한다. 각 검출 이벤트의 FSC 및 SSC 데이터는 미립자(110) 및/또는 나노 태그(112a, 112b)와 같은 선택된 물체에 관련된 소정의 SSC/FSC 산란 프로파일과 비교될 수 있고, 하나 이상의 물체 계수기(132a, 132b)는 양성 신호에 기초하여 증가할 수 있다.
일부 예에서, 추가적인 유체 스트림(108, 하지만 미립자(110) 없는) 검출기 채널을 가지는 가장 적은 추가적인 노이즈를 가지는 검출기 채널은 트리거로 선택되고, 선택된 채널에 대한 검출기 임계값은 유체 스트림(108)과 관련된 노이즈 레벨에서 또는 그 부근에서 선택된다. 다중 파장 조명 빔(104)으로 미립자(110) 및 나노 태그(112a, 112b)를 포함하는 유체 스트림(108)의 후속적인 조사 후에, 다중 파장 검출 빔(120)과 관련된 이벤트는 배경 노이즈를 최소화하도록 형성된 노이즈 스텝으로 검출되지 않을 수 있는 유세포 분석 타겟(106) 내의 물체의 존재 또는 부재를 결정하도록 미립자 없는 기준 노이즈와 비교될 수 있는 노이즈 샘플을 포함할 수 있다.
대표적인 예에서, 유세포 분석 제어 환경(122)은 하나 이상의 대표적인 광학 검출기에서의 다중 파장 검출 빔(120) 또는 유세포 분석 타겟(106)에서의 다중 파장 조명 빔(104)의 상이한 파장에 대한 초점 위치를 조정하도록 SSC 검출 시스템(118)에 결합된 SSC 초점 조절기(138)를 포함한다. 일부 예에서 하나 이상의 나노 입자에 대하여, 특히 복수의 나노 입자에 대하여, 파장 의존 측면 산란 특성(예를 들어, 강도, 출력)과 같이, 메모리(126)에 저장될 수 있는 다중 파장 측면 산란 프로파일(140)을 더 포함하여, 다중 파장 검출 빔(120)의 검출 특성은 나노 입자의 존재를 결정하기 위하여 다중 파장 측면 산란 프로파일(140)과 비교될 수 있다. 추가적인 예에서, 하나 이상의 디컨볼루션 알고리즘(142)은 상이한 나노 입자에 대응하는 광학 신호를 분리하기 위해 사용된다.
다른 실시예에서, 다양한 유형의 다중 파장 조명원(102)이 사용될 수 있으며, 이는 복수의 단색 레이저 및 광대역 또는 초연속 레이저 원을 포함한다. 일부 예에서, 조명 빔 조절기(136)는 파장 선택, 검출기 준비 등에 기초하여, 다중 파장 조명 빔의 타이밍 및/또는 생성을 조절하도록 사용될 수 있다. 일부 예에서, 부가적인 SSC 검출 시스템(144)은 다중 파장 검출 빔(120) 및 SSC 검출 시스템(118)에 인접한 유세포 분석 타겟(106)에 결합될 수 있고, 이는 예를 들어, 유세포 분석 타겟(106)의 반대편에 포함할 수 있고, 이로써 유세포 분석 타겟(106)에 의하여 산란되는 광을 포함하는 별개의 다중 파장 검출 빔(140)을 수신 및 검출할 수 있다. 일부 예의 장치에서, 하나 이상의 SSC 검출 시스템(118, 144)은 형광, 라만 또는 다른 광 파장과 같은 측면 산란 파장 이외의 광 및/또는 관심 있는 광학적 효과를 측정하도록 배치된다. 일부 예에서, 추가적인 SSC 검출 시스템(144)은 상이한 수집 각, 상이한 슬릿 개구 기하학적 구조 등을 가지는 상이한 수집 광학계와 같은 상이한 구성 특성으로 형성될 수 있고, 이는 입자 직경 및 입자의 각도 산란 분포 내의 미에 공명으로 인하여 수집되는 광 산란의 양 사이의 관계에 영향을 미친다(도 32에 도시된 것과 같이). 도 32에서 나타낸 바와 같이, 조명 파장이 증가함에 따라, 미에 공명 위치가 이동한다. 도 32가 입자 수준의 효과 등을 증명하는 반면, 도 33은 시스템 레벨의 효과를 나타내고, 여기서, 30도의 상대적으로 낮은 수집 각도에서의 수집으로, 미에 공명의 이동은 작은 입자로부터 큰 입자로 나타내어 진다. 몇몇 파장을 사용하고, 그러므로 이러한 커브 중 복수 또는 전부를 사용함으로써, 영역은 입자 직경의 산란 신호가 지속적으로 증가하고, 그러므로 크기의 정확한 추정이 가능하다는 것이 발견될 수 있다. 따라서 상이한 미에 공명 위치 특성과 관련된 별개의 검출 신호를 또한 얻음으로써, 크기 및 굴절률의 결정은 그 직경 범위에서 미에 공명을 가지지 않는 상이한 파장에서 해석되는 영역 때문에 일 파장에서 미에 공명이 나타날 수 있는 영역에서 얻어질 수 있다.
유세포 분석 제어 환경은 디지털 컴퓨터에 의하여 수행되는 소프트웨어 또는 펌웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 유세포 분석 기술 중 임의의 것은 컴퓨터의 일부 또는 유세포 제어 시스템의 일부인 연산 하드웨어(예를 들어, 하나 이상의 ASIC, FPGA, PLC, CPLD, GPU 등)에 의하여 수행될 수 있다. 유세포 분석 제어 환경(122)은 다중 파장 조명 빔(104), FSC, SSC 및/또는 형광의 감지를 조절하고 유세포 분석 미립자 및/또는 나노 태그의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 검출 빔 데이터를 비교 또는 분류하기 위하여 프로그래밍 되거나 형성되는 다중 파장 조명원(102), FSC 검출 시스템(114), SSC 검출 시스템(118) 및 추가적인 SSC 검출 시스템(144)에 연결되거나 또는 통신될 수 있다. 컴퓨터는 하나 이상의 프로세서(124, 프로세싱 소자) 및 메모리(126)를 포함하는 컴퓨터 시스템일 수 있고, 이는 유형(tangible)의 비일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함한다(예를 들어, 하나 이상의 광 매체 디스크, 휘발성 메모리 소자(DRAM 또는 SRAM과 같은), 비휘발성 메모리 또는 저장 소자(하드 드라이브, NVRAM 및 고상 드라이브(예를 들어, 플래시 드라이브)와 같은). 하나 이상의 프로세서(124)는 하나 이상의 유형의, 비일시적인
컴퓨터 판독 가능 매체에 저장된 컴퓨터 실행 가능 지시를 실행할 수 있고, 따라서 개시된 기술 중 임의의 것을 수행할 수 있다. 예를 들어, 개시된 실시예 중 임의의 것을 수행하기 위한 소프트웨어는 컴퓨터 실행 가능 지시로서 하나 이상의 휘발성이 있는, 비 일시직인 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있고, 이는 하나 이상에 의하여 실시될 때, 하나 이상의 프로세서가 개시된 조명/검출 기술 중 임의의 것을 수행하도록 한다. 유세포 분석 타겟(106)의 연산 및 감지된 광 특성의 결과는 하나 이상의 유형의, 비일시적인 컴퓨터 판독 가능 저장 매체에 저장될 수 있거나 및/또는 또한 예를 들어, 디스플레이 상에서, 디스플레이함으로써, 계수된 물체의 수, FSC/SSC 강도 또는 출력 데이터, 컨볼루션 또는 디컨볼루션된 SSC 데이터, 채널 선텍, 노이즈/트리거 레벨 등을 그래픽 사용자 인터페이스와 같이 사용자에게 출력될 수 있다.
도 2a는 다중 파장 조명 빔(204)을 생성하고, 유세포 분석 타겟(208)에 성형된 다중 파장 조명 빔(206)을 집광시키도록 배치된 광대역 레이저 소자(202, 예를 들어 초연속 레이저, 백색 레이저)를 포함하는 다중 파장 조명원(200)의 일 예를 나타낸다. 다중 파장 조명 빔(206)은 일반적으로 단색 레이저 소스에 비하여 더 큰 범위의 소정의 방출된 또는 여과된 파장을 가질 수 있다. 실시예는 일반적으로 가시광선 스펙트럼에 걸쳐 있으며, 약 350 nm 내지 1200 nm, 350 nm 내지 900 nm의 범위를 포함할 수 있지만, 다른 범위도 가능하다. 범위는 유세포 분석 타겟(208)의 기대되는 광 산란 특성에 기초하여 선택된다. 대표적인 실시예에서, 레이저 빔은 가우시안(gaussian), 슈퍼 가우시안(super gaussian), 트랜스버스 가우시안 탑-햇(transverse Gaussian Top-Hat) 또는 다른 집광되는 기하학적 구조를 가지는 하나 이상의 선택된 횡 방향 치수를 따라 5 - 10㎛ 이하의 허리 크기에 집광되고, 이는 비대칭 빔 프로파일 또는 수직축을 가로지르는 상이한 프로파일을 포함하며, 회절 한계 및 초점 깊이 및 거리에 기초한 조명 파장에 대한 실질적인 제한을 제공할 수 있다. 일부 예에서 빔 스팟은 원형 단면보다는 타원형 단면을 가질 수 있으며, 이는 빔 정렬을 용이하게 할 수 있다. 특히 타원형 빔 예는 유세포 분석 타겟(208)과 교체하는 빔 허리의 높이(유동 방향에 대응하는 높이로)는 5 - 10 ㎛의 범위일 수 있고, 빔 허리의 폭은 (유동의 횡 방향에 대응하는) 5 - 50 ㎛의 범위일 수 있다.
렌즈(예를 들어, 평면 볼록, 볼록-볼록, 구형, 비구형, 아크로매틱, 아포크로매틱, 원통형, 크로스 실린더), 거울 또는 렌즈 및 거울의 조합과 같은 빔 성형 광학계(210)는 광대역 레이저 소자(202)로부터 다중 파장 조명 빔(204)을 수신하고 다중 파장 조명 빔(204)의 전파 방향에 대응하는 광학 축(212)에 수직한 하나 이상의 축을 따라 발산을 감소시키도록 배치된다. 전형적인 예에서, 빔 성형 광학계(210, 다른 예에서의 빔 성형 광학계 또한) 광섬유로 광대역 레이저 소자(202)에 광학적으로 결합될 수 있지만, 공기, 다른 매체 또는 추가 요소들을 통한 자유 공간 결합 또한 가능하다. 대표적인 예에서, 빔 성형 광학계(210)는 빔 성형 광학계(210)의 색수차 때문에 광학 축(212)을 따라 파장 기반 초점 오차를 가지는 유세포 분석 타겟(208)에서의 소정의 파장 범위와 관련된 다중 파장 조명 빔(204)을 집광하도록 배치된다.
복수의 이색성 광학 소자(214, 216, 예를 들어, 저역 통과, 고역 통과, 대역 통과)는 유세포 분석 타겟(208)을 향하여 집광되는 다중 파장 조명 빔(204)을 수신하고 이색성 광학 소자(214, 216)의 광학 여과 특성과 연관된 각각의 파장 서브 밴드(*?*
1, 
2, 
3)를 가지는 복수의 각각의 조명 서브 빔(218, 220, 222) 내로 다중 파장 조명 빔(204)을 분리시키도록 배치된다. 복수의 빔 지향기(224, 226, 228, 230, 232, 234)는 도 2c의 단면에 나타난 것처럼 중첩시키거나, 도 2b의 단면에 나타난 것처럼 하나 이상의 선택된 방향과 인접하거나 이격되도록 조명 빔(218, 220, 222)을 재결합시키는 복수의 이색성 광학 소자(236, 238)로 조명 서브 빔(218, 220, 222)을 지향시키도록 배치된다. 일부 예에서, 하나 이상의 빔 지향기(224, 226, 228, 230, 232, 234) 및/또는 이색성 광학 소자(214, 216, 236, 283)는 인접한 구성에 조명 서브 빔(218, 220, 222)을 위치시키기 위한 각도 또는 형상이 된다. 일부 실시예에서, 성형된 다중 파장 조명 빔(206)의 조명 서브 빔(218, 220, 222)은 상이한 각도에서 유세포 분석 타겟(208)에 입사된다.
복수의 이색성 광학 소자(214, 216, 예를 들어, 저역 통과, 고역 통과, 대역 통과)는 유세포 분석 타겟(208)을 향하여 집광되는 다중 파장 조명 빔(204)을 수신하고 이색성 광학 소자(214, 216)의 광학 여과 특성과 연관된 각각의 파장 서브 밴드(△λ1, △λ2, △λ3)를 가지는 복수의 각각의 조명 서브 빔(218, 220, 222) 내로 다중 파장 조명 빔(204)을 분리시키도록 배치된다. 복수의 빔 지향기(224, 226, 228, 230, 232, 234)는 도 2c의 단면에 나타난 것처럼 중첩시키거나, 도 2b의 단면에 나타난 것처럼 하나 이상의 선택된 방향과 인접하거나 이격되도록 조명 빔(218, 220, 222)을 재결합시키는 복수의 이색성 광학 소자(236, 238)로 조명 서브 빔(218, 220, 222)을 지향시키도록 배치된다. 일부 예에서, 하나 이상의 빔 지향기(224, 226, 228, 230, 232, 234) 및/또는 이색성 광학 소자(214, 216, 236, 283)는 인접한 구성에 조명 서브 빔(218, 220, 222)을 위치시키기 위한 각도 또는 형상이 된다. 일부 실시예에서, 성형된 다중 파장 조명 빔(206)의 조명 서브 빔(218, 220, 222)은 상이한 각도에서 유세포 분석 타겟(208)에 입사된다.
