CN109187469A - 一种用酶催化氧化tmb荧光光谱测定葡萄糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法，其特征是，包括如下步骤：（1）制备已知浓度的葡萄糖标准溶液体系，测定其380nm处的荧光峰强度值为F；（2）制备空白对照溶液体系，亦测定其荧光峰强度值为F0；（3）计算ΔF=F‑F0；（4）以ΔF对葡萄糖的浓度做工作曲线；（5）制备被测样品溶液，测定其荧光峰强度值为F样品，计算ΔF样品=F样品‑F0；（6）依据工作曲线，计算出被测样品中的葡萄糖的浓度。这种方法采用酶催化氧化TMB生成具有荧光的产物，且以反应产物为荧光分子探针使得荧光峰强度与被测物的浓度呈线性关系，实现对目标物的定量测定，方法简便、选择性好、灵敏度高。

Description

一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体是一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法。
背景技术
葡萄糖(glucose)是最重要的活细胞能量来源之一，在医药上常用作营养剂，其在生物医药方面应用非常广泛，因此，检测葡萄糖的含量具有重要的意义。目前，葡萄糖的检测方法有比色法、电化学法、荧光法、化学发光法等方法。有文献报道了现有技术有下面几种方法：一种具有催化活性的多元素掺杂的碳点(ME-CDs)，该碳点被作为一个比色传感器应用于葡萄糖的检测，该方法线性范围为0.20-2.50mmol/L、检出限为0.06mmol/L，该方法特异性较好，但灵敏度低；用Pt纳米簇材料，在H2O2存在的条件下，它可以催化氧化3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)显色，可用于检测0-400μmol/L葡萄糖，检出限为0.28μmol/L，该方法将具有催化活性的银纳米粒子嵌入棉纤维中，建立了一个纳米酶催化快速检测葡萄糖的光度法；一种MoS2/GO复合物用于检测葡萄糖的含量，该方法线性范围为0.83μmol/L-65nmol/L；以一种石墨烯-碳的氮化物(g-C3N4)/氧化铁-铜的纳米结构，用于非酶电化学测定0.6μmol/L-2.0mmol/L葡萄糖，检出限为0.3μmol/L一个与定容结构相结合的射频贴片(radiofrequency patch)生物传感器用于监测葡萄糖含量，该方法线性范围为50–600mg/dL、检出限为15.22mg/dL；一种基于MnO2-酚醛树脂(PFR)的纳米复合材料的荧光检测策略，用于检测血液中的葡萄糖含量，该方法可以同时检测葡萄糖和H2O2，其线性范围为5μmol/L-1mmol/L葡萄糖、检出限为1.5μmol/L葡萄糖。用氨基苯硼酸固定的水溶性银纳米簇(AgNCs-a-APBA)，该新材料与AgNCs相比，荧光强度提高了10倍，利用荧光猝灭实验可以精确的检测到纳摩尔级别的葡萄糖含量，该方法灵敏。迄今尚未见葡萄糖氧化酶(简称GOx)催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)反应用于荧光定量检测葡萄糖的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术不足，而提供一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法。这种方法采用葡萄糖氧化酶催化氧化TMB反应生成有荧光的产物，且以反应产物为荧光分子探针，荧光峰强度与被测物的浓度呈线性关系，实现对目标物的定量测定，这种方法简便、快速、选择性好、灵敏度高。
实现本发明目的的技术方案是：
一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法，与现有技术不同的是，包括如下步骤：
(1)制备已知浓度的葡萄糖标准溶液体系：于不同的刻度试管中，依次加入1μL-40μL 500μmol/L葡萄糖标准溶液、10μL-50μL 0.11mg/mL葡萄糖氧化酶溶液、100μL-200μL0.02mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液和50μL-150μL 0.5mmol/L TMB溶液，摇匀、于40℃水浴反应20min，冰水终止反应，用二次蒸馏水定容至1.5mL；
(2)制备空白对照溶液体系：采用步骤(1)的方法不加葡萄糖标准溶液制备空白对照溶液体系；
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的葡萄糖标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光光谱仪上，设定仪器参数以280nm为激发波长扫描获得体系的荧光光谱，测定380nm处的荧光强度值为F，同时测定空白对照溶液体系的荧光强度值为F0，计算ΔF＝F-F0；
(4)依据ΔF对葡萄糖的浓度关系做工作曲线；
(5)依照步骤(1)的方法制备样品溶液，其中加入的葡萄糖标准溶液替换为样品溶液，并按步骤(3)的方法测定样品溶液的荧光峰强度值为F样品，计算ΔF样品＝F样品-F0；
(6)依据步骤(4)的工作曲线，计算出样品溶液葡萄糖的含量。
实现本技术方案的原理是：在本技术方案条件下，在pH 7.4PBS缓冲溶液中，葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖生成H2O2把TMB氧化为蓝色的有荧光的氧化物(简称TMBox)，以280nm为激发波长，扫描体系溶液在380nm出现一个TMBox的荧光峰，随着葡萄糖浓度的增加，氧化生成的TMBox越多，体系荧光强度逐渐上升，且随着葡萄糖浓度的增加，体系荧光强度呈线性关系，据此建立测定葡萄糖的荧光定量分析方法。
这种方法的优点是：与现有的方法相比，这种方法采用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成H2O2把TMB氧化为具有荧光的氧化物TMBox，且以该荧光产物TMBox做荧光探针，实现了用荧光法测定葡萄糖，这种方法简便、重现性好、选择性好、灵敏度高。
附图说明
图1为实施例中的荧光光谱示意图。
图中，a.1.1μg/mL GOx+2.0mmol/L pH7.4PBS+33.3μmol/L TMB b.a+0.33μmol/L葡萄糖c.a+1.33μmol/L葡萄糖d.a+5.0μmol/L葡萄糖e.a+6.67μmol/L葡萄糖f.a+10.00μmol/L葡萄糖g.a+13.33μmol/L葡萄糖。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。
实施例：
一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)制备已知浓度的葡萄糖标准溶液体系：于6支不同的刻度试管中，分别加入1μL、4μL、15μL、20μL、30μL、40μL 500μmol/L葡萄糖标准溶液，再分别依次加入15μL 0.11mg/mL葡萄糖氧化酶溶液、150μL 0.02mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液和100μL 0.5mmol/L TMB溶液，摇匀、于40℃水浴反应20min，冰水终止反应，用二次蒸馏水定容至1.5mL；
(2)制备空白对照溶液体系：采用步骤(1)的方法不加葡萄糖标准溶液制备空白对照溶液体系；
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的葡萄糖标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光光谱仪上，设定仪器参数，在荧光电压为400V、狭缝为10nm,以280nm为激发波长的条件下扫描获得体系的荧光光谱，测定380nm处的荧光强度值为F，同时测定空白对照溶液体系的荧光强度值为F0，计算ΔF＝F-F0，如图1所示；
(4)依据ΔF对葡萄糖的浓度关系做工作曲线，获得线性回归方程为ΔF＝17.86C+9.3，其中葡萄糖浓度C的单位为μmol/L，测定线性范围为0.33-13.33μmol/L、检出限为0.25μmol/L；
(5)样品测定：取3个厂家的葡萄糖注射液，加二次蒸馏水稀释，依照步骤(1)的方法制备被测样品，其中加入的葡萄糖标准溶液替换为被测样品，按步骤(2)-(4)操作，算出被测样品的ΔF样品＝F样品-F0；
(6)依据步骤(4)的工作曲线，计算出被测样品葡萄糖的含量分别为0.252mol/L、0.249mol/L、0.250mol/L；
本技术方案检测方法的验证：
取上述实施例步骤(5)中的葡萄糖注射液各三份，加入浓度为0.25mol/L的葡萄糖标准溶液，进行加标回收实验，求得回收率分别为99.3％、98.7％、100.0％，相对标准偏差分别为4.5％、3.1％、3.2％，说明本技术方案方法准确可靠。

