CN103364353B - 一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法 - Google Patents
一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103364353B CN103364353B CN201310304551.2A CN201310304551A CN103364353B CN 103364353 B CN103364353 B CN 103364353B CN 201310304551 A CN201310304551 A CN 201310304551A CN 103364353 B CN103364353 B CN 103364353B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lysozyme
- sample
- rayleigh scattering
- solution system
- resonance rayleigh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法,包括如下步骤:(1)制备溶菌酶纳米金适配体探针;(2)制备溶菌酶标准溶液体系;(3)制备空白对照溶液体系:用步骤(2)的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液;(4)分别以溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系测定共振瑞利散射峰强度值I与I0,计算ΔI=I-I0;(5)以ΔI对溶菌酶的浓度关系做工作曲线;(6)被测物样品测定,算出被测物的ΔI样=I样-I0;(7)根据样品测得的ΔI样,查步骤(5)的工作曲线,计算出被测物中溶菌酶的浓度。本测定方法的仪器简单,操作快速,灵敏度高、选择性好。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学,具体是测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法。
背景技术
溶菌酶又称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,它是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白,是由英国细菌学家弗莱明于1922年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质。溶菌酶存在于蛋清、哺乳动物的泪液、唾液、尿液、乳汁等体液以及微生物中,其中以蛋清含量最为丰富。溶菌酶能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性,具有良好的杀菌抑菌作用。由于无毒安全,溶菌酶作为一种生物防腐剂被广泛的应用于食品工业中。因此,研究简单,快速,灵敏测定溶菌酶的方法具有重要的意义。目前,溶菌酶的检测方法主要有光度法、电化学法、表面等离子体共振法、化学发光法、荧光法等。这些方法各有其优缺点,但有的方法操作复杂,有的灵敏度欠佳,有的选择性欠佳,使得这些方法的使用受到了一定的限制。
核酸适配体是通过指数级富集的配体系统进化技术体外筛选得到的寡核苷酸序列,由于适配体具有制备简单、便于修饰、稳定性好等优点,且能特异性地识别金属离子、蛋白质、小分子等各种靶分子,已成为分析化学领域的重要发展方向。共振瑞利散射光谱法是一种灵敏、快速、简便的光谱分析技术,在生物化学、分析化学、纳米材料研究等方面均有应用。它与适配体标记纳米金反应结合已建立适配体共振瑞利散射分析方法,用于检测痕量金属离子和腺苷等有机小分子。据我们所知,尚未见溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法报道。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足,而提供一种简单快速测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法。
应用适配体纳米金共振瑞利散射光谱法测定溶菌酶,包括如下步骤:
(1)制备溶菌酶纳米金适配体探针:取序列为5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′的溶菌酶适配体,用二次蒸馏水溶解至浓度为1 μmol/L。于试管中,加入2.0 mL 47.8 μg/mL纳米金溶液,0.8 mL 1 μmol/L 溶菌酶适配体,混合均匀,室温下静置10min,即获得0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针,于4℃保存。
(2)制备溶菌酶标准溶液体系:取刻度试管,依次移取100~400 μL 0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针,20~80μL 0.05 mol/L pH 7.2~9.1 Tris-HCl缓冲溶液,5~60μL 0.174 μmol/L溶菌酶标准溶液,用二次蒸馏水定容至1.0mL,再加入20~90μL 2.0 mol/L NaCl溶液,用二次蒸馏水定容至2.0mL。混匀;
(3)制备空白对照溶液体系:用步骤(2)的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液;
(4)分别取按步骤(2)、(3)制备的溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系适量,置于比色皿中,在荧光分光光度计上,同步扫描激发波长和发射波长,获得体系的共振瑞利散射光谱,测定体系最大波长368 nm处溶菌酶标准溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I,以及测定空白对照溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I 0,计算ΔI = I-I 0;
(5)以ΔI对溶菌酶的浓度关系做工作曲线;
(6)被测物样品测定:取含有溶菌酶的被测物,然后移取一定量替换溶菌酶标准溶液,按步骤(2)~(4)操作。算出被测物的ΔI 样=I 样-I 0;
(7)根据样品测得的ΔI 样,查步骤(5)的工作曲线,计算出被测物中溶菌酶的浓度。
实现本发明的原理是:适配体和纳米金通过电荷引力、范德华力及分子间作用力相互结合形成适配体-纳米金探针复合物,它在高盐浓度下稳定而不聚集。在Tris-HCl 缓冲溶液中,当加入溶菌酶时,适配体与溶菌酶发生特异性结合,形成稳定的适配体-溶菌酶复合物,释放出的纳米金在NaCl作用下形成粒径较大的聚集体,导致共振瑞利散射光强度增强。随着溶菌酶浓度增大,释放出来的纳米金越多,纳米金聚集体越大,共振瑞利散射光强度增强。据此建立了一个简便快速测定溶菌酶的共振瑞利散射光谱法。
本发明的优点是:
与已有的方法相比,本测定方法操作简便,灵敏度高、选择性好。
附图说明
图1为本发明实施例测定溶菌酶的部分共振瑞利散射光谱图。
图中:a: 39.2 nmol/L 适配体-纳米金探针-pH 8.05 Tris-HCl缓冲液-40 mmol/L NaCl; b: a+1.7 nmol/L溶菌酶;c: a+5.2 nmol/L 溶菌酶。
具体实施方式
实施例
应用适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法测定溶菌,包括如下步骤:
(1)制备溶菌酶纳米金适配体探针:取序列为5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′的溶菌酶适配体,用二次蒸馏水溶解至浓度为1 μmol/L。于试管中,加入2.0mL 47.8 μg/mL纳米金溶液,0.8mL 1 μmol/L 溶菌酶适配体,混合均匀,室温下静置10min,即获得0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针,于4℃保存。