빔 지향기(224, 226, 228)는 빔 성형 광학계(210) 및 유세포 분석 타겟(208) 사이의 조명 서브 빔(220, 222)의 광 경로 길이와 관련된 조명 서브 빔(218)의 광 경로 길이를 변화시키도록 배치되고, 빔 지향기(230, 232)는 조명 빔(218, 222)의 광 경로 길이와 관련된 조명 빔(220)의 광 경로 길이를 변화시키도록 배치된다. 조명 빔(218, 220, 222)의 광 경로 길이의 변화는 선택되어 유세포 분석 타겟(208)에서의 조명 빔(218, 220, 222) 사이의 초점 오차를 줄이거나 최소화할 수 있다. 광 결로 길이 변화는 반사 소자, 다른 소자 및 많은 소자에 도시되었지만, 경로 길이를 변화시키는 것은 프리즘을 포함할 수 있다고 이해하여야 할 것이다. 일부 예에서, 하나 이상의 투과성 광학 소자(예를 들어, 투명 재료의 직사각형 블록)는 각각의 조명 서브 빔(218, 220, 222)에 대한 경로 길이를 선택적으로 증가시키기 위하여 빔 위치를 밀거나 변위시키는 하나 이상의 조명 서브 빔(218, 220, 222)의 경로 내에 위치할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 이색성 광학 소자(214, 216, 236, 238) 또는 빔 지향기(224, 226, 230, 232, 234)는 투과성 표면과 비평행한 대향을 가질 수 있다.
도 3은 다중 파장 조명 빔(304, 광섬유 결합 빔)을 생성하고, 유세포 분석 타겟(308)에서 성형된 다중 파장 조명 빔(306)을 집광시키도록 배치되는 광대역 레이저 소자(302)를 포함하고, 다중 파장 조명원(200)과 일부 측면에서 유사 또는 동일할 수 있는 다중 파장 조명원(300)의 다른 예를 도시한다. 빔 성형 광학계(310)는 광대역 레이저 소자(302)로부터 다중 파장 조명 빔(304)을 수신하고, 성형된 빔(314)을 형성하도록 다중 파장 조명 빔(304)의 전파 방향에 대응하는 광학 축(312)에 수직한 하나 이상의 축을 따라 발산을 감소시키도록 배치된다. 일부 예에서, 성형된 빔(314)은 시준된 빔 에 대응하고, 다른 예에서 발산 또는 수렴 빔이 생성된다. 복수의 이색성 광학 소자(316, 318)는 성형된 빔을 수신하고 상이한 각각의 파장 서브 밴드(△λ1, △λ2, △λ3)를 가지는 조명 서브 빔(320, 322, 324)을 형성하도록 배치된다. 빔 지향기(325, 327)는 각각의 조명 서브 빔(320, 324)을 지향시키도록 배치되고, 추가적인 복수의 이색성 광학 소자(326, 328)는 도 3c에 도시된 바와 같이 중첩에 의해 또는 도 3b에 도시된 바와 같이 공간적 관계로 조명 서브 빔을 재결합하고 유세포 분석 타겟(308)에 집광되는 성형된 다중 파장 조명 빔을 형성하도록 배치된다. 복수의 포커싱 광학계(330, 332, 334)는 타겟(308)에서 각각의 조명 서브 빔(320, 322, 324)을 집광시키도록 배치된다. 상이한 일부 예에서, 조명 서브 빔(320, 322, 324)에 대한 초점 거리는 빔 성형 광학계(310)에 의하여, 즉 포커싱 광학계(3332, 334) 중 하나의 사용 없이 제공된다.
도 4는 상이한 각각의 파장(λ1, λ2, λ3)에서 각각의 레이저 빔(404a, 404b, 404c)을 방출하도록 배치되는 복수의 단색 레이저 다이오드(402a, 402b, 402c)를 포함하는 복수 파장 조명원(400)의 예를 나타낸다. 일반적으로 "단색(monochormatic)"이라고 하는 이러한 소스는 일반적으로 초연속 또는 광대역 소스와 관련된 좁은 파장 대역 내의 빔을 방출한다. 일부 예에서, 단색 레이저 빔은 1/e2의 반치전폭 또는 50 nm 이하, 10 nm 이하, 5 nm 이하, 1 nm 이하 또는 더 좁은 적절한 파장 대역 메트릭을 가질 수 있다. 유세포 분석 응용기기에서, 단색 레이저 소스의 파장 특성은 관심 있는 유세포 분석 대상의 탄성 또는 비탄성의 측면 또는 전방 산란 또는 형광 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 복수의 빔 성형 광학계(406a, 406b, 406c)는 레이저 빔(404a, 404b, 404c)를 각각의 반사 소자(408a, 480b, 480c)에 지향시키도록 각각의 레이저 빔(404a, 404b, 404c)에 결합될 수 있다. 일부 예에서, 반사 소자(408a)는 빔 방향(410)을 따라 레이저 빔(404a)을 지향시키도록 배치된 반사기이고, 반사 소자(408b, 408c)는 유세포 분석 타겟에서 서로 중첩되거나 인접하게 간격을 갖도록 배치되도록 레이저 빔(404a, 404b, 404c)을 빔 방향(410)으로 결합하도록 배치된 이색성 광학 소자이다.
대표적인 예에서, 레이저 빔(404a, 404b, 404c)은 빔 방향(410)과 평행하거나 동일 선상에 있다. 일부 예에서, 이색 필터링은 λ1 ＜ λ2 ＜ λ3 가 되도록 형성되지만,다른 배열 및 필터가 선택될 수도 있다. 빔 성형 광학계(406a, 406b, 406c)와 관련된 크로매틱 포커스 오차는(특히 동일한 특성을 가질 때) 수정되어 각각의 레이저 빔(404a, 404b, 404c)은 다양한 방법으로 유세포 분석 타겟(412)에 집광될 수 있다. 일부 예에서, 빔 성형 광학계(406a, 406b, 406c) 및 유세포 분석 타겟(412) 사이의 레이저 빔(404a, 404b, 404c)에 대한 각각의 광 경로 길이는 λ1 ＜ λ2 ＜ λ3 로 단색 레이저 다이오드(402a, 402b, 402c)를 정렬하는 것과 같은 것에 의하여, 초점 오차를 줄이도록 조정된다. 아크로매틱 또는 아포크로매틱 렌즈인 빔 성형 광학계(406a, 406b, 406c)에 대하여, 레이저 다이오드(402a, 402b, 402c)의 위치는 재정렬될 수 있고, 렌즈의 크로매틱 수정 프로파일에 따라 광 경로 길이가 재조정될 수 있다. 일부 예에서, 빔 성형 광학계(406a, 406b, 406c)는 각각의 레이저 빔(404a, 404b, 404c)의 광학 축을 따라 상이한 위치를 가질 수 있고, 및/또는 상이한 초점 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 빔 성형 광학계(406a, 406b, 406c)는 일반적으로 반사 소자(408c) 및 유세포 분석 타겟(412) 사이에 위치하는 각각의 레이저 빔(404a, 404b, 404c) 및 추가적인 포커싱 광학계를 시준할 수 있다. 추가적인 예에서, 반사 소자(408b, 408c)는 전파되는 빔을 클리핑(clipping)하지 않고 포커싱 되는 또는 시준되는 레이저 빔(404a, 404b)을 수신하도록 y 방향으로 충분한 간격을 갖는 반사기이다.
도 5는 유세포 분석 타겟(504)에 의하여 탄성적으로 산란되는 다중 파장 검출 빔(502)을 검출하도록 배치되는 측면 산란 검출 시스템(500)의 예를 나타낸다. 측면 산란 검출 시스템(500)은 유세포 분석 타겟(504)에 겔 결합되거나 다른 적절한 액침 물질에 결합될 수 있는 높은 개구 수 렌즈(예를 들어 1.2)와 같은 수집 광학계(506)를 포함한다. 일부 예에서, 수집 광학계(506)는 색 보정될 수 있다. 복수의 웨지 프리즘(wedge prism, 508a - 508 g)은 다중 파장 검출 빔(502)을 파장의 증가(또는 감소) 순서로 복수의 검출 서브 빔(510a - 510 e) 내로 다중 파장 검출 빔을 수신 및 분리하도록 배치된다. 마이크로 렌즈 어레이(512)는 각각의 광전자증배관, 애벌란시 광 다이오드 또는 다른 적절한 광학 검출기의 검출기 뱅크(516)에 각각의 검출 서브 빔(510a - 510e)을 집광하도록 배치된 복수의 마이크로 렌즈(514a - 514e)를 포함한다.
도 6은 도 6의 면 내 또는 면 외로 유동하는 유세포 분석 타겟(604)에 의하여 산란되는 다중 파장 조명 빔(602)으로부터 광을 검출하도록 배치되는 검출 시스템(600)의 예를 나타낸다. 전방 산란 검출 시스템(606)은 입사되는 전방 산란 빔(610)의 중앙 부분을 막도록 배치되는 차폐 바(obscuration bar)를 포함한다. 수집 광학계(612)는 광전자증배관(614) 또는 다른 적절한 광학 검출기로 전방 산란 빔(610)을 수집 및 지향하도록 배치된다. 측면 산란 검출 시스템(616)은 색 보정이 있거나 없는 높은 개구 수 렌즈와 같은 수집 광학계(618)를 포함하고, 이는 수집 및 지향시키도록 배치되고 애벌란시 광 다이오드와 같은 파장 특정 광학 검출기(622a - 622d)에 목표 평면으로 다중 파장 검출 빔을 집광시킨다.
복수의 이색성 광학 소자(624, 626, 628)는 상이한 파장에 따라 복수의 검출 서브 빔(630a- 630d) 내로 다중 파장 검출 빔을 분리하도록 배치된다. 일 예에서, 광학 검출기(622a - 622d)는 각각 예를 들어, 각각의 광학 검출기(622a - 622d)에 의하여 수용되는 검출 서브 빔(630a - 630d)의 광의 파장 범위를 좁히도록 10 nm 대역 통과 필터로, 각 445 nm, 488 nm, 532 nm 및 561 nm에 중심을 둔 파장을 검출하기 위하여 배치된다. 대표적인 예에서, 검출 서브 빔(630a - 630d)은 목표 평면에 수집 광학계(618)로 선택적으로 집광되고, 이색성 광학 소자(624, 626, 628) 및 각각의 광학 검출기(622a - 622d)는 검출 서브 빔(630a - 630d)의 파장 차이와 관련된 초점 오차를 수정하는 광 경로 길이를 제공하도록 선택적으로 이격된다. 도시된 바와 같이, 수집 광학계(618) 및 광 검출기(622a - 622d) 사이의 광 경로 길이는 검출된 파장이 증가함에 따라 증가한다. 일부 예에서, 광학 검출기(622a - 622d)의 상이한 공간적 배열은 수집 광학계(618)와 연관된 크로매틱 델타-포커스(chromatic delta-focus) 프로파일 에 기초하여 선택될 수 있고, 이색성 광학 소자, 대역 통과 필터 및 광학 검출기 사이의 거리는 높은 개구 수 렌즈의 델타 포커스에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 예에서, 이미지화하도록 배치된 하나 이상의 이미지 여과 개구는 각각의 입사 검출 서브 빔(630a - 630d)을 여과하고, 다양한 위치에 위치할 수 있으며, 이는 가장 가까운 광학 검출(622a - 622d)기 또는 이색성 광학 소자(624, 626, 628)를 포함한다. 일 예에서, 단일 개구는 수집 광학계(618) 및 이색성 광학 소자(624) 사이에 위치할 수 있다.
다른 예에서, 다중 파장 검출 빔(620)의 선택된 파장은 다중 파장 검출 빔(620) 반대편으로 지향된 분리된 다중 파장 검출 빔(634)을 수신하도록 배치되는 분리된 측면 산란 검출 시스템(632)에 의해 검출될 수 있다. 측면 산란 검출 시스템(632)은 애벌란시 광 다이오드와 같은 하나 이상의 광학 검출기로 다중 파장 검출 빔(634)을 수집 및 지향하도록 배치되는 수집 광학계(636)의 다른 세트를 포함한다. 구성에 따라, 이색성 광학 소자의 배열은 다중 파장 검출 빔(634)을 검출되는 복수의 서브 빔 내로 분리시키도록 사용될 수 있다. 일 예에서, 다중 파장 검출 빔(634)의 단일 파장(405 nm)은 애벌란시 광 다이오드와 같은 광학 검출기에 대응하여 검출된다. 일부 예에서, 광학 이미지 여과 개구(639)는 다중 파장 검출 빔을 광학적으로 이미지 필터링 하기 위하여 수집 광학계(636) 및 광학 검출기(638) 사이에 위치한다. 일부 예에서, 다중 파장 검출 빔(634)의 선택된 서브 빔 파장은 추가적은 광학 검출기 및 광학 검출기(622a - 622d)와 관련된(예를 들어, 수집 광학계(618) 및 이색성 광학 소자(624) 사이 또는 인접한 검출기들 사이) 이색성 광학 소자 쌍 및/또는 선택된 서브 빔 파장의 관련된 크로매틱 델타 포커스를 위치시키는 것과 관련된 공간 제한과 관련하여 측면 산란 검출 시스템(616)보다는 측면 산란 검출 시스템(632)으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정 파장에 대한 델타 포커스 내의 큰 변화(UV와 같은)는 측면 산란 검출 시스템(616)보다는 측면 산란 검출 시스템(632)으로 검출될 수 있다. 일부 예에서, 아크로매틱 또는 아포크로매틱 프로파일을 포함하는 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일은 상대적으로 이격된 선택된 파장이 상대적으로 가까운 델타 포커스를 가지도록 할 수 있다.
