CN111879741A - 一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测α‑葡萄糖苷酶活性的方法，以对苯二胺为氮源，柠檬酸为碳源，通过水热法制备CDs；再基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α‑葡萄糖苷酶活性；Ce⁴⁺可以氧化无色的TMB生成蓝色的TMB氧化物，由于内滤光效应，oxTMB的紫外吸收与CDs的荧光发射重叠，从而导致CDs的荧光发射强度降低；α‑葡萄糖苷酶能使抗坏血酸葡萄糖苷水解释放具有还原性的抗坏血酸，抗坏血酸可以将oxTMB还原为无色的TMB，使内滤光效应消失，CDs的荧光恢复，其荧光恢复程度与α‑葡萄糖苷酶活性成正比，进而检测α‑葡萄糖苷酶活性，本发明利用荧光增强现象进行检测，解决了利用荧光猝灭现象的方法易受假阳性信号的影响的问题，该方法的检测限低，灵敏度高，选择性好。

Description

一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法

技术领域

本发明属于生物酶活性检测技术领域，涉及一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，具体涉及一种基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活性的方法。

背景技术

生物酶与代谢一起控制生物体中的各种生理过程，生物酶的活性的灵敏检测对于探索其生物功能及其对生物体的影响至关重要，并有助于诊断相关疾病。

α-葡萄糖苷酶是在小肠上皮的膜结合酶，其特异性地水解α-葡萄糖吡喃糖苷键以释放单个α-葡萄糖分子。血液中过量的α-葡萄糖可引起各种组织的慢性损伤和功能障碍。α-葡萄糖苷酶对于控制餐后血糖水平并使葡萄糖水平保持在正常范围内起着至关重要的作用，血液中过量的α-葡萄糖可引起各种组织的慢性损伤和功能障碍。α-葡萄糖苷酶还被认为是庞贝氏症病的一种筛选生物标志物，它是由溶酶体酸α-葡萄糖苷酶的缺乏引起的。此外，精浆中α-葡萄糖苷酶活性的测量也可能用于无精子症的诊断。因此，开发检测α-葡萄糖苷酶活性的灵敏可靠的方法对相关疾病的准确诊断具有重要意义。

目前，用于检测α-葡萄糖苷酶的最常用和传统方法是对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(pNPG)比色法。但是，pNPG方法很容易受到400nm测量波长附近样品吸收重叠的干扰。现有的荧光法检测α-葡萄糖苷酶的文献较少，而且，这些探针具有它们自身的一些缺点，例如，荧光底物的合成方法复杂，在有机染料的水性体系中溶解性差等。且有些已有的检测α-葡萄糖苷酶的荧光测定法是利用荧光猝灭效应。这种荧光关闭传感系统具有低灵敏度，高背景和差的选择性，且大多易受假阳性信号的影响，这极大地限制了它们的实际应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系实现对于α-葡萄糖苷酶活性的检测，此检测方法在其他酶存在下表现出对α-葡萄糖苷酶的优异特异性，且操作简单，检测限低，灵敏度高，选择性好，能快速实现对α-葡萄糖苷酶的活性进行检测。本发明利用荧光增强现象进行检测，解决了其他检测荧光猝灭现象的方法易受假阳性信号的影响的问题。

本发明采取的技术方案为：

一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，所述检测方法包括以下步骤：

A、以对苯二胺为氮源，以柠檬酸为碳源，通过水热法制备碳量子点，并将其溶解在超纯水中形成碳量子点(CDs)溶液；其在490/618nm处具有激发/发射峰；

B、将抗坏血酸葡萄糖苷溶液分别与不同浓度的α-葡萄糖苷酶溶液混合，再加入PBS缓冲溶液，混合均匀后孵育；在α-葡萄糖苷酶的催化下，抗坏血酸葡萄糖苷水解产生抗坏血酸；