Claims (1)

1.一种用酶催化氧化TMB荧光光谱测定葡萄糖的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)制备已知浓度的葡萄糖标准溶液体系：于不同的刻度试管中，依次加入1μL-40μL500μmol/L葡萄糖标准溶液、10μL-50μL 0.11mg/mL葡萄糖氧化酶溶液、100μL-200μL0.02mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液和50μL-150μL 0.5mmol/L TMB溶液，摇匀、于40℃水浴反应20min，冰水终止反应，用二次蒸馏水定容至1.5mL；
(2)制备空白对照溶液体系：采用步骤(1)的方法不加葡萄糖标准溶液制备空白对照溶液体系；
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的葡萄糖标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光光谱仪上，设定仪器参数以280nm为激发波长扫描获得体系的荧光光谱，测定380nm处的荧光强度值为F，同时测定空白对照溶液体系的荧光强度值为F0，计算ΔF＝F-F0；
(4)依据ΔF对葡萄糖的浓度关系做工作曲线；
(5)依照步骤(1)的方法制备样品溶液，其中加入的葡萄糖标准溶液替换为样品溶液，并按步骤(3)的方法测定样品溶液的荧光峰强度值为F样品，计算ΔF样品＝F样品-F0；
(6)依据步骤(4)的工作曲线，计算出样品溶液葡萄糖的含量。
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