도 7에서, 도 7의 평면 내 또는 외로 유동하는 유세포 분석 타겟(704)에 의하여 산란되는 다중 파장 조명 빔(702)으로부터 광을 검출하도록 배치되는 검출 시스템(700)의 예를 나타낸다. 전방 산란 검출 시스템(706)은 입사되는 전방 산란 빔(710)의 중앙 부분을 막도록 배치되는 차폐 바(708)를 포함한다. 수집 광학계(712)는 전방 산란 빔(710)을 광전자증배관(714) 또는 다른 적절한 광학 검출기로 수집 및 지향하도록 배치된다. 측면 산란 검출 시스템(716)은 높은 개구 수 렌즈와 같은 수집 광학계(718)를 포함하고, 이는 광 이미지 여과 유닛 및 애벌란시 광 다이오드와 같은 파장 특정 광 검출기(724)로 다중 파장 검출 빔(720)을 수집 및 등록하도록 배치된다. 일부 예에서, 높은 개구 수 렌즈는 색 보정될 수 있다. 광학 이미지 여과 유닛(722)은 다중 파장 검출 빔(720)의 인접한 입사 산란 빔을 수신 및 여과하기 위한 복수의 광 필터를 포함할 수 잇고, 광 이미지 여과 유닛(722)은 각각의 파장 특정 광 검출기(724)로 결합된 빔을 지향시키는 광 섬유(726) 내로 여과된 측면 산란 빔을 광학적으로 결합시킬 수 있다.
도 8a는 색 보정된 다중 요소 고 개구 수 렌즈와 같은 수집 광학계(804)로 유세포 분석 타겟(802)에 광학적으로 결합된 광학 이미지 여과 유닛(800)의 예를 나타낸다. 광 이미지 여과 유닛(722)의 일부 실시예는 광학 이미지 여과 유닛(800)을 포함할 수 있다. 대표적인 예에서, 유세포 분석 타겟(802)은 유동 셀(803) 내에서 전파하고 수집 광학계(804)는 광을 수신하는 유동 셀(803)에 겔 결합한다. 상이한 각각의 파장(λ1, λ2, λ3)을 가지는 복수의 레이저 빔(806a, 806b, 806c)은 다중 파장 조명 빔을 형성하고 유세포 분석 타겟에 일반적으로는 평행하게 지향되며, 레이저 빔(806a - 806c)의각각의 빔 초점은 유세포 분석 타겟 또는 그 부근에 배치된다. 수집 광학계(804)는 레이저 빔(806a - 806c)의 각 파장에서 탄성 측면 산란 광을 수집하고, 복수의 각 광 섬유(810a, 810b, 810c)로 각각의 검출 빔(808a, 808b, 808c)을 형성 및 지향한다. 광 섬유(810a - 810c)는 집광된 검출 빔(808a - 808c)을 각각 수신하도록 배치된 각각의 개구(814a, 814b)를 포함하는 각각의 제1 단부(812a, 812b, 812c)를 포함한다. 광 섬유(810a - 810c)의 대향되는 각 단부는 애벌란시 광 다이오드와 같은 각 광학 검출기에 광학적으로 결합될 수 있다. 일부 예에서, 광 이미지 여과 유닛(800)은 유세포 분석기의 유동 셀 형광/산란 수집 광학계의 반대편의 기존의 유세포 분석기에 대한 모듈식 추가 장치로서 사용될 수 있다.
일부 예에서, 광 이미지 여과 유닛(800)은 고 해상도 기구에서 레이저 당 특정 형광단의 해상도를 향상시키도록 사용될 수 잇다. 광 이미지 여과 유닛(800)은 특정 파장에서의 검출에 대한 신호 대 파장의 비율을 증가시킬 수 있다. 형광단의 측면 산란 및 피크 방출 파장을 포함하는 선택된 파장으로의 광학 여과 유닛(800) 정렬은 선택된 파장에서의 신호 대 노이즈 비율의 증가를 가능하게 할 수 있다. 종래의 형광 세포 분석기는 일반적으로 형광의 몇 가지 색을 검출하도록 최적화되었으며, 따라서 선택된 파장에 대한 최적화된 초점이 아닌 신호에 대한 감소된 신호 대 노이즈 비율을 가지며, 이에 선택된 파장에서의 수집 각도의 감소는 검출기에 도달하는 광량을 감소시킨다. 추가적으로 종래의 유세포 분석기는, 일반적인 전방 산란 및 측면 산란 사이의 크기-입도 비교가 단일 채널에서 이루어질 수 있으므로, 다중 채널에서 측면 산란을 검출할 수 없다.
개구(814a - 814c)는 일부 예에서 원형일 수 있고, 또한 유세포 분석 타겟(802)의 이동 방향에 평행하도록 연장되는 슬릿의 더 긴 치수를 가지는 슬릿으로 형성될 수 있다. 도 8b - 8d는 개구(815a, 815b, 815c)의 추가적인 예를 나타낸다. 수직 축(817a, 817b, 817c)는 유세포 분석 타겟(802) 방향의 움직임에 대응할 수 있다. 일부 실시예에서, 상이한 개구의 기하학적 구조는 선택될 수 있고, 상이한 파장(및 상응하는 산란 입자)에 대한 특징적인 특성에 기초하여, 상이한 선택된 파장 사이를 포함한다. 일부 예에서, 기하학적 구조는 다른 입자 또는 산란 파장과 관련된 선택된 미에 공명의 감소에 기초하여 선택된다. 개구의 기하학적 구조 선택은 스펙트럼 디컨볼루션을 돕거나 나노 입자의 존재 또는 나노 입자 사이의 유형을 식별하는 산란-직경 관계를 개선시킬 수 있다. 일부 예에서, 선택된 개구의 기하학적 구조는 하나 이상의 축에 대하여 대칭일 필요는 없다.
다른 예에서, 슬릿 또는 구형 개구 폭(직경)은 50㎛ 이하, 100㎛ 이하, 200㎛ 이하, 300㎛ 이하 또는 500㎛ 이하로 연장 될 수 있고, 개구 치수는 집광된 레이저 빔(806a - 806c)의 이미지 크기, 광 섬유(810a -810c)의 도파관 치수 및 수집 광학계(804)의 개구 수보다 적을 수 있는 광 섬유(810a - 810c)의의 개구 수와의 관계가 정의될 수 있다. 다른 치수 도 가능하지만, 집광된 레이저 빔(806a - 806c)의 이미지 크기에 관련된 더 좁은 슬릿 치수는 검출 빔(808a)과 같이, 입사 검출 빔의 파장에서의 광을 포함하는 광 노이즈 여과의 개선을 제공할 수 있고, 이는 배경 노이즈와 관련된다. 배경 노이즈는 유세포 분석 타겟(802) 주위 및 입사 검출 빔 및 유세포 분석 타겟(802)에 인접한 레이저 빔(806)과 같은 상응하는 조명 빔에 의하여 형성되는 평면 내에서 연장하는 회절 링과 관련된 광을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 제1 단부(812a - 812c)는 입사 검출 빔(808a -808c)의 방향(예를 들어, 도 8a에 나타난 z축)을 따라 포함하는, 하나 이상의 방향을 따라 제1 단부(812a - 812c)를 각각 병진시키도록 배치된다. 독립적인 병진은 수집 광학계(804)의 크로매틱 델타 포커스 프로파일과 관련된 검출 빔(808a- 808c) 사이의 포커싱 거리 변화에 대하여 보정하는 입사 검출 빔(808a - 808c)의 방향을 따라 각각의 제1 단부(812a - 812c)를 서로 이격될 수 있는 작은 조정을 제공할 수 있다. 일부 예에서, 병진 스테이지(816a - 816c)는 입사 검출 빔(808a -808c)의 전파 방향 및 유세포 분석 타겟(802) 유동 방향에 일반적으로 수직한 길이 방향(예를 들어, 도 8a에 나타난 x축)을 따라 제1 단부(812a - 812c)를 각각 병진시키도록 배치된다.
일부 예에서, 개구(814a - 814c)는 예를 들어, 삽입을 통하여 단면(822a - 822c)을 수신함으로써, 서로 광학적으로 융합됨으로써, 공기 또는 다른 매체로 이격시킴으로써 또는 편리한 다른 방식으로 광 섬유(810a -810c)의 단면(822a, 822b, 822c)에 광학적으로 결합되는 각각의 광학 블록(820a, 820b, 820c) 상에 배치된다. 광학 블록(820a -820c)을 위한 예시적인 재료는 양극산화된 알루미늄과 같은 금속을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 개구(814a - 814c)에 인접한 광학 블록(820a -820c)의 영역은 광학 흡수성(일반적으로 넓은) 및 비 형광성으로, 그렇지 않으면 하나 이상의 광 섬유(810a - 810c)에 광학적으로 결합되어 신호 품질이 낮아질 수 있는 입사 또는 반사된 미광을 감소시킨다. 추가적인 실시예에서, 개구(814a - 814c)는 도파관의 기하학적 구조(예를 들어, 원형 코어 또는 직사각형 슬릿 형태 코어) 또는 선택된 개구 형상에 대응하는 선택적인 반사성 코팅 응용에 기초하여 광 섬유의 각 단면(822a -822c) 상에 정의된다.
도 9는 유세포 분석기 내의 나노 태그 검출 방법(900)의 예를 나타낸다. 902에서, 다중 파장 조명 빔은 조명원에 의해 생성되고, 유세포 분석 타겟으로 지향된다. 904에서, 다중 파장 조명 빔은 유세포 분석 타겟에 의하여 탄성적으로 측면 산란되며, 906에서 탄성적으로 측면 산란된 다중 파장 조명 빔에 의하여 형성되는 다중 파장 검출 빔의 복수의 검출 서브 빔은 다중 파장 조명 빔의 상이한 파장에 대응하는 상이한 나노 태그의 존재를 결정하도록 검출된다.
도 10은 유세포 분석 타겟에서 지향되는 다중 파장 조명 빔을 결합하는 방법(1000)을 나타낸다. 1002에서, 광대역 다중 파장 조명 빔은 초연속 레이저와 같은 광대역 소스로부터 제조된다. 1004에서, 광대역 다중 파장 조명 빔은 각각 상이한 파장 서브 밴드를 가지는 복수의 조명 서브 빔 내로 분리된다. 1006에서, 조명 서브 빔은 상이한 각각의 광 경로를 따라 유세포 분석 타겟에 지향되어 조명 서브 빔은 상이한 파장 서브 밴드의 크로매틱 포커싱 거리 변화에 기초하여 유세포 분석 타겟에 집광된다. 다중 파장 검출 빔은 파장에 따라 분리되는 복수의 검출 서브 빔 내로 프리즘 배열을 이용하여 다중 파장 검출 빔을 분리함으로써 검출될 수 있다. 서브 빔 검출은 검출 서브 빔을 각각 집광시키도록 배치되는 각각의 마이크로 렌즈를 가지는 마이크로 어레이로 수신될 수 있고, 검출 서브 빔은 광학 검출기의 각각의 검출기 채널로 마이크로 렌즈에 의해 집광될 수 있다.
도11은 유세포 분석 타겟과 공간적으로 인접하거나, 동일 선상이거나, 공통된 위치로 집광되는 복수의 단색 레이저 빔을 포함하는 다중 파장 조명 빔으로 형성되는 다중 파장 검출 빔을 검출하는 방법(1100)의 예를 나타낸다. 대표적인 예에서, 수집 광학계는 유세포 분석 타겟에 광학적으로 결합된다. 1102에서, 다중 파장 검출 빔은 복수의 검출 서브 빔 내로 다중 파장 검출 빔을 분리시키도록 적어도 하나의 이색성 광학 소자에 의하여 수집 광학계로부터 수렴적으로 수신되어, 다중 파장 검출 빔의 상이한 단색 파장 중 하나에 각각 대응된다. 1104에서, 검출 서브 빔은 수집 광학계에 의하여 제공되는 포커싱 거리 및 수집 광학계의 색수차 프로파일과 관련된 검출 서브 빔 사이 초점의 광 경로 길이 차이에 기초한 이색 성 광학 소자에 대하여 공간적 관계로 배치되는 각각의 광학 검출기로 수신된다.
도 12는 유세포 분석 타겟의 반대편 상에 위치하고 및 유동 방향에 수직한 다중 파장 검출 빔을 검출하는 방법(1200)의 예를 나타낸다. 1202에서, 다중 파장 검출 빔의 제1 부분은 수집 광학계의 제1 세트에 의해 수신된다. 1204에서, 제1 파장을 가지는 제1 부분의 검출 서브 빔은 광학 검출기에 의해 검출된다. 1206에서, 다중 파장 검출 빔의 제2 부분은 제1 수집 광학계로부터 유세포 분석 타겟에 대향되도록 배치되는 수집 광학계의 제2 세트에 의해 수신된다. 1208에서, 제2 파장을 가지는 제2 부분의 검출 서브 빔은 제1 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일과 관련된 수집 광학계의 제1 세트에 의하여 제1 파장을 가지는 검출 서브 빔 및 제2 파장을 가지는 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 공통성 및 포커싱 거리 차이 중 하나 이상에 기초하여 개별적으로 검출된다.
도 13은 광 이미지 여과 유닛으로 유세포 분석 타겟으로부터 수신된 다중 파장 검출 빔을 검출하는 방법(1300)의 예를 도시한다. 1302에서 복수의 단색 레이저 빔은 유세포 분석 타겟의 인접한 위치에 집광된다. 1304에서, 수집 광학계는 광 섬유에 인접한 제1 단부에서, 원형 개구 또는 슬릿 개구를 포함하는 각각의 개구로 탄성적으로 측면 산란된 검출 서브 빔을 지향시킨다. 대표적인 예에서, 개구는 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일과 관련된 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 변화에 기초한 서브 빔의 공통된 전파 방향을 따라 서로 이격된 관계에 있다.
도 14는 파장의 연속적인 범위를 포함하는 복수의 파장에서 탄성 산란 또는 준탄성 산란을 검출하도록 배치된 미세 유체 소자(1400)의 구성의 예를 나타낸다. 일부 예에서, 초연속 백색 레이저(1402) 또는 복수의 단색 레이저 또는 광대역 소스를 포함하는 다중 파장 조명의 대안적인 유형은 빔 성형 광학계(1104)와 광학적으로 결합하고, 이는 미세 유체 또는 다른 유체 소자의 인테로게이션 챔버(1406)에 광학적으로 결합되고, 여기서 샘플(1408)은 현탁된다. 조명된 샘플(1408)으로부터의 준탄성 입자 산란은 영상 기록 소자(1412)로 기록하기 이전에 하나 또는 일련의 수집 광학계(1410)에 결합된다. 대표적인 예에서, 광 기록 소자(1412)는 3D 고해상도, 고감도, 고 프레임 레이트의 광 필드 컬러 기록 소자이다.