C、再依次向步骤B中加入碳量子点溶液，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)水溶液、Ce⁴⁺水溶液、柠檬酸缓冲溶液，然后以超纯水定容，孵育后，在490nm的激发波长下测试各反应体系的荧光光谱；Ce⁴⁺可以将无色过氧化酶底物TMB氧化为蓝色复合物oxTMB，oxTMB在652nm处的吸收峰与所制得的CDs发射峰有较大重叠，由于内滤光效应，CDs的荧光会随着Ce⁴⁺浓度的增大而逐渐降低；但是步骤B中产生的抗坏血酸可以将oxTMB还原成无色TMB，内滤光作用消失，CDs的荧光恢复，且随着α-葡萄糖苷酶浓度的增大，CDs的荧光恢复恢复的程度越大；

D、以α-葡萄糖苷酶溶液的终活性为横坐标，各反应体系在618nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建线性曲线，得出线性方程，进而可测得待α-葡糖苷酶的活性。

进一步地，步骤D中，所述线性方程为F＝716.3+244.9C，相关系数r²＝0.993，其中F为反应体系在618nm处的荧光强度值，C为α-葡萄糖苷酶的终活性，单位为U/mL；该检测方法的检出限为0.02U/mL。

进一步地，抗坏血酸葡萄糖苷、碳量子点、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、Ce⁴⁺在反应体系中的终浓度分别为100μM、35mg/L、100μM、100μM。

所述PBS缓冲溶液pH为7.0，其在步骤B中的终浓度为7.7mM。

所述柠檬酸缓冲溶液pH为4.0，其在步骤C中的终浓度为10mM。

α-葡萄糖苷酶在反应体系中的终活性分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6U mL^-1。

步骤B中，所述孵育的条件为37℃下孵育30分钟。

步骤C中，所述孵育的条件为室温下孵育3-5分钟。

更进一步地，所述检测方法具体包括以下步骤：

A、以对苯二胺为氮源，以柠檬酸为碳源，通过水热法制备碳量子点，并将其溶解在超纯水中形成碳量子点溶液；

B、将200μL 0.5mM抗坏血酸葡萄糖苷溶液分别与50μL不同浓度的α-葡萄糖苷酶溶液混合，再加入10μL 0.2M pH7.0的PBS缓冲溶液，混合均匀后在37℃下孵育30分钟；

C、再依次向步骤B中加入100μL 0.35g L^-1碳量子点溶液，100μL 1mM3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液、100μL 1mM Ce⁴⁺水溶液、100μL 0.1M pH 4.0的柠檬酸缓冲溶液，然后以超纯水定容至1mL，在室温下孵育5分钟后，在490nm的激发波长下测试各反应体系的荧光光谱；

D、以α-葡萄糖苷酶溶液的终活性为横坐标，各反应体系在618nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建线性曲线，得出线性方程，进而可测得待测液中α-葡糖苷酶的浓度。

进一步地，所述碳量子点溶液的制备方法为：将对苯二胺溶于超纯水X中，加入柠檬酸将pH调节至5-6，将混合溶液转移到聚四氟乙烯不锈钢高压釜中并补加超纯水Y，180℃水热反应12小时，反应结束后将反应液冷却至室温，离心分离得到清液，清液透析4小时，所得产物干燥后加入超纯水重新溶解成为0.35g L^-1的碳点溶液。

进一步地，加入柠檬酸之前，对苯二胺在超纯水X中的浓度为2g/L。所述超纯水X与超纯水Y的体积之比为1:1.5。透析使用500Da透析袋，并以超纯水为透析液，透析后保留透析袋里面的碳点溶液。

本发明公开的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，是基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系实现对于α-葡萄糖苷酶活性的定量检测的，首先以对苯二胺为氮源，柠檬酸为碳源，通过水热法制备红色荧光CDs，其最大激发/发射波长为490/618nm；然后基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活性，Ce⁴⁺可以氧化无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色的TMB氧化物(oxTMB)，由于内滤光效应(IFE)oxTMB的紫外吸收与CDs的红色荧光发射重叠，从而导致CDs的荧光发射强度降低；α-葡萄糖苷酶能使抗坏血酸葡萄糖苷(AA-2G)水解释放具有还原性的抗坏血酸，抗坏血酸可以将oxTMB还原为无色的TMB，使内滤光效应消失，CDs的荧光恢复。其荧光恢复程度与α-葡萄糖苷酶活性成正比，据此构建了一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法利用荧光增强现象进行检测，解决了其他检测荧光猝灭现象的方法易受假阳性信号的影响的问题。

本发明提供的检测方法中，在碳量子点的终浓度为35mg/L，Ce⁴⁺终浓度为100μM，TMB终浓度为100μM，AA-2G终浓度为100μM时，体系中随着α-葡萄糖苷酶的活性的增加，体系在618nm处的荧光强度值呈良好的线性关系，α-葡萄糖苷酶的活性的线性范围为0-6U/mL，相关系数r²＝0.993，线性方程为F＝716.3+244.9C，检出限为0.02U/mL。

本发明还可利用CDs/TMB探针体系实现对于Ce⁴⁺的定量检测，Ce⁴⁺可以将无色过氧化酶底物TMB氧化为蓝色复合物oxTMB，oxTMB在652nm处的吸收峰与所制得的CDs发射峰有较大重叠，由于内滤光效应，CDs的荧光会随着Ce⁴⁺浓度的增大而逐渐降低，并在特定的条件下，体系在618nm处的荧光强度值会随着Ce⁴⁺浓度呈线性相关。

本发明提供的检测方法，操作简单，检测限低，灵敏度高，选择性好，能快速实时的对α-葡萄糖苷酶的活性进行检测。

附图说明

图1为实施例1制备的CDs的透射电镜图；

图2为实施例1制备的CDs的红外光谱图；

图3为实施例1制备的CDs的X射线光电子能谱(XPS)图；

图4为实施例1制备的CDs的激发光谱和发射光谱图；

图5为实施例2中的CDs/TMB探针体系检测不同浓度的Ce⁴⁺的荧光光谱图；

图6为实施例2中的CDs/TMB探针体系检测Ce⁴⁺的线性关系图；

图7为CDs、CDs与TMB混合后的荧光光谱图，其中CDs终浓度：35mg/L，TMB终浓度：100μM；

图8为CDs的荧光光谱图与oxTMB的紫外吸收光谱图；

图9为实施例3中的CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测不同活度的α-葡萄糖苷酶的荧光光谱图；

图10为实施例3中的CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活度的线性关系图；

图11为基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系定量检测α-葡萄糖苷酶活性的示意图；

图12为抗坏血酸葡萄糖苷水解时所用的PBS缓冲溶液的pH对CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活度的反应体系的荧光强度的影响图；

图13为抗坏血酸葡萄糖苷水解的时间对CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活度的反应体系的荧光强度的影响图；

图14抗坏血酸葡萄糖苷水解的温度对CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活度的反应体系的荧光强度的影响图；

图15为CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测其他干扰酶和生物蛋白的荧光强度变化柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

本发明中各物质的溶液，如无特殊说明均是各物质溶解在超纯水中制备的溶液。

实施例1

碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

将0.02g对苯二胺溶于10mL超纯水中，并通过加入10mL 1mM柠檬酸溶液将pH调节至5-6。然后将混合溶液转移到聚四氟乙烯不锈钢高压釜中并加入15mL超纯水，接着将混合物置于烘箱中并在180℃下加热12小时。12小时后，将混合液冷却至室温，离心分离得到清液，再用500Da透析袋透析4小时以除去未反应物，保留透析袋里面的碳点溶液，透析时的透析液为超纯水，将产物转移置于真空干燥箱中干燥，重新溶解成为0.35g L^-1的碳量子点(CDs)溶液，保存于4℃下备用。

图1为CDs的透射电镜图，从TEM图中可以看出本实施例所制备的CDs大多是球形的并且是单分散的，其尺寸分布为9～13nm。

图2为本实施例所制备的CDs的红外光谱图(FTIR)。如图所示，在3330cm^-1和3206cm^-1处的吸收峰归因于O-H和N-H键的拉伸振动，表明存在羟基和氨基。2928cm^-1处微小的峰值归因于C-H的拉伸振动。在1607、1511和1280cm^-1处的三个尖峰分别归因于C＝O，N-H和C-N键的拉伸振动。在830cm^-1处还观察到了C-N-H弯曲振动。红外光谱图解释了CDs表面具有的官能团。

图3为本实施例所制备的CDs的X射线光电子能谱(XPS)，从图中可以看出CDs的XPS光谱在285、400和531eV处显示三个峰，分别对应于C1s，N 1s和O1s。

图4为本实施例所制备的CDs在490nm的激发波长下测试的荧光光谱图，从图中可见，其最大激发/发射波长为490/618nm。

实施例2

一种定量检测Ce⁴⁺的方法，包括以下步骤：

(1)取100μL 0.35g L^-1的碳点(CDs)溶液，100μL的1mM TMB水液和特定浓度的Ce⁴⁺水溶液混合在100μL的0.2M pH 4.0的柠檬酸缓冲溶液中，然后加水至1.0mL，并充分混合，Ce⁴⁺在反应体系中的最终浓度分别为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μM；所述Ce⁴⁺的来源为硫酸铈(Ce(SO₄)₂)；

将混合物在室温温育5分钟，然后在490nm的激发波长下测试各反应体系的荧光光谱，各反应体系的荧光光谱如图5所示，从图中可见，随着Ce⁴⁺浓度的增大，反应体系的荧光强度逐渐减小。

(2)以Ce⁴⁺的终浓度为横坐标，各反应体系在618nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建线性曲线，如图6所示，得出线性方程F＝2164.24-14.08C，相关系数r²＝0.995，其中F为反应体系在618nm处的荧光强度值，C为Ce⁴⁺的终浓度，单位为μM，进而可测得待测Ce⁴⁺的浓度。

上述基于CDs/TMB探针体系定量检测Ce⁴⁺的原理为：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)水溶液是一种无色的溶液，CDs溶液在618nm处发出强烈荧光。当CDs与TMB混合时，在618nm处的荧光发射无明显变化，如图7所示。但是，发现当Ce⁴⁺被加入到CDs/TMB系统中时，TMB被Ce⁴⁺氧化形成蓝色的oxTMB，oxTMB在652nm处的吸收峰与CDs的发射峰有重叠，如图8所示，产生了内滤光效应，导致CDs的荧光强度明显降低，并且荧光强度与所加入的Ce⁴⁺浓度线性相关，随着加入的Ce⁴⁺浓度的增大，反应体系的荧光强度逐渐降低，可见Ce⁴⁺可猝灭CDs/TMB体系的荧光。

实施例3

一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)将200μL 0.5mM抗坏血酸葡萄糖苷(AA-2G)溶液与50μL不同浓度的α-葡萄糖苷酶溶液混合，再加入10μL 0.2M pH7.0的PBS缓冲溶液，混合均匀后在37℃下孵育30分钟；

(2)再依次向上述体系中加入100μL CDs溶液，100μL 1mM TMB水溶液和100μL 1mMCe⁴⁺水溶液，再加入100μL 0.1M pH 4.0的柠檬酸缓冲溶液，用超纯水定容到1mL。在室温下孵育5分钟后，在490nm的激发波长下测试各反应体系的荧光光谱，各反应体系的荧光光谱如图9所示；α-葡萄糖苷酶在反应体系中的最终活性为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6U mL^-1；所述Ce⁴⁺的来源为硫酸铈(Ce(SO₄)₂)；

(3)以α-葡萄糖苷酶的终活性为横坐标，各反应体系在618nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建线性曲线得出线性方程，如图10所示，进而可测得待测液中α-葡糖苷酶的浓度。线性方程为F＝716.3+244.9C，相关系数r²＝0.993，检出限为0.02U/mL，检出限公式C_lim＝3δ/k，其中δ是空白测定的标准偏差(n＝3)、k是校准曲线的斜率。

上述基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活性的原理为：CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系中，基于实施例2中内容可见该探针体系中，Ce⁴⁺可氧化TMB形成蓝色的oxTMB，oxTMB在652nm处的吸收峰与CDs的发射峰有重叠，产生了内滤光效应，导致CDs的荧光强度明显降低；抗坏血酸葡萄糖苷在α-葡萄糖苷酶的催化下水解释放具有还原性的抗坏血酸，抗坏血酸将oxTMB还原为无色的TMB，IFE消失，荧光恢复。其荧光恢复程度与α-葡萄糖苷酶活性成正比，据此构建了检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，基于CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡萄糖苷酶活性的示意图如图11所示。

实施例4

检测α-葡萄糖苷酶活性的方法中抗坏血酸葡萄糖苷水解反应条件的优选实验

为了获得最佳灵敏度，对体系实验条件进行了优化。α-葡萄糖苷酶水解抗坏血酸葡萄糖苷的PBS缓冲溶液的pH、反应时间t、反应温度T都是影响荧光强度的重要参数，因此在荧光测定α-葡萄糖苷酶前，通过优化反应时间、反应酸碱度以及反应温度，使该方法检测α-葡萄糖苷酶的灵敏度最大程度地提高。

下述实验的过程中，α-葡萄糖苷酶终活性均为3U mL^-1，各实验的步骤与参数均与实施例3中的步骤(1)和(2)相同，考察α-葡萄糖苷酶水解抗坏血酸葡萄糖苷的PBS缓冲溶液的pH、水解反应时间t、水解反应温度T对体系荧光强度的影响。

实验发现，抗坏血酸葡萄糖苷水解时，反应体系中加入的PBS缓冲溶液的pH的大小会影响抗坏血酸葡萄糖苷的水解，如图12所示，从图12中可以看出，pH在7.0时，荧光强度的变化量达到最大(荧光强度的变化量＝水解后体系的荧光强度-水解前体系的荧光强度)。因此本实验采用pH为7.0的磷酸缓冲溶液作为最佳的实验条件。

由图13可知，体系荧光强度随水解反应时间的增加而增加，然后随反应时间的进一步增长逐渐保持稳定，为了反应更彻底，因此选择最佳反应时间为30分钟。

从图14可以看出，水解温度在37℃时，荧光强度的变化量达到最大(荧光强度的变化量＝水解后体系的荧光强度-水解前体系的荧光强度)。因此本实验采用37℃为以后的水解温度。因此，在实施例3中采用水解时PBS缓冲溶液的pH＝7，水解反应时间30分钟，水解温度37℃进行α-葡萄糖苷酶活性的检测。

实施例5

检测α-葡萄糖苷酶活性的选择性实验

一个稳定优良的荧光探针，必须有较好的选择性和抗干扰能力。通过测定由各种潜在干扰物质的存在引起的荧光强度来评估探针对α-葡萄糖苷酶的选择性。

在实施例3的反应条件下进行实验，将实施例3中α-葡萄糖苷酶分别替换为下述一系列的干扰酶和生物蛋白，包括β-葡萄糖苷酶(β-Glu)、蛋白酶(Protease)、淀粉酶(AMS)、过氧化氢酶(CAT)、牛血清白蛋白(BSA)、牛血红蛋白(BHB)、人血清蛋白(HSA)、硫酸鱼精蛋白(Protamine sulfate)、L-半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)，用于测定碳量子点/TMB/Ce⁴⁺体系检测α-葡萄糖苷酶活性的方法的选择性。

α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶(β-Glu)、蛋白酶(Protease)、淀粉酶(AMS)、过氧化氢酶(CAT)、牛血清白蛋白(BSA)、牛血红蛋白(BHB)、人血清蛋白(HSA)、硫酸鱼精蛋白(Protamine sulfate)、L-半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)在反应体系中的终浓度/终活性分别为5U mL^-1、50U mL^-1、50U mL^-1、50U mL^-1、50U mL^-1、1g L^-1、1g L^-1、1g L^-1、0.5g L^-1、0.5gL^-1、0.5g L^-1。

如图15所示，由α-葡萄糖苷酶引起的探针系统的荧光强度显着大于其他测试物质的荧光强度。这些结果表明该探针对α-葡萄糖苷酶具有突出的特异性和选择性，而不受其他物质的干扰。

实施例6

为了验证所构建的传感器在检测α-葡糖苷酶活性的准确性，通过往蒸馏水中加入已知量的α-葡糖苷酶，再利用所构建的CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系检测α-葡糖苷酶活性，实验步骤与实施例3中的一致。如下表所示，样品中α-葡萄糖苷酶的平均回收率范围为99.6％～101.3％，相对标准偏差(RSD)低于5％。所有这些结果表明本发明所构建的CDs/TMB/Ce⁴⁺探针体系作为传感器可以用于生物基质中以进行α-葡萄糖苷酶活性监测。

表1

上述参照实施例对一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

A、以对苯二胺为氮源，以柠檬酸为碳源，通过水热法制备碳量子点，并将其溶解在超纯水中形成碳量子点(CDs)溶液；

B、将抗坏血酸葡萄糖苷溶液分别与不同浓度的α-葡萄糖苷酶溶液混合，再加入PBS缓冲溶液，混合均匀后孵育；

C、再依次向步骤B中加入碳量子点溶液，3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液、Ce⁴⁺水溶液、柠檬酸缓冲溶液，然后以超纯水定容，孵育后，在490nm的激发波长下测试各反应体系的荧光光谱；

D、以α-葡萄糖苷酶的终活性为横坐标，各反应体系在618nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建线性曲线，得出线性方程，进而可测得待测α-葡糖苷酶的活性。

2.根据权利要求1所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：抗坏血酸葡萄糖苷、碳量子点，3,3',5,5'-四甲基联苯胺、Ce⁴⁺在反应体系中的终浓度分别为100μM、35mg/L、100μM、100μM。

3.根据权利要求1所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：所述PBS缓冲溶液pH为7.0，其在步骤B中的终浓度为7.7mM；所述柠檬酸缓冲溶液pH为4.0，其在步骤C中的终浓度为10mM。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：α-葡萄糖苷酶在反应体系中的终活性分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6U mL^-1。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：步骤B中，所述孵育的条件为37℃下孵育30分钟。

6.根据权利要求1-3任意一项所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：步骤C中，所述孵育的条件为室温下孵育3-5分钟。

7.根据权利要求1所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：所述所述检测方法具体包括以下步骤：

A、以对苯二胺为氮源，以柠檬酸为碳源，通过水热法制备碳量子点，并将其溶解在超纯水中形成碳量子点溶液；

B、将200μL 0.5mM抗坏血酸葡萄糖苷溶液分别与50μL不同浓度的α-葡萄糖苷酶溶液混合，再加入10μL 0.2M pH7.0的PBS缓冲溶液，混合均匀后在37℃下孵育30分钟；

C、再依次向步骤B中加入100μL 0.35g L^-1碳量子点溶液，100μL 1mM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液、100μL 1mM Ce⁴⁺水溶液、100μL 0.1M pH 4.0的柠檬酸缓冲溶液，然后以超纯水定容至1mL，在室温下孵育5分钟后，在490nm的激发波长下测试各反应体系的荧光光谱；

D、以α-葡萄糖苷酶终活性为横坐标，各反应体系在618nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建线性曲线，得出线性方程，进而可测得待测液中α-葡糖苷酶的浓度。

8.根据权利要求1或7所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，所述碳量子点溶液的制备方法为：将对苯二胺溶于超纯水X中，加入柠檬酸将pH调节至5-6，将混合溶液转移到聚四氟乙烯不锈钢高压釜中并补加超纯水Y，180℃水热反应12小时，反应结束后将反应液冷却至室温，离心分离得到清液，清液透析4小时，所得产物干燥后加入超纯水重新溶解成为0.35g L^-1的碳点溶液。

9.根据权利要求8所述的检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，加入柠檬酸之前，对苯二胺在超纯水X中的浓度为2g/L。

10.根据权利要求8所述的基于CDs/TMB/Ce⁴⁺体系检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，所述超纯水X与超纯水Y的体积之比为1:1.5。

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