(2)制备溶菌酶标准溶液体系:取5支刻度试管,依次移取280 μL 0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针,50μL 0.05 mol/L pH 8.05 Tris-HCl缓冲溶液,0.174 μmol/L溶菌酶标准溶液5μL、20μL、40μL、50μL、60μL,用二次蒸馏水定容至1.0mL,再加入40μL 2.0 mol/L NaCl溶液,用二次蒸馏水定容至2.0mL。混匀;
(3)制备空白对照溶液体系:用步骤(2)的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液;
(4)分别取按步骤(2)、(3)制备的溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系适量,置于比色皿中,在F-7000型日立荧光分光光度计上,设定仪器检测器电压为450伏,激发波长狭缝及发射波长狭缝均为5nm,同步扫描从200nm~800nm的激发波长和发射波长,获得体系的共振瑞利散射光谱,测定体系最大波长368 nm处溶菌酶标准溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I,以及测定空白对照溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I 0,计算ΔI = I-I 0;
(5)以ΔI对溶菌酶的浓度C (nmol/L)关系做工作曲线;回归方程为ΔI = 446 C + 49.8;
(6)被测物样品测定:取鸡蛋清搅拌均匀后,移取500 μL蛋清于试管中,加入49.5 mL二次蒸馏水,于超声波仪上超声30min使蛋清充分溶于水中,用滤纸过滤,取滤液适量用二次蒸馏水稀释48倍;然后移取100μL替换溶菌酶标准溶液,按步骤(2)~(4)操作。算出被测物的ΔI 样=I 样 - I 0;
(7)根据样品测得的ΔI 样,查步骤(5)的工作曲线,计算出被测物中溶菌酶的含量分别为6.5 mg/mL、4.7 mg/mL、5.9 mg/mL。
本发明实施例测定溶菌酶线性范围为0.4~5.2 nmol/L,回归方程为ΔI= 446C+49.8,检出限为0.05 nmol/L。
本发明检测方法的验证:
取上述步骤(6)制备的被测样品溶液适量,按参考文献Yan Li, Honglan Qi, Qiang Gao, Chengxiao Zhang. Label-free and sensitive electrogenerated chemiluminescence aptasensor for the determination of lysozyme. Biosensors and Bioelectronics. 2011, 26: 2733-2736. 的方法测定溶菌酶的含量,结果分别为6.3 mg/mL、4.5 mg/mL、5.6 mg/mL。
说明该方法准确可靠。
5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′
Claims (1)
1.一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法,包括如下步骤:
(1)制备溶菌酶纳米金适配体探针:取序列为5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′的溶菌酶适配体,先用二次蒸馏水溶解至浓度为1 μmol/L,再加入2.0 mL 47.8 μg/mL纳米金溶液,0.8 mL 1 μmol/L 溶菌酶适配体,混合均匀,室温下静置10min,即获得0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针,于4℃保存;
(2)制备溶菌酶标准溶液体系:取刻度试管,依次移取280μL 0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针,50μL 0.05 mol/L pH 8.05 Tris-HCl缓冲溶液,5~60μL 0.174 μmol/L溶菌酶标准溶液,用二次蒸馏水定容至1.0mL,再加入20~90μL 2.0 mol/L NaCl溶液,用二次蒸馏水定容至2.0mL;混匀;
(3)制备空白对照溶液体系:用步骤(2)的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液;
(4)分别取按步骤(2)、(3)制备的溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系适量,置于比色皿中,在荧光分光光度计上,同步扫描激发波长和发射波长,获得体系的共振瑞利散射光谱,测定体系最大波长368 nm处溶菌酶标准溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I,以及测定空白对照溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I 0,计算ΔI = I-I 0;
(5)以ΔI对溶菌酶的浓度关系做工作曲线;
(6)被测物样品测定:取含有溶菌酶的被测物,然后移取一定量替换溶菌酶标准溶液,按步骤(2)~(4)操作;算出被测物的ΔI 样=I 样-I 0;
(7)根据样品测得的ΔI 样,查步骤(5)的工作曲线,计算出被测物中溶菌酶的浓度。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310304551.2A CN103364353B (zh) | 2013-07-19 | 2013-07-19 | 一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310304551.2A CN103364353B (zh) | 2013-07-19 | 2013-07-19 | 一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103364353A CN103364353A (zh) | 2013-10-23 |
CN103364353B true CN103364353B (zh) | 2015-08-05 |
Family
ID=49366191
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310304551.2A Expired - Fee Related CN103364353B (zh) | 2013-07-19 | 2013-07-19 | 一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103364353B (zh) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103940872B (zh) * | 2014-04-30 | 2016-02-03 | 青岛大学 | 同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用 |
CN104531845A (zh) * | 2014-12-10 | 2015-04-22 | 临沂大学 | 一种检测溶菌酶的试剂盒 |
CN105274195B (zh) * | 2014-12-11 | 2018-06-26 | 临沂大学 | 一种检测癌症标志物微小核糖核酸的试剂盒 |
CN104597258A (zh) * | 2015-01-09 | 2015-05-06 | 上海交通大学 | 基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法 |
CN104914081A (zh) * | 2015-05-18 | 2015-09-16 | 百色学院 | 氯金酸共振散射光谱法测定食用油中没食子酸丙酯的方法 |
CN104849243A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-08-19 | 广西师范学院 | 一种以碳点为探针运用共振光散射法检测血红蛋白的方法 |