실시예 1: 나노 태그 조성물의 스펙트럼 특성
높은 탄성 산란 출력 또는 개별적으로 정량화할 수 있는 높은 비탄성 산란(형광 또는 라만 산란)을 포함하는 광학 특성을 가지는 단일 분자 나노 태그는, EV또는 관심 있는 단일 에피토프(epitope)에 결합하는 것에 기초한 다른 물질을 검출 및 분류하는 것을 가능하게 한다. 표현형(Phenotyping) 서브세트는 한 번에 하나보다 많은 에피토프의 라벨링을 요구하는 강력한 도구다. 하나보다 많은 에피토프를 동시에 라벨링하기 위하여, 서로 구별하기 위하여 독특한 광학적 특성을 갖는 제2 또는 그 이상의 나노 태그를 사용하는 것이 바람직하다. 도 23에 도시된 바와 같이, 상이한 금속은 굴절률 및 흡광 계수에 대하여 UV-가시광선 스펙트럼에서 구별되는 분산 특성을 갖는다. 도 24에 나타난 것들과 같은 이러한 광학적 성질은 RefractiveIndex.info와 같은 온라인 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
분자 나노 태그는 형광 검출 신호보다는 탄성 측면 산란 검출 신호를 가지는 단일 분자 타겟의 표현형을 가능하게 하도록 다양한 조성물을 갖는 나노 입자의 특징적인 광학적 특성을 사용할 수 있다. 상이한 나노 입자 직경 및 조성의 산란 특성은 미에 이론에 기초한 레이저 산란 물리학 모델을 사용함으로써 조사될 수 있으며, 나노 태그 조성물은 예측된 산란 특성에 기초하여 유세포 분석기로 검출하기 알맞도록 선택된다. 미에 이론을 사용하여, 구의 산란되는 단면을 근사화할 수 있으며, 상이한 파장에서의 산란 프로파일에서 식별되는 피크 또는 골을 가지기 때문에, 복수의 입자를 동시에 구별하는 방법을 추론할 수 있다. 이러한 방법은 상이한 직경 및 조성의 입자를 검출하기 위하여, 예를 들어, 405 nm SSC, 488 nm SSC, 561 nm SSC, 640 nm SSC와 같이, AstriosEQ에 의한 것과 같이, 상이한 레이저 파장에서 다중 측면 산란 검출기로 유세포 분석기의 성능을 예측하기에 유용하다.
이러한 모델링 기술은 도 15a - 15d에서와 같이, 금, 은, 폴리스티렌, 백금, 이산화 티타늄, 산화철 및 구리를 포함한 상이한 재료에 적용 가능하다. 도 15a - 15d에서 볼 수 있듯이, 약 20 - 60nm 구의 작은 입자는 금 및 은과 같이 구별되는 스펙트럼 피크 및 골을 초래하였다. 또한, 금, 구리 및 은과 같은 금속은 입자 검출을 향상시킬 것으로 예측될 것으로 보인다(예를 들어, 폴리스티렌과 비교하여). 예를 들어, 20 nm 은 구체는 380 nm의 조명 파장에서 ~1 × 10-16 m2 sr-1의 산란 단면을 가지고 40 nm의 금 구체는 532 nm의 조명 파장에서 ~1 × 10-16 m2 sr-1의 산란 단면을 갖는다.
상이한 조성의 입자의 이러한 고유한 산란 특성은 형광이 사용되는 대신에 산란을 사용함으로써, 라벨링에 대한 스펙트럼적 접근을 가능하게 한다. 예를 들어, 도 15b 및 도 16a는 405 nm의 조명 파장에서, 60 nm 은 입자의 수집된 광 산란은 60 nm 금 입자에 비하여 ~100배 더 높다. 그러나, 561 nm의 조명 파장에서, 60 nm금 입자의 수집된 광 산란은 60 nm 은 입자에 비하여 5-10배 더 높다. 이러한 모델링된 데이터는 스펙트럼 산란이 사용되는 방법에 대한 원시적인 통찰을 제공하는 Astrios EQ 기기에서의 405 nm, 488 nm, 561 nm 및 640 nm의 조명 파장에서의 60 nm 은 및 금 구체를 얻음으로써 검증된다. 60 nm 은 입자(빨간색 또는 밝은 회색)의 수집된 산란을 예측하는 모델은 60 m 금(파란색 도는 어두운 회색)과 비교되는 561 nm 산란 채널에서 더 적었고, 60 nm 은 입자의 수집된 산란은 405 nm 산란 채널에서 60 nm 금보다 많았다.
그러므로, 특정 SSC에 기초하여, 이러한 기구에서 이용 가능하고, 여기에서 기술한 분자 나노 태그를 제조할 적절한 물질을 선택할 수 있다. 예를 들어, 기구가 405 nm SSC 검출기를 가지면, 은 나노 입자가 사용될 수 있고, 만약 기구가 561 nm 또는 532 nm SSC 검출기를 가지면, 금 나노 입자가 선택될 수 있다. 구체적인 예는 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1. 나노 입자 및 관계된 SSC 파장 피크의 예>
| 나노 물질 예 | 피크SS 검출기파장 |
| 은 나노 구체 | 350 내지 500 nm, 예를 들어405 nm |
| 금 나노 구체 | 500 내지 650 nm, 예를 들어532 nm, 561 nm |
| 금 나노 성게(nanourchin) | 650 내지 800 nm, 예를 들어700 nm |
| 은 및 금 | 조성 비율에 따라, 은 및 금의 중간 |
도 17a -17b는 금 및 은 나노 입자 사이의 스펙트럼 디컨볼루션 분석의 구현을 결정하기 위하여, 20 nm 및 40 nm의 금 및 은 입자로부터 수집된 산란의 관계를 나타낸다. 금 및 은 나노 입자의 수집된 산란은 은 및 금 산란의 비율에 따라 플로팅되었다. Ag/Au 선은 은 및 금의 수집 산란 출력의 비를 나타낸다. 검은 점선은 금의 수집된 산란 출력을 나타낸다. 검은 일점쇄선은 은의 수집된 산란 출력을 나타낸다. 수평선은 금 및 은의 산란 출력 비율이 1인 경우를 나타낸다. 점선은 100 nm의 수집된 산란 출력을 나타낸다. 은 및 금의 산란 비율은 은 입자로부터의 산란 광이 금보다 커지고(Ag/Au = 1인 수평선보다 위인- 350 nm 내지 510 nm), 금 입자의 수집된 산란이 은 입자보다 커지는(Ag/Au = 1인 수평선보다 아래인- 510 nm 내지 800 nm) 파장을 결정하도록 사용된다. 단색 레이저 조명 파장은 스펙트럼 산란 검출에 사용되는 스펙트럼 조명의 일 구현을 보여주기 위하여 그래프에 수직 선으로 겹쳐져 있다.
수집 광학계의 수집각 및 기하학적 구조는 입자 산란 및 그들의 직경 및 조성 간의 관계에 영향을 미칠 수 있다(도 26a - 26b에 도시된 것과 같이). 위의 모델의 두 번째 변형(도 18a)은 40 nm 금, 40 nm 은 및 100 nm 폴리스티렌(PS)에 대하여 20도에서 60도까지 2도씩 증가하는 전형적인 유세포 분석기 수집 반각에 의하여 모델링 된 입자들이 층을 이루도록 형성된다. 구체적인 스펙트럼 특성은 도 17a에 나타나 있다. 도 18a는 수집 반각의 광학 검출기에 의하여 수집되는 산란 출력에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 그러나 도 18b는 모든 수집 반각에 걸쳐 은 및 금의 비율이 겹쳐질 때, 비율이 동일하게 유지됨을 보여준다. 구체가 레일리(Rayleigh)범위 내에 있고, 등방성으로 빛을 산란시킴에 따라, 단일 디컨볼루션 방법은 상이한 수집 반각을 가지는 기기에 걸쳐 구체를 검출하도록 적용될 수 있다. 도 21a - 21b는 0 내지 500 nm 범위의 직경을 가지는 30도의 수집 반각에서 모델링된 금 및 은 사이의 산란 관계 상의 측면 산란 수집 광학계의 수집 각도의 효과를 나타낸다.
AstriosEQ 상의 405, 488, 561, 및 640 nm 조명 파장을 사용하는 금 및 은 스펙트럼 디컨볼루션 방법은 위의 모델과 결과를 기반으로 작성되었다. 도 22a 및 도 22c는 조명 파장에 의하여 층을 이루는 금 및 은 나노입자의 상이한 직경의 모델링된 산란 출력을 나타낸다. 도 22b 및 도 22d는 본 명세서의 스펙트럼 모델링 기술을 입증하기 위하여 모델링된 데이터와 비교되는 금 및 은 나오 입자 산란의 실제 성능을 나타낸다. 이러한 데이터는 예측된 모델링 데이터 및 얻어진 데이터가 매우 유사하다는 것을 다시 한 번 보여준다. 일부 예에서, 도 22b 및 도 22d에 나타난 데이터는 유세포 분석 기기 보정을 위한 상이한 분자 나노 태그 코어 재료로 구성된 대표적인 기준 비드 세트로서 사용될 수 있고 디컨볼루션 알고리즘의 기준 값을 얻기 위하여 사용될 수 있다. 디컨볼루션 알고리즘은 각 파장에서 입자 산란 모델링(도 20a-20b)을 가능하게 하는 기기를 보정하기 위한 기준 비드 데이터를 얻도록 사용될 수 있다. 보정 후 얻어진 신호는 얻어진 신호의 스펙트럼 산란 특성 및 기기의 산란 모델링에 기초하여 디컨볼루션될 수 있다. 예를 들어, 얻어진 신호 h는 유세포 분석 타겟 내의 다른 입자의 산란, 기기-특정 응답 특성 및 노이즈를 포함하는 산란 스펙트럼 프로파일 f를 가리기 위하여 작동되는 다양한 기능 구성을 가질 수 있는 함수 g로 컨볼루션(*)되는 산란 입자 스펙트럼 프로파일 f에 대응할 수 있다. 일부 예에서, 기기-특정 응답 특성은 구성 선택(예를 들어, 광대역 또는 초연속 조명원, 유세포 분석 타겟이 유동하는 큐벳(cuvette) 기하학적 구조, NA와 같은 수집 렌즈 특성, 슬릿 개구 기하학적 구조, 검출기로 조정되는 검출기 민감도 및/또는 필터 선택)에 의하여 조정될 수 있고, 검출 민감도는 미에 공명에 일치되거나, 구체적으로 일치되지 않을 수 있다. 일 실시예에서, 다중 검출 유닛은 검출 동안 미에 공명을 이용하기 위하여 상이한 소정의 수집 각을 갖는 수집 렌즈로 각각 측면 산란을 검출하도록 배치될 수 있다. 다른 실시예에서, 단일 검출 유닛은 검출 동안 미에 공명을 이용하도록 형성될 수 있다. 대표적인 예에서, 유세포 분석 수집 광학계는 수집 광학계 수집 각도에 대한 예측을 제공하도록 모델링될 수 있으며, 실제 수집 각도에 대응하여 검증될 수 있다. 대표적인 기기는 알려진 크기 및 굴절률의 비드로 보정될 수 있다. 검출된 입자의 직경 또는 굴절률은 검출된 산란 특성 및 수집 각도에 기초하여 추론될 수 있다. 산란 특성 및 수집 각은 상이한 스펙트럼 산란 특성을 가지는 복수의 상이한 입자에 대한 정보를 포함하는 검출 신호의 디컨볼루션을 보조하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 다른 예에서, 상이한 크기의 나노 태그는 검출될 수 있거나, 동일한 크기지만 상이한 스펙트럼의 나노 태그 또는 특정 EV가 검출될 수 있고, 이는 부착된 나노 태그를 포함한다.
검출 기술로서 적용 가능성을 나타내는 단일 금 및 은 나노 입자를 검출하는 상이한 상업적인 유세포 분석기의 성능은 BD FACS Symphony 유세포 분석기(도 25) 상의 다양한 금 및 은 나노 입자에 의하여 또한 보여질 수 있다.
실시예 2: 나노태그 검출을 위한 예시적인 레이저 정렬
다중 측면 산란 파장에서의 측면 산란 검출에 기초한 에피토프 검출에 대하여, 나노 태그를 사용하는 것은 상이한 입자 조성의 탄성 산란에 의존할 수 있다. 그러므로 대표적인 실시예는 동시에 사용 및 검출될 수 있는 나노 태그 조성물의 수를 증가시키기 위하여, UV-가시광선 스펙트럼에 걸쳐 파장 또는 파장 범위를 갖는 다중 파장 조명 입력을 사용한다. 다른 예에서, 예시적인 방법에 의하여, 나노 태그의 광범위한 스펙트럼 조명을 제공하기 위하여, 나노 태그를 검출할 수 있는 광학 소자로 도 1 또는 도 2a에 도시된 것과 같은 초연속 백색 레이저를 사용할 수 있다. 추가적인 예에서, 단색 레이저가 사용될 수 있다. 일부 유세포 분석 시스템 예에서, 분리된 빔은 동일 선상으로 정렬된 파장 도는 다른 구성으로 공간적으로 분리된 파장으로 배열될 수 있다. 유세포 분석 조명 빔 입력 예는 예를 들어, 도 2a-4a에 도시된 것과 같이, 레이저 빔의 가장 높은 강도 부분이 유세포 분석 타겟의 코어 스트림 상에 집광되는 것을 보장하기 위하여 파장 특정 초점 거리의 차이를 설명할 수 있다. 일부 예에서, 필터는 또한 상이한 파장에 대하여 레이저 빔을 공간적으로 분리하도록 사용될 수 있다. 백색광 초연속 광원을 갖는 일부 예에서, 빔 성형 광학계는 필터 이전, 사이 또는 이후에 포함될 수 있다. 단색 레이저 소스의 경우, 빔 성형 광학계 그 자체 또는 빔 지향 거울은 레이저 빔을 공간적으로 분리하도록 이동될 수 있다.
실시예 3: 나노 태그 검출을 위한 백색광의 사용
개시된 분자 나노 태그는 백색 또는 광대역 광 조명(예를 들어, 단색 레이저 대신)을 사용하여 검출될 수 있다. 단일 분자 나노 태그 스펙트럼 산란 분석은 파장에 기초한 조명을 분리하기 위한 프리즘 어셈블리를 통하여 백색 광 조명을 가지는 검출 빔을 지향시키고, PMT/APD 검출기 어레이(32 채널 PMT/APD 검출기 어레이와 같은)로 집광되는 빔을 검출함으로써 달성될 수 있다. 이 예에서, 전체 스펙트럼 산란 유세포 분석은 전체 UV-가시광선 파장에서의 조명을 제공하는 초연속 백색 레이저를 사용할 수 있다. 백색광은 입자가 현탁된 코어 스트림 상에 집광될 수 있다. 입자 광 산란은 높은 개구 수 색 보정 렌즈를 사용하여 조명 관과 수직하게 수집될 수 있다. 이러한 광은 UV-가시광선 산란 검출을 제공하는 다중 채널 광 검출기에 순차적으로 집광되는 광의 파장을 분리하도록 일련의 프리즘에 집광될 수 있다. 대역통과 필터는 프리즘 및 다중 채널 광 검출기 사이에 위치할 수 있다. 일부 예에서, 선택된 채널은 검출 민감도를 증가시키기 위하여 더 큰 파장 범위에 걸친 산란을 검출할 수 있다. 빔 성형 광학계 또는 빔 성형 시스템은 다중 파장 조명의 초점의 작은 변화를 제공하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 백색 광원으로부터의 다중 파장 조명은 조명의 대역으로 분할되며 복수의 빔 성형 광학계에 동일 선상으로 정렬될 수 있다.
실시예 4: 나노 입자 산란 및 유세포 분석 모델링
소정의 직경 및 굴절률의 주어진 입자로부터 수신하는 유세포 분석기의 광량을 모델링하고, 도 20B와 같이 산란-직경 커브를 생성하기 위하여, HAD(Half-Angle Determination, 반각 결정) 모델링 스크립트는 도 20a에서, 수집 반각을 결정하도록 사용된다. 이러한 모델링 방법은 Welsh, Joshua (2016) Flow cytometer optimisation and standardisation for the study of extracellular vesicles as translational biomarkers University of Southampton Doctoral Thesis, 209 pp에 의하여 구축되었고, 이는 원래 알려진 직경 및 굴절률(및 본 명세서에서 전체 참조로 포함되는)의 입자를 사용하여 산란-직경 관계 곡선(도 26b)를 생성하고 유세포 분석기(도 20a)의 수집 반각을 결정하도록 설계되었다. 이러한 광 검출기에 도달하는 빛의 수집 각을 제한하는 것을 결정하는 방법은 'Predicted Curves Only' 1000 방법 또는 'Wave Scan'(2000) 및 'Wave Scan'(3000) 방법과 같은 유세포 분석의 다른 모델링을 가능하게 한다.
도 19a에 도시된 것과 같은 'Predicted Curves Only' 1000 방법은 예측된 입자 산란 데이터로 얻어진 유세포 분석 데이터를 피팅/정규화할 필요 없이, 상이한 파장 및 수집 각에서의 다양한 직경의 입자의 산란 관계를 예측하도록 사용된다. AuRI(116) 및 AgRI(117) 스크립트는 금 및 은 모두의 광학적 특성을 상기 모델에 입력하기 위하여 'HAD 방법'으로부터 이전에 개발된 스크립트(114, 115, 200, 201, 202, 203, 220, 221, 222, 223, 2200, 2210, 2220)의 세트에 추가된다.
이러한 방법은 도 21a-d에서와 같이, 상이한 조명 파장에서 상이한 조성을 가지는 나노 태그의 산란 출력의 수집된 차이를 예측하도록 사용될 수 있다. 이러한 조성물 당 수집된 산란 입자를 이해하기 위한 접근은 얻어진 데이터를 미분하도록 하기 위한 최적의 분리를 갖는 직경/조성물의 식별을 가능하게 한다. 예를 들어, 만약 하나가 산란 수집 광학계를 가지는 405 nm 조명 레이저 유세포 구성을 가지고, 두 개의 40 nm 구체가 그들의 라벨링하도록 사용된다면, 그들의 조성은 40 nm의 폴리스티렌 구체 및 은 구체가 가장 높은 분리를 보이는 도 21a를 사용하여 결정될 수 있다.
'Predicted Curves Only' 1000 방법의 추정은 도 24h-24i의 'Wave Scan'(1000 & 2000)방법이고, 이는 알려진 직경 및 조성을 가지는 입자의 세트에 대한 최적의 조명 파장을 찾도록 설계되며, 이로써 입자 나노 태그 조성물에 대한 조명 또는 수집 광학계의 설계를 가능하게 한다. 이러한 방법은 UV-가시광선 스펙트럼(도 19b) 내의 다중 파장에 걸쳐 또는 다중 수집 반각(도 19c)에 걸친 분자 나노 태그 입자 세트 크기에 걸쳐, 궁금한 유세포 분석에 대한(알려지거나, 'HAD' 방법을 사용하여 결정된) 소정의 반각에서의 상이한 분자 나노 태그 조성물의 스펙트럼 산란 특성을 분석함으로써 스펙트럼 디컨볼루션을 보조하도록 사용될 수 있다.
스크립트(2000, 3000)는 모두 공통된 서브 스크립트를 사용하지만 상이한 출력을 제공하도록 구현된다. 이러한 스크립트와 관련된 도면 및 설명은 2017년 10월 23일자의 관련된 PCT 출원인 "Molecular Nanotags"에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 스크립트(2000)는 입자 파장에 대한 적절한 산란 특성을 가지는 조성을 결정 또는 선택하기 위하여 상이한 조성의 스펙트럼 산란 특성의 추정을 제공할 수 있다. 또한 모델링 방법(2000)의 출력은 스펙트럼 산란 측정에 적용되는 일반적인 스펙트럼 디컨볼루션 알고리즘에 대한 기초를 제공할 수 있다. 'Wave Scan'(3000)은 수집 각에 의하여 다중 파장에 걸친 입자의 산란 출력이 층을 이루게 한다. 입자 산란-직경 특성에서의 수집 각의 영향은 이에 따라 조사될 수 있다. 'Wave Scan'(3000) 방법을 사용하여, 도 18a-b에서의 금 및 은의 나노 태그 조성물 사이의 수집된 산란 출력 비율은 입자 산란 광 등방성으로 인하여 수집 각도에 관계 없이 유지된다.
또한, 금 및 은과 같은 상이한 나노 태그 조성물의 스펙트럼 산란 특성을 이해함으로써, 도 17a-17b의 단색 레이저 다이오드 소스의 경우에서, 최적의 조명 입력을 추론할 수 있다. 도 17a에 도시된 것은 40 nm의 금 및 은 구체, 100 nm의 폴리스티렌 구체의 스펙트럼 산란 특성 및 각 파장에서의 은 및 금의 산란 비율이다. 만약 초연속 백색 레이저와 같은 광대역 조명원을 사용하지 않는다면, 몇몇의 단색 레이저 다이오드 소스의 구현은 검출기인 나노 태그의 스펙트럼 산란 특성 내의 이해를 필요로 할 것이다. 도 17a에서와 같이 금 및 은의 경우, 405 nm, 445 nm, 488 nm, 532 nm, 561 nm 조명 파장(모두 판매되는 레이저 소스)의 프로빙은 스펙트럼 디컨볼루션 하도록 하는 산란에 대한 금 및 은의 조명 파장 내의 피크 및 골로부터 충분한 데이터를 제공한다. 이는 도 19a-b에서, 405, 488, 561, 640 nm의 파장에서의 조명 및 산란 검출을 갖는 상업적인 유세포 분석기(Astrios EQ)로 이미 이용하는 원시적인 방법으로 구현되었다.
본 명세서에서 논의된 파장 모델은 HAD 스크립트를 기초로 하지만, 몇몇 입자 조성물의 입력을 허용하기 위하여 다양한 물질의 분산 특성이 스크립트 내로 입력되도록 데이터베이스 내에 입력되었으며, AuRI 116, 은; AgRI 117, 폴리스티렌; poly RI Calculation 114, 백금; PtRI 118, 이산화 티탄; TiORI 2010, 산화철; Fe3O4 RI 119, 구리; CuRI 120, and 납; PbRI 121을 포함한다.
실시예 5 - 검출된 입자 산란 상의 광학적 개구의 효과
도 27에 도시된 것처럼, 분리 지수[(평균 큰 비드 산란 출력 - 평균 작은 비드 산란 출력)/(큰 비드 산란 출력 표준 편차+작은 비드 산란 출력 표준 편차)]를 사용함으로써, 슬릿 기구의 사용은 신호 대 노이즈의 비율을 증가시킨다는 것이 증명되었다. 큰 분리 지수는 큰 신호 대 노이즈 비율에 대응한다. 하나의 파장에서 신호 대 노이즈의 비율을 증가시키면서 슬릿 개구의 적용은 일반적으로 다른 파장의 신호 대 노이즈 비율을 손상시킨다. 이는 종래의 유세포 분석 광학계에서의 구현이, 동일한 여기 파장을 이용하여 상이한 파장을 방출하는 상이한 형광단을 검출함으로써, 동시에 여러 상이한 파장을 검출에 적합하지 않음을 의미한다. 또한, 고정된 광학계 보다, 광섬유를 이용하는 유세포 분석기 상의 수집 광학계는 고정된 평면에서 광을 수집하고, 따라서 하나의 산란 파장에 대한 슬릿 개구의 사용은 다른 레이저의 산란 파장을 일반적으로 손상시킬 것이다. 여기서 논의된 광 이미지 여과 유닛(an optical image filtration unit, OIFU)의 구현은 레이저마다 상이한 수집 파장으로 조절될 수 있다. 또한, 유동 셀의 반대 편 상에 구현될 수 있고, 따라서 형광 민감도를 유지하면서도 고감도 산람 검출이 가능하다.
OIFU의 사용은 선택적인 산란 파장의 고감도를 제공하지만, 스펙트럼 산란 파장 검출을 이용하는 구성과 비교되는 이의 사용은 디컨볼루션이 적용될 때 제한된다. 오직 선택적인 산란 파장 검출을 사용함에 따라, 일반적으로 이용 가능한 디컨볼루션의 정도가 제한되고, 이는 사용될 수 있는 분자 나노 태그의 수를 감소시키고, 이는 궁극적으로 입자 표현형에서 더 적은 출력을 초래한다.
도 20b에 도시된 것과 같이, 유세포 분석 산란 모델의 개발과 결합된 광학 개구의 구현은 유세포 분석 수집 광학계 설계에서 추가적인 이해를 얻도록 한다. 도 26a-26b에 도시된 것처럼, 이는 수집 각 및 개구 유형은 입자의 산란-직경 관계에 영향을 미칠 수 있다. 이 원형 개구는 10도의 수집 반각을 가지는 기기 상에서 사용되고, 산란-직경 관계 커브 내의 미에 공명(골)은 동일한 수집 반각을 사용하는 정사각형? 수집 개구에 비하여 더 깊다는 것을 볼 수 있다. 따라서, 검출 또는 디컨볼루션을 도울 수 있는 독특한 산란-직경 관계를 생성시키도록 관심 입자의 산란 분포에 개구 특성(예를 들어, 기하학적 구조)를 맞추는 것이 가능하다.
실시예 6 - 스펙트럼 프로파일 비교 및 디컨볼루션
Welsh et al. "Prospective Use of High-Refractive Index Materials for Single Molecule Detection in Flow Cytometry," Sensors 2018, 18, 2461; doi:10.3390/s18082461(본원에 참조로 포함됨)에 설명된 것과 같이, 본원에 기재된 모델링 접근법은 나노 태그(또는 다른 입자) 크기(일반적으로 직경) 및 굴절률에 대한 검출 한계를 결정하도록 다양한 유세포 분석 기기의 민감도를 특성화하도록 사용할 수 있다. 특성화되면, 본원에 기재된 스펙트럼 분석 접근법은 측면 산란 검출 신호를 디컨볼루션하고, 상이한 조성 및/또는 입자에 대한 특징적인 스펙트럼 프로파일과 데이터를 비교함으로써 나노 태그 및 다른 입자의 존재를 결정하기 위하여 사용될 수 있고, 이는 일부 예에서 존재하는 유세포 분석 기기를 장착함으로써 포함된다. 대표적인 예에서, 특징적인 스펙트럼 프로파일은 선택된 스펙트럼 범위에 걸친 파장의 함수로서 강도의 변화에 의하여 정의될 수 있고, 일부 예에서 이러한 비교 및 디컨볼루션은 단일 입자 검출을 제공할 수 있다.
Welsh et al.에 설명된 것처럼, 세포외 소포(EV)는 주로 <150 nm의 직경을 가지는 작은 막 소포(30-1000 nm)이다. 이들의 작은 표면적으로 인하여, 세포와 비교할 때, 대부분의 EV 표면 마커의 에피토프는 유세포 분석과 같은 종래의 고 처리량의 다중 파라미터 검출 기술로 검출 가능한 범위 미만이다.
현재의 유세포 분석기는 수천에서 수백 개의 형광 분자를 구별할 수 있다. CD14와 같은 매우 풍부한 림프구 표면 마커의 표면 발현은 림프구 당 100,000 카피의 영역 내에 있다. 이러한 에피토프 밀도가 100 nm EV로 스케일링 되는 경우, 소포 당 <30 CD14카피와 동일할 것이다. 따라서, EV 분야에서 충족되지 않는 요구는 단일 EV에서 단일 에피토프 검출을 가능하게 하는 라벨의 개발이며, 이상적으로는 현재 이용 가능한 검출 장비 및 유세포 분석기를 활용하는 것이다.
현재의 형광 기반 유세포 분석은 형광 접합된 항체의 형태인 경향이 있는 형광 프로브를 사용하여 단백질의 발현을 정량화한다. 이들은 면역학 분야에서 세포 분석을 위한 강력한 도구인 것으로 입증되었지만, 현재의 형태로는 대부분의 이용 가능한 유세포 분석기에서 EV 표면 단백질 발현을 정량화하기에는 불충분하다. QDots와 같은 차세대 형광 라벨이 등장했지만, 일반적으로 낮은 표면 에피토프 정량화에는 적합하지 않다. 개별 타겟의 시간적으로 제한된 검출을 위한 라벨로서의 QDots의 사용은 또한 "블링킹(blinking)"이라고 일반적으로 불리는 확률적인 광학 변동에 의하여 복잡해진다.
샘플 태의 특정 마커에 대하여 양성인 EV의 수를 열거하는 것이 분석의 목적인 경우, 열거 방법은 하나 이상의 특정 표면 마커 각각을 검출할 수 있어야 한다. 이 경우, 단일 라벨 감도로 단일 라벨을 검출할 수 있는 라벨과 기기를 사용하는 것이 중요하다. 한편, 얼마나 많은 수용체가 개별적인 EV 내에 있는지 정량화 또는 비교하는 것이 목적인 경우, 일정한 라벨 대 타겟 비율이어야 하며, 1가(monovalent)의 타겟 결합 부위가 있는 라벨은 단일 분자 검출 및 EV 상의 수용체 정량화를 위하여 필요하다. 희석 제어, MESF 비드 및/또는 산란 모델링과 같은 EV 열거 시, 다른 표준화 단계도 고려되어야 한다. QDots를 이용하는 대부분의 상업적으로 이용 가능한 기술은 이러한 라벨을 다가(polyvalent) 형태로 사용하지만, 다른 나노 입자의 컨쥬게이션(conjugation)으로 직접 전달될 수 있는 1가 QDot을 생성하도록 시도되는 새로운 방안이 등장하였다.
본원에 기재된 새로운 부류의 나노 스케일 분자 태그(나노 태그)는 단일 라벨, 그러므로 단일 분자의, 유세포 분석기를 사용한 검출을 가능하게 한다. 대표적인 예에서, 나노 태그는 높은 굴절률 및/또는 높은 광 흡수 및 낮은 에피토프 수 열거 및 세포외 소포와 같은 작은 입자의 스펙트럼 표현형 모두를 가능하게 하는 고유한 산란 특성을 가지는 물질로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 나노 태그 조성물은 명백한 광학적 검출을 위하여 선택될 수 있고, 나노 태그 조성물은 동시에 입자 표현형을 가능하게 하고 여전히 서로 구별될 수 있도록 사용될 수 있다. 분석은 나노 입자에 의한 광 산란에 의존한 파장의 수치 모델링 및 유세포 분석 데이터와의 비교에 기초한다.
먼저 증가된 광 산란을 돕는 유용한 광학 특성을 가지는 입자를 식별하기 위하여, 굴절률 및 흡광 계수를 대조하였다. 300 - 800 nm파장에 걸친 입자 굴절률 및 흡광 계수는 금, 은, 산화철, 이산화 티탄, 구리, 백금 및 지르코늄과 같은 조성에 대한 문헌으로부터 수집되었다. 폴리스티렌 및 물의 굴절률은 해당 Sellmeier 방정식을 사용하여 각 파장에서 계산되었다. 조성물 선택은 나노 입자 이용 가능성 및 높은 굴절률(예를 들어, 이산화 티탄) 또는 흡광 계수(예를 들어, 납) 또는 중간 정도의 굴절률 및 흡광 계수를 가지는 것(예를 들어, 금, 은, 구리)에 기초하여 더욱 좁혀졌다.
유세포 분석 측정은 MoFlo Astrios EQ (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) 및FACS Symphony (BD Life Sciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 유세포 분석기에서 수행되었다. Astrios EQ는 405, 488, 561 및 640 nm에서 측면 산란 수집(side scatter collection, SSC)이 가능한 5개의 레이저((355, 405, 488, 561 및 640nm의 파장)을 가지는 제트 인 에어(jet-in-air) 시스템이다. Astrios EQ 설정 및 검출 임계값에 대한 자세한 설명은 문헌에서 찾을 수 있다. FACS Symphony는 기본 장치 구성에서 488 nm에서만 SSC 검출이 가능한 5개의 레이저(355, 405, 488, 532 및 640 nm)를 가지는 세포 분석기이다. SSC를 통한 입자 열거를 위한 장비 파라미터는 200의 트리거 임계값, 350의 전압 및 낮은 유체 속도로 설정되었다. 산란 출력 대 직경의 측정을 위하여, NIST 추적 가능한 폴리스티렌 비드(100, 125, 147, 203, 296, 400, 600, 799, 994 nm 직경, Thermo Fisher Scientific, gift from E. van der Pol, Waltham, MA, USA) 및 실리카 비드((182, 315, 359, 405, 548, 800, 1000 nm, Kisker Biotech, gift from E. van der Pol, Amsterdam, The Netherlands)는 mL 당 0.1-1 x 108 입자의 농도에서 분석되었고 이전에 공개된 유세포 분석 방법을 사용하여 예측된 산란 대 얻어진 산란의 피팅을 확인하였다.
높은 굴절률 입자 획득 모델링 비교를 위하여, 20, 40, 60, 80 and 100 nm 직경의 은 입자(Cytodiagnostics, Burlington, ON, Canada), 20, 40, 60 and 80 nm 직경의 금 입자(Cytodiagnostics) 및 100 nm 폴리스티렌 NIST-추적 가능 비드(Thermo Fisher Scientific) 및 200 nm의 형광 폴리스티렌 비드(Thermo Fisher Scientific)가 각 기기에서 획득하기 전에 mL 당 0.1-1 x 107 입자 사이의 농도로 희석되었다. 도 28a-28f에 도시된 바와 같이, 40, 60, 80 nm의Au 입자의 선형 희석은 단일 입자 검출을 유지하는 작동 세포 획득 농도를 확인하도록 수행되었다. 즉, 40 nm 금 나노 입자의 연속적인 희석은 도 28a-28b에, 60 nm는 도 28c-28d에 및 80 nm는 도 28e-28f에 나타내었다. Au 나노 입자는 1e7 입자 mL-1에서의 200 nm의 형광 폴리스티렌 비드의 스파이크로 1e7, 1e6, 및 1e5 입자 mL-1로 희석되었다. 금 대 200 nm 폴리스티렌의 비율은 금의 농도에 대하여 플로팅하였다. 희석된 Au 대 스파이크 vs. 준비된 Au 농도의 비율의 선형 감소를 얻는 것을 확인할 수 있다. 이는 단일 입자 검출을 나타낸다. 또한, 다양한 희석에서 입자 산란 신호에 뚜렷한 차이가 없으며, 이는 또한 단일 검출을 나타낸다. 입자 농도는 제조사 농도 고형물을 사용하여 결정된다. 스파이크 인(spike-in) 입자 농도는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 결정된다.
FACS Symphony 용 Astrios EQ 및 Diva v8의 수집 소프트웨어 Summit v6을 사용하여 데이터를 수집하였다. 데이터 수집이 완료되면, 수집 소프트웨어에서 파일을 내보내고 수집 후 분석을 위해 FlowJo v10 (TreeStar)으로 불러온다. 유세포 분석 파일은 https://flowrepository.org/id/FR-FCM-ZYL7 및 https://flowrepository.org/id/FR-FCM-ZYL6 에서 찾을 수 있다.
위에서 테스트 한 여러 가지의 상이한 유세포 분석 기기는 는 매우 높은 형광 분자 검출 감도를 갖도록 고안되었다. 그러나 동일 용해성 형광단 분자(Moleculars of Equivalent Soluble Fluorophore, MESF) 검출의 근사값인 MESF 값에 대한 검출 하한 값을 측정한 후, 테스트된 기기 중 가장 민감한 것 조차도 >25 형광 분자를 가지는 물체만을 검출할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 민감도 및 형광 기반의 접근법은 세포외 소포의 성분을 검출하기에는 불충분하며, 이는 소포 당 1 또는 2 개만큼 낮은 수로 존재할 수 있다. 이러한 데이터는 금속과 같은 라벨로부터의 검출되는 측면 산란 광 스펙트럼의 중요성에 대한 추가 지원을 제공한다. 따라서, 본원에서 개시된 기술의 대표적인 예는 형광 및 비형광 산란을 모두 분석할 수 있다.
나노 입자 검출을 위한 스펙트럼 프로파일을 제공하기 위하여, 유세포 분석 및 입자 스펙트럼 산란이 MATLAB v9.3.0 (The MathWorks Inc., Natick, MA, USA)으로 수치적으로 모델링되었다. 고정 직경(20, 40, 60 80, 100 nm)의 구형 입자에 의해 산란되는 광의 누적 출력은 검출기에 도달하여, 미에 이론을 사용하여 계산되었으며, Matzler의 스크립트를 사용하여 수치적으로 구현되었고, 이는 미에 산란 및 흡수에 대한 함수를 설명한다. 계산은 van der Pol et al. 및 Fattaccioli et al.와 유사하게 수행되었다. 이러한 소프트웨어는 http://www.joshuawelsh.co.uk/scatter-diameter-software/(본원에 참조로 포함됨)에서 이용 가능하다. 입자 광 산란 모델링은, 측면 산란 상에 즉, 조명 방향에 수직하게 수집된 광 상에 집광된다. Astrios EQ 유세포 분석기의 측면 산란 수집 광학계는 29°로 추정되는 반각으로 제한되는 반각을 가지는 원형 수집 개구를 갖는다. 입자 현탁 매체는 물의 광학적 성질을 사용하여 모델링되었다. 실험적인 데이터로 모델링된 데이터를 피팅하는 것은 산란된 출력(또는 동일하게, 산란 단면) 대 입자 직경의 커브를 생성하기 위하여, 시뮬레이션 된 산란 단면 및 실험적으로 측정된 출력 레벨 사이를 변환시키도록 단일 스케일 팩터를 사용하는 van der Pol et al.의 방법을 사용하여 수행된다. 유세포 분석 데이터는 예측된 값 대 모델링으로부터 얻어진 값의 선형 회귀를 사용하여 임의의 단위로부터 nm2 의 산란 단면으로 변환되었다.
금 및 은 입자 직경 분포 및 농도는 405nm LM12 모듈 및 EMCCD 카메라(DL-658-OEM-630, Andor, Belfast, UK)가 장착된 NanoSight LM10 기기(Malvern, UK)를 가지는 NTA를 사용하여 측정되었다. 영상 획득은 14 레벨의 카메라를 사용하여, NTA 소프트웨어 v3.2로 수행되었다. 샘플 당 3 개의 30초 비디오가 캡쳐되었다. 획득 후 비디오 분석은 다음의 설정이 사용되었다: 최소 추적 길이(minimum track length) = 5, 검출 임계값(detection threshold) = 4, 자동 블러 크기(automatic blur size) = 2-패스, 최대 점프 크기(maximum jump size) = 12.0.
본원에 기재된 유세포 분석 입자 산란 모델링의 방법을 사용하여, 산란-직경 관계(도 20b에 도시된 것과 같은)는 입자 직경 및 조성이 검출될 수 있는지에 대하여 예측하기 위하여 문헌으로부터의 기준 굴절률 및 흡광 계수와 결합될 수 있다. Astrios EQ 세포 분석기의 측면 산란 수집 광학계는 UV-가시광선 스펙트럼에 걸친 금 및 은 나노 입자의 상대적으로 검출된 산란 출력을 결정하도록 모델링되며, 이는 도 29(또한 도 15a 내지 15d에서도 볼 수 있는)에 도시되어 있다. 다른 조성물(백금, 이산화 티탄, 산화철, 구리, 납, 지르코늄) 또한 도 15a-15d 내의 파장에 대하여 단면(강도 또는 출력과 유사한)의 스펙트럼 프로파일로 도시된 바와 같이 모델링된다. 각 프로파일의 조성 및 크기 사이의 스펙트럼 변화의 차이는 유세포 분석 타겟 내의 나노 태그 및 다른 물질을 식별하도록 디컨볼루션 동안 사용될 수 있다. 일반적으로, 다중 파장에서 검출함에 따른 스펙트럼 검출 성능의 증가는 다중 파장 검출 신호의 디컨볼루션 동안의 입자 식별의 신뢰 수준을 향상시킬 수 있다.
단면 산란 기준으로서 100 nm의 폴리스티렌(PS) 비드를 사용하여, 다양한 유세포 분석 플랫폼 상에서 이들이 검출 가능하기 때문에, 도 29로부터 ~400 nm에서 조명된 20 nm 은 나노 입자가 100 nm PS 입자보다 더 높은 산란 단면을 갖는다는 것을 볼 수 있다. 또한, 40 nm 금 입자는 ~532 nm의 조명 파장에서 100 nm PS 구체의 산란 단면을 능가하며, 40 NM 은 입자는 ~350-450 NM 범위의 조명 파장의 높은 산란 단면을 갖는다. 또한, 카드뮴 셀레나이드, 산화철 및 이산화 티탄을 제외한 모든 조성물의 60 nm 구체는 스펙트럼의 적색 영역(>700 nm) 내로 떨어지기 전에 대부분의 UV-가시광선 스펙트럼에 걸쳐서 100 nm PS 구체보다 더 높은 산란 단면을 갖는다.
도 25에 나타낸 바와 같이, PS, 금 및 은 나노입자는 Astrios EQ 및 FACS Symphony 기기 상에서 입자가 488 nm의 통상적인 산란 수집 파장을 사용하여 측정 가능한지 결정하기 위하여 분석되었다. 염색되지 않은 100 nm PS 비드는 두 기구 상에서 모두 분석 가능하다. 100, 80, 60 및 40 nm 은 입자는 두 기기 상의 배경으로부터 모두 식별 가능하고, 40 NM 모집단은 배경 노이즈로부터 Astrios EQ 및 FACS Symphony 상에서 오직 부분적으로만 분석되었다. 20 nm의 은 또는 금 입자는 어느 기기에서도 분석되지 않는다. 80, 60 및 40 nm 금 입자는 두 기기에서 모두 분석되고, 40 nm 금은 다시 각 기기 상에서 오직 부분적으로만 분석된다.
PS, 금 및 은 입자는 Astrios EQ(도 22c에 도시된)의 다중 파장 모델링을 사용하여 조사되고, 이들은 488 및 561 nm SSC 채널(도 22d에 도시된)로부터 얻어진 데이터외 비교된다. 405, 488, 561, 640 nm에서 모델링된 데이터 및 얻어진 데이터 사이의 비교가 또한 수행된다. 기준으로서 기기 배경 노이즈를 사용하여, 40 nm 은 입자는 561 nm, 488 nm 및 405 nm SSC 채널 상에서 부분적으로 분석되고 640 nm SSC 채널 상에서 분석되지 않는다. 40 nm 금 입자는 561 nm 및 488 nm SSC 채널 상에서 완전히 분석되고, 640 nm SSC 채널 상에서 부분적으로 분석되고, 405 nm SSC 채널 상에서 분석되지 않는다. 100 nm PS 입자는 488 nm 및 561 nm SSC 채널 상에서 완전히 분석되고, 405 nm 채널 상에서 부분적으로 분석되고, 640 nm SSC 채널 상에서 분석되지 않는다. 다른 모든 입자들은 모든 SSC 채널 상의 기기 배경 노이즈로부터 분석 가능하다.
모든 채널 상의 금, 은 및 PS 입자 산란 사이의 관계는 잘 유지되며, 도 22c 및 도 22d 사이의 유사점으로부터 볼 수 있듯이 금 입자는488 nm 및 561 nm SSC 채널 사이의 산란의 선형 증가를 보이고, PS 입자는 선형으로 증가하지만 금보다 더 증가된 488 nm 산란을 나타내고, 은은 60 - 80 nm 사이에서 488 nm 산란 채널 상의 산란이 감소하기 시작하기 전에 488 nm 및 561 nm 산란 채널 사이에서 선형으로 산란하고, 561 nm 산란에서 계속하여 증가하는 것이 나타난다.
유세포 분석에서 한번에 여러 개의 나노 태그의 사용을 구현하기 위하여, 입자는 디컨볼루션을 통한 신호 추출 및 식별을 위한 기초를 제공하는 식별 가능한 스펙트럼 산란 특성에 기초하여 선택된다. 구별되는 스펙트럼 산란 특성을 나타내는 두 물질의 예는 도 30a에 나타낸 바와 같이(도 18b와 유사하게) 60 nm 금 및 은이다. 은 대 금 산란 비율을 플로팅함으로써, 가장 많은 분리가 발생할 수 있는 파장이 결정될 수 있다. 510 nm 내지 800 nm에서 그 역이 발생하기 전에, 350 - 510 nm 파장 사이에서60 nm 은 입자가 60 nm 금 입자보다 더 많이 산란할 것으로 보인다. 이러한 분리는 도 30b에 나타낸 바와 같이(상대적인 출력에 대한 정규화는 없지만) 405, 488, 561 및 640 nm에서 산란을 수집하는 Astrios EQ로부터 획득된 데이터에서 확인된다. 하지만 60 nm 은 입자는 모델링으로부터 예측된 것과 같이, 561 nm 내지 640 nm 파장 상에서 반전되기 전에, 405 nm 내지 488 nm에서 60 nm rrma보다 더 높은 산란 강도를 갖는다는 것을 볼 수 있다. 이는 부착된 나노 태그를 가지는 EV를 포함하는 유세포 분석 타겟에 대한 측면 산란 검출 신호가 부착된 나노 태그를 가지는 EV의 존재를 결정하도록 디컨볼루션될 수 있다.
CFSE 염색된 EV의 산란 특성은 도 31에 나타낸 바와 같이, 60 nm 금 및 60 nm 은 입자의 특성들과 비교하여, 그들의 라벨로서의 사용이 에피토프 염색의 식별을 가능하게 하는 방법을 나타낸다. 만약 CFSE 염색된 EV가 은 나노 태그에 의하여 양성으로 염색된다면, 그들의 488 nm 및 561 nm 채널 강도는 증가할 수 있다. 만약 CFSE 염색된 EV가 금 나노 태그에 의하여 양성으로 염색된다면, 그들의 561 nm 채널 강도는 주로 증가할 수 있다. 금 및 은 나노 태그에서 보이는 특징적인 채널 강도는 서로 식별되며, 이러한 차이는 하나의 분석에서 상이한 두 개의 에피토프를 라벨링 또는 EV 관련된 두 개의 상이한 분자를 검출하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 결과는 도 29 및 도 22d에서 나타냈듯이 금 및 은의 산란 특성에 기초하여 예상된다.
개시된 기술에 따르면, 40, 60 및 80 nm의 직경을 가지고, 은 또는 금으로 이루어진 입자는 Astrios EQ 및 FACS Symphony 유세포 분석기를 사용하여 부분적으로 또는 완전히 분석될 수 있다. 그러나 이러한 세포 분석기는 더 복잡한 고급 장비일 수 있고, 모든 기존의 유세포 분석기가 100 nm 폴리스티렌 구체(참조 기준으로서 사용되는)를 검출할 수 있는 것은 아니다. 다중 산란 검출 파장에서 40 nm 입자를 검출하는 능력은 본원의 기기에 도시된 반면, 입자 검출의 개선(더 작은 크기, 단일 개별 입자, 다중 입자 유형)이 얻어질 수 있고, 동시에 다중의(>3) 스펙트럼 산란 라벨의 검출 및 분석을 포함할 수 있다. 이러한 개선을 얻기 위하여, 본원에 개시된 기기의 예는 초연속 백색 레이저와 같은 넓은 범위의 조명 파장을 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다중 산란 검출 채널을 사용할 수도 있다. 그러나 오직 하나 또는 두 라벨의 사용만이 산란 수집 필터를 가지는 존재하는 유세포 분석 구성을 사용하여 실현 가능할 수 있다.
제한된 표면적 및 이에 따른 EV 상의 표면 단백질로 인하여, 입체 장해(steric hindrance)는 지경이 약 15 nm인 현재의 면역 그로불린 라벨에 대하여 문제가 될 수 있다. 이것은 이슈가 되는 반면, 특히 현재 기기 상 검출 불가능한 몇 개의 형광단으로 라벨링된 면역 글로불린에 대하여, 나노 태그가 검출 가능하도록 오직 하나의 나노 태그가 EV 표면 에피토프와 결합하는 것이 필요하다. 100 nm EV는 ~ 20개의 느슨하게 패킹된 15 nm 구형 입자에 결합하는 능력을 가질 수 있다. EV에 대한 나노 태그의 농도는 그러므로 더 낮으며, EV 표면을 포화시키지 않고, 이에 따라 상이한 단백질을 표적으로 하는 다수의 나노 태그가 결합될 수 있게 한다. 라벨로서의 나노 입자의 사용을 고려할 때의 다른 중요한 요인은 그들의 컨쥬게이션이다. Qdots와 같은 나노 입자의 많은 존재는 다가 라벨을 초래한다. 단일 나노 태그의 EV로의 결합을 보정하기 위하여, 1가 라벨의 개발이 유용할 것이다. Qdots의 1가 라벨링은 나노 입자 주위에 DNA를 감싸서 이전에 입증되었다. 이러한 방법은 항체, 앱타머(aptamer) 등에 결합하도록 사용되는 단일의 기능화된 말단기를 남긴다.
본원의 예에 따르면, 단일 나노 태그가 EV와 같은 타겟된 입자에 결합되지 않고 검출될 수 있음에 따라, 라벨링되지 않은 EV로부터 라벨링된 구별 방법이 유용할 것이다. 일부 예에서, 모든 EV는 삽입성 막 염료 또는 CFSE와 같은 비특이적 염색으로 형광 라벨링된다. 나노 태그 형광의 이동은 EV를 라벨링했는지 여부를 결정하기 위하여, 라벨링된 EV에 결합할 때 식별될 수 있다. 다른 예에서, EV의 특정 유형이 예를 들어, 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 양성에 관심이 있는 경우, 관심 있는 집단에 대한 나노 태그를 특이적으로 만들고, 예를 들어, CD9 양성과 같은 EV 서브세트에서 타겟된 제2 나노 태그를 사용하는 것이 가능할 수 있다. 고유한 산란 분포는 그 후 두 개의 나노 태그를 가지는 EV에 대하여 발생할 수 있고, 각각 구별되는 산란 특성을 가지며, 그들에 결합한다.
따라서, 대표적인 예에서, 단일 40, 60, 80 nm 금 및 은 입자는 존재하는 유세포 분석 기기를 사용하여 검출 가능할 뿐만 아니라, 스펙트럼 산란 특성을 이용함으로써, 고유하게 서로 및 형광 라벨링된 EV로부터 구별 가능하다. 일부 예에서, 직경 및 조성과 같은 입자는, 단일 에피토프 검출을 위한 수단 및 단일 에피토프 검출 태그로서 구현으로서 현재 이용 가능한 라벨링 방법을 사용하여, 다가 또는 심지어 1가 검출 라벨로 사용될 수 있다. 라벨로서 분자 나노 태그를 사용는 것은 고 굴절률 또는 고 플라즈몬 나노 물질의 광 산란 특성을 활용함으로써, 현재 이용 가능한 유동 방법론을 사용하여 단일 분자의 검출을 위한 충분히 높은 신호를 제공하므로, EV와 같은 낮은 발현, 낮은 산란 타겟에 대한 라벨에 유용할 수 있다.
따라서, 개시된 예에 따라, 분자 나노 태그는 이용 가능한 검출 방법에서 존재하는 갭을 채울 수 있다. 예를 들어, 임상 실험실이 혈액 샘플을 채취하여 혈액의 단위 부피 당 특정 종양 마커에 대해 몇 개의 EV가 양성인지 확인할 수 있는 방법은 현재 없다. 오히려, 현재 방법은 오직 수 마이크론 사이즈의 비드에 대해 EV를 결합시킬 수 있을 뿐이고, 검출 항체를 큰 비드에 결합된 EV를 검출하도록 사용할 수 있다. 개별 분자 나노 태그는 개별적으로 분석될 수 있는 라벨이기 때문에, 하나의 분자 나노 태그 라벨링된 수용체만으로 EV의 검출이 가능하다. 또한, 라벨이 1가가 되도록 하는 방법으로 분자 나노 태그의 어셈블리는 라벨링된 분자의 수를 열거하도록 할 수 있다. 이러한 분자 열거는 현재의 유세포 분석 라벨 및 기기의 열거 능력을 넘어서는 상당한 발전이다.
도시된 실시예를 참조하여 개시된 기술의 원리를 설명하고 도시하였지만, 도시된 실시예는 그러한 원리를 벗어나지 않고 배열 및 세부사항에 있어서 수정 될 수 있음을 인식 할 것이다. 예를 들어, 소프트웨어로 도시된 실시예의 요소는 하드웨어로 구현될 수 있으며 그 역도 마찬가지이다. 또한, 임의의 예의 기술은 임의의 하나 이상의 다른 예에 기술된 기술과 조합 될 수 있다. 도시된 예를 참조하여 설명된 것과 같은 절차 및 기능은 단일 하드웨어 또는 소프트웨어 모듈로 구현될 수 있거나 별도의 모듈이 제공 될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구성은 설명을 용이하게 하기 위해 제공되며, 다른 구성이 사용될 수 있다.
개시된 기술의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예를 고려하여, 예시된 실시예는 단지 대표적인 예이며 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 인식해야 한다. 이들 섹션에서 구체적으로 언급된 대안은 단지 예시적인 것이며 본 명세서에 기술된 실시예에 대한 모든 가능한 대안을 구성하지는 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 시스템의 다양한 구성 요소는 기능 및 사용에 결합될 수 있다. 따라서 우리는 첨부된 청구 범위의 범위에 속하는 모든 것을 청구한다.
Claims (51)
- 다중 파장 조명 빔을 생성하고 나노 태그를 포함할 수 있는 미세 유체 타겟으로 지향시키도록 형성된 조명원;
미세 유체 타겟으로부터 다중 파장 검출 빔을 수신하고 검출 신호를 생성하도록 형성되며, 여기서 상기 다중 파장 검출 빔은 다중 파장 조명 빔 및 미세 유체 타겟 내의 나노 태그 사이의 상호작용에 의하여 탄성적으로 측면 산란되는 광을 포함하는, 검출기;
검출 신호를 수신하고, 검출 신호의 다중 파장 측면 산란 강도 특성을 하나 이상의 나노 태그 유형의 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일과 비교함으로써 미세 유체 타겟 내의 나노 태그의 존재를 결정하도록 형성된 프로세서;
를 포함하는 장치.
- 제1항에 있어서,
상기 미세 유체 타겟 내의 나노 태그의 존재를 결정하는 것은 단일 나노 태그의 존재를 결정하는 것을 포함하는 장치.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로세서는 상기 비교에 기초하여, 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)에 부착된 적어도 하나의 나노 태그를 가지는 세포외 소포의 존재를 결정하도록 형성되는 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로세서는 미세 유체 타겟 내에 동시에 존재하는 복수의 나노 태그 유형의 존재를 상기 검출 신호로부터 결정하도록 형성되는 장치.
- 제4항에 있어서,
상기 복수의 나노 태그 유형은 공통의 세포외 소포(EV)에 부착되어 있는 장치.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비교는 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일을 사용하는 검출 신호의 디컨볼루션(deconvolution)을 통하여 수행되는 장치.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 나노 입자는 구형 또는 비구형의 특성을 가지고 100 nm 이하의 구형 특성과 관련된 직경 또는 비구형 특성과 관련된 특성 치수를 가지는 장치.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 탄성 측면 산란 강도 프로파일은 피크 산란에 대응하는 장치.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 나노 태그 유형은 금으로 이루어진 하나 이상의 나노 태그 및 은으로 이루어진 하나 이상의 나노 태그를 포함하는 장치.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 나노 태그 유형은 10 nm 내지 30 nm의 범위에서 선택되는 직경을 포함하는 유형의 나노 태그를 포함하는 장치.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조명원은
소정의 파장 스펙트럼을 가지는 광대역 조명 빔을 생성하도록 배치된 광대역 조명원;을 포함하고,
여기서 상기 장치는 상기 광대역 조명 빔과 광학적으로 결합하고, 소정의 파장 스펙트럼의 별개의 파장 서브 밴드를 각각 가지는 복수의 서브 빔 내로 광대역 조명을 분리시키고, 각각의 파장 서브 밴드의 크로매틱 포커싱(chromatic focusing) 거리에 기초한 미세 유체 타겟에서의 서브 빔을 집광하기 위하여 상이한 각각의 광 경로를 따라 서브 빔을 지향 및 집광시키도록 배치된 파장 분리 시스템을 포함하는 장치.
- 제11항에 있어서,
상기 광대역 조명원은 초연속 레이저를 포함하는 장치.
- 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파장 분리 시스템은 미세 유체 타겟에 동일 선상의 또는 평행한 광 경로를 따라 별도의 서브 빔을 지향시키도록 배치된 복수의 이색성 광학 소자를 포함하는 장치.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 파장 분리 시스템은 상기 미세 유체 타겟의 공통 위치에 서브 빔을 집광시키기 위하여 각각의 서브 빔에 광학적으로 결합된 복수의 포커싱 시스템을 포함하는 장치.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검출 시스템은
다중 파장 검출 빔을 형성하기 위하여 미세 유체 타겟에 의해 탄성적으로 측면 산란된 광을 수신하도록 배치되는 수집 광학계; 및
상기 수집 광학계로부터 상기 다중 파장 검출 빔을 수신하고, 파장에 기초하여 공간적으로 분리된 복수의 검출 서브 빔 내로 상기 다중 파장 검출 빔을 분리하도록 배치되는 프리즘 광학계;
를 포함하는 장치.
- 제15항에 있어서,
상기 검출 시스템은
각각의 검출 서브 빔을 수신 및 집광하도록 배치되는 분리된 마이크로 렌즈를 갖는 마이크로 렌즈 어레이를 더 포함하고, 여기서 상기 검출기는 각각의 검출 서브 빔을 수신하도록 배치된 복수의 검출기 채널을 포함하는 장치.
- 제16항에 있어서,
상기 검출기는 하나 이상의 애벌란시 광 다이오드(avalanche photodiode), 단일 광자 검출 애벌란시 광 다이오드(single-photon detecting avalanche photodiode), 광전자증배관(photo-multiplier tube), 실리콘 광전자증배기(silicon photomultiplier), 또는 3D 고해상도, 고감도, 고 프레임 레이트(frame rate) 광 필드 컬러 기록 소자 또는 이들의 조합을 포함하는 장치.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조명원은
상기 다중 파장 조명 빔에 대응하도록 상이한 파장에서 각각의 레이저 빔을 생성하도록 배치되는 복수의 단색 레이저 소스를 포함하는 장치.
- 제18항에 있어서,
상기 조명원은 레이저 빔의 파장의 크로매틱 포커싱 특성에 기초하여 미세 유차 타겟에 각각의 레이저 빔을 각각 집광시키도록 배치되는 빔 포커싱 광학계를 더 포함하는 장치.
- 제19항에 있어서,
상기 조명원은 레이저 빔이 미세 유체 타겟에서 공통 위치에 집광되도록 동일 선상의 광 경로를 따라 레이저 빔을 지향시키도록 배치되는 복수의 이색성 광학 소자를 더 포함하는 장치
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검출기는 다중 파장 검출 빔을 형성하도록 미세 유체 타겟에 의하여 탄성적으로 측면 산란되는 상이한 파장에서 광을 수신하도록 배치되는 수집 광학계를 포함하는 검출 시스템의 일부인 장치.
- 제21항에 있어서,
상기 수집 광학계는 미세 유체 타겟에 의하여 수신되는 다중 파장 조명 빔의 광 경로에 대하여 수직으로 배열되는 제1 수집 광학계 및 상기 제1 수집 광학계에 인접한 광 경로에 대하여 수직으로 배열되는 제2 수집 광학계를 포함하는 장치.
- 제22항에 있어서,
상기 제2 수집 광학계는 상기 제1 수집 광학계로부터 상기 미세 유체 타겟의 반대측에 있는 장치.
- 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 수집 광학계는 주어진 파장에서 소정의 양만큼 미에 공명(Mie resonance)을 이동시키는 제1 수집 광학계와는 상이한 수집 광학계 파라미터로 구성된 장치.
- 제24항에 있어서,
상기 수집 광학계 파라미터는 수집 광학계 각도 및 검출 개구 기하학적 구조(detection aperture geometry) 중 하나 이상을 포함하는 장치.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검출기는 상기 제1 수집 광학계에 결합되는 제1 검출기 및 상기 제2 수집 광학계에 결합된 제2 검출기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 검출기의 민감도는 상이한 크기의 입자를 감지하기 위한 동적 범위를 증가시키도록 상이하게 선택되는 장치.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검출 시스템은
상기 다중 파장 검출 빔을 수렴적으로 수신하고 상이한 파장 중 하나에 각각 대응하는 복수의 검출 서브 빔 내로 상기 다중 파장 검출 빔을 분리하도록 형성되는 적어도 하나의 이색성 광학 소자 더 포함하고,
여기서 상기 검출기는 적어도 하나의 이색 소자로부터 각각의 검출 서브 빔을 수신하도록 배치되고, 수집 광학계에 의하여 제공되는 포커싱 거리 및 수집 광학계의 색수차(chromatic aberration) 프로파일과 관련된 검출 서브 빔 사이 초점의 광 경로 차이를 기초로 하는 적어도 하나의 이색 소자에 대하여 이격된 관계로 배치되는 복수의 광학 검출기를 포함하는 장치.
- 제27항에 있어서,
상기 적어도 하나의 이색성 광학 소자는 제1 이색성 광학 소자 및 제2 이색성 광학 소자를 포함하고, 여기서 제1 이색성 광학 소자는 각각의 광학 검출기로 상이한 파장 중 제1 파장을 가지는 제1 검출 서브 빔을 지향시키도록 배치되고, 상기 제2 이색성 광학 소자는 각각의 광학 검출기로 제1 파장보다 긴 제2 파장을 가지는 제2 검출 서브 빔을 지향시키도록 배치되는 장치.
- 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 이색성 광학 소자를 가지는 검출 서브 빔의 생성 순서는 상기 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 기초하는 장치.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수집 광학계는 하나 이상의 아크로매틱(achromatic) 및 아포크로매틱(apochromatic) 렌즈를 포함하는 장치.
- 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 수집 광학계는 제1 파장을 가지는 다중 파장 검출 빔의 제1 검출 서브 빔을 검출하도록 배치되고, 상기 제2 수집 광학계는 제2 파장을 가지는 다중 파장 검출 빔 중 제2 검출 서브 빔을 검출하도록 배치되는 장치.
- 제31항에 있어서,
제2 수집 광학계로의 제2 검출 서브 빔의 검출은 제1 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일 또는 제1 수집 광학계 및 제1 검출 서브 빔을 수신하도록 배치되는 광학 검출기 사이의 공간적인 관계에 관련된 제1 수집 광학계에 의한 제1 검출 서브 빔 및 제2 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 공통성 및 포커싱 거리 차이 중 하나 이상을 기초로 하여 제1 수집 광학계로 제1 검출 서브 빔의 검출로부터 공간적으로 분리되는 장치.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검출 시스템은
상이한 파장 중 하나를 가지는 다중 파장 검출 빔의 검출 서브 빔 각각을 수신하도록 배치되는 개구를 각각 포함하는 각각 인접한 제1 단부를 가지고, 상기 개구는 상기 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 관련된 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 변화에 기초하여 서브 빔의 공통 전파 방향을 따라 서로에 대하여 이격된 관계를 가지는, 복수의 광섬유; 및
제1 단부에 대향하는 광섬유의 제2 단부에 대하여 광학적으로 결합하는 복수의 광학 검출기;
를 포함하는 광섬유 어셈블리를 더 포함하는 장치.
- 제33항에 있어서,
상기 개구는 각각의 검출 서브 빔의 이미지 스팟에 맞추어 정렬되는 장치.
- 제33항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
전파 방향에 따라 대응하는 개구를 병진시키도록 제1 광섬유의 적어도 하나의 제1 단부에 결합된 병진 스테이지를 더 포함하는 장치.
- 제35항에 있어서,
상기 개구는 슬릿 개구이고, 각각의 슬릿 개구는 슬릿 폭보다 더 긴 슬릿 길이를 가지고 슬릿 길이는 미세 유체 타겟의 유동 방향에 평행하게 연장되는 장치.
- 제36항에 있어서,
상기 병진 스테이지는 전파 방향 및 유동 방향에 수직인 측면 방향을 따라 슬릿 개구를 병진시키도록 배치되는 장치.
- 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
광섬유의 각각의 제1 단부는 각각의 개구를 포함하고 제1 단부를 형성하기 위하여 광섬유에 광학적으로 결합 또는 융합되는 광학 블록을 포함하는 장치.
- 제38항에 있어서,
상기 개구에 인접한 광학 블록의 영역은 광섬유의 제1 단부에 근접한 미광(stray light)을 감소시키도록 선택되는 흡수율을 갖는 장치.
- 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 개구는 형성화된 광섬유 코어 또는 크래딩 기하학적 구조 및 단면 상에 위치된 반사성 코팅 변형 중 하나 이상을 기초로 하는 각각의 단면에 의해 정의되는 장치.
- 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 개구는 미에 공명에 관하여 선택된 기하학적 구조를 갖는 장치.
- 제 41항에 있어서,
상기 기하학적 구조는 비원형 및 비장방형인 장치.
- 미세 유체 타겟에 조명원으로 생성된 다중 파장 조명 빔을 지향하는 단계;
상기 미세 유체 타겟과 상기 다중 파장 조명 빔을 탄성적으로 측면 산란시키는 단계;
검출 신호를 생성하도록 탄성적으로 측면 산란되는 다중 파장 조명 빔으로 형성되는 다중 파장 검출 빔의 복수의 검출 서브 빔을 검출기로 검출하는 단계; 및
검출 신호 및 상이한 나노 태그 유형에 따른 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일에 기초하여 다중 파장 검출 빔에 대응하는 상이한 나노 태크의 존재를 결정하는 단계;
를 포함하는 방법.
- 제43항에 있어서,
상기 결정하는 단계는 소정의 다중 파장 탄성 측면 산란 강도 프로파일을 사용하는 검출 신호의 디컨볼루션을 통하여 수행되는 방법.
- 제43항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다중 파장 조명 빔을 지향하는 단계는
각각 상이한 파장 서브 밴드를 가지는 복수의 조명 서브 빔 내로 다중 파장 조명 빔을 분리시키는 단계; 및
조명 서브 빔이 상이한 파장 서브 밴드의 크로매틱 포커싱 거리 변화에 기초하여 미세 유체 타겟에 집광되도록 각각의 광 경로를 따라 미세 유체 타겟에 조명 서브 빔을 지향시키는 단계;
를 포함하는 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는
검출 서브 빔 내로 프리즘 배열을 갖는 다중 파장 검출 빔을 분리시키는 단계;
검출 서브 빔을 각각 집광하도록 배치되는 각각의 마이크로 렌즈를 가지는 마이크로 어레이로 검출 서브 빔을 수신하는 단계; 및
광학 검출기의 각각의 검출기 채널로 집광된 검출 서브 빔을 수신하는 단계;
를 포함하는 방법.
- 제43항 내지 제46항에 있어서,
상기 조명원은 상이한 각각의 파장을 가지는 레이저 빔을 방출하도록 배치된 복수의 단색 레이저를 포함하는 방법.
- 제47항에 있어서,
상기 다중 파장 조명 빔을 지향시키는 단계는 레이저 빔이 미세 유체 타겟에서의 공통 위치에 집광되도록 동일 선상의 광 경로로 레이저 빔을 지향시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제47항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는
상이한 파장 중 하나에 각각 대응하고, 검출 서브 빔 내로 다중 파장 검출 빔을 분리시키도록 적어도 하나의 이색성 광학 소자로 수집 광학계로부터 다중 파장 검출 빔을 수렴적으로 수신하는 단계; 및
수집 광학계에 의하여 제공되는 포커싱 거리 및 수집 광학계의 색수차 프로파일에 관련된 검출 서브 빔 사이 초점의 광 경로 차이에 기초하는 하나 이상의 이색성 광학 소자로 이격된 관계로 배치되는 각각의 검출기로 검출 서브 빔을 수신하는 단계;
를 포함하는 방법.
- 제49항에 있어서,
상기 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는
수집 광학계의 제1 세트로 다중 파장 검출 빔의 제1 부분을 수신하는 단계;
제1 파장을 가지는 제1 부분의 검출 서브 빔을 검출하는 단계;
제1 수집 광학계로부터 미세 유체 타겟에 대향하도록 배치되는 수집 광학계의 제2 세트로 다중 파장 검출 빔의 제2 부분을 수신하는 단계; 및
제1 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 관련된 수집 광학계의 제1 세트에 의하여 제1 파장을 가지는 검출 서브 빔 및 제2 파장을 가지는 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 공통성 및 포커싱 거리 차이 중 하나 이상을 기초로 제2 파장을 가지는 제2 부분의 검출 서브 빔을 개별적으로 검출하는 단계;
를 포함하는 방법.
- 제47항 내지 제50항에 있어서,
상기 복수의 검출 서브 빔을 검출하는 단계는
인접한 광섬유의 제1 단부에서 각각의 개구로 상기 검출 서브 빔을 수집 광학계에 의하여 지향하는 단계를 포함하고, 여기서 슬릿 개구는 수집 광학계의 크로매틱 델타 포커스 프로파일에 관련된 검출 서브 빔 사이의 포커싱 거리 변화에 기초하여 서브 빔의 공통 전파 방향을 따라 서로에 대하여 이격되는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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