CN105403539A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-03-16 | 广西师范学院 | 以荧光碳点为探针运用倍频散射法检测血红蛋白的方法 |
CN105424658A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-03-23 | 广西师范学院 | 以荧光碳点为探针运用倍频散射法检测胰蛋白酶的方法 |
CN110234600B (zh) | 2016-10-21 | 2023-03-21 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 分子纳米标签 |
EP3701246B1 (en) * | 2017-10-23 | 2021-02-24 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Optical configuration methods for spectral scatter flow cytometry |
CN109975260B (zh) * | 2019-04-10 | 2021-12-24 | 山东大学 | 一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102998288A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-03-27 | 广西师范大学 | 测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3507521B2 (ja) * | 1993-02-18 | 2004-03-15 | 株式会社サンギ | 関節リュウマチ剤 |
-
2013
- 2013-07-19 CN CN201310304551.2A patent/CN103364353B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102998288A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-03-27 | 广西师范大学 | 测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Determination of lysozyme at the nanogram level in food sample using Resonance Rayleigh-scattering method with Au nanoparticles as probe;Zhaoxia Cai等;《Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy>;20111231;1266-1271 * |
张红鸽等.以适体和金纳米颗粒为探针比色法检测溶菌酶.《西北大学学报(自然科学版)》.2011,第41卷(第4期),617-622. * |
赵瑞芳等.基于金纳米和适配体的表面等离子体共振散射技术检测溶菌酶.《山西大同大学学报(自然科学版)》.2013,第29卷(第2期),34-36. * |
金纳米探针瑞利共振散射法测定溶菌酶;陈启凡等;《激光生物学报》;20081031;第17卷(第5期);679-683 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103364353A (zh) | 2013-10-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103364353B (zh) | 一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法 | |
CN106525940B (zh) | 基于g-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标dna浓度的电化学方法 | |
US9983191B2 (en) | Nanopore detection of small molecules through competition assays | |
US10837954B2 (en) | Nanopore detection of small molecules through competition assays | |
CN102998288A (zh) | 测定水中As (III)的适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法 | |
Hu et al. | Double-strand DNA-templated synthesis of copper nanoclusters as novel fluorescence probe for label-free detection of biothiols | |
CY1115380T1 (el) | Μεθοδος και διαταξη για την ενισχυση της ηλεκτροπαραγομενης χημιφωταυγειας νανοσωματιδιων | |
CN105510420A (zh) | 一种基于磁珠分离和dna标记金纳米粒子探针检测atp含量的方法 | |
Liu et al. | A sensitive, non-damaging electrochemiluminescent aptasensor via a low potential approach at DNA-modified gold electrodes | |
CN104151480B (zh) | 一种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子、制备方法及应用 | |
CN103837516A (zh) | 一种基于金纳米团簇荧光探棒快速检测葡萄糖浓度的方法 | |
CN102435587B (zh) | 纳米金共振散射光谱法快速测定水中亚硝酸盐的方法 | |
CN110927076A (zh) | 一种采用金纳米孔阵列芯片的生物检测装置及检测方法 | |
Elaguech et al. | Nanopore-based aptasensor for label-free and sensitive vanillin determination in food samples | |
CN103278487A (zh) | 适配体-纳米金共振瑞利散射光谱测定塑料制品双酚a的方法 | |
CN102661943B (zh) | 用表面增强拉曼光谱测定胱氨酸的方法 | |
CN103575715B (zh) | 一种基于发光金纳米簇检测米托蒽醌的方法 | |
CN109187469A (zh) | 一种用酶催化氧化tmb荧光光谱测定葡萄糖的方法 | |
CN105021580A (zh) | 一种检测17β-雌二醇的方法 | |
CN106645076A (zh) | 金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒 | |
CN103926283A (zh) | 一种用于检测凝血酶的核酸适配体生物传感器的制备方法 | |
CN103940797A (zh) | 利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法 | |
CN103901033A (zh) | 一种检测样品中铅离子浓度的方法 | |
CN102890078A (zh) | 表面增强拉曼光谱检测邻菲罗啉的方法 | |
CN103630525B (zh) | 表面增强拉曼光谱测定镉的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150805 Termination date: 20180719 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |