CN110398482A - 利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法 - Google Patents

利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β‑葡萄糖苷酶的方法。β‑葡萄糖苷酶可水解β‑熊果苷产生对苯二酚，对苯二酚可与超支化聚乙烯亚胺交联并形成水溶性荧光聚合物纳米颗粒，生成荧光聚合物纳米颗粒的荧光强度与对苯二酚的浓度或者参加水解过程中的β‑葡萄糖苷酶的活性成正比，当对苯二酚的浓度在0～2.5μM或者β‑葡萄糖苷酶的浓度在1～36U L‑1范围时，体系在510nm处的荧光强度与对苯二酚的浓度或β‑葡萄糖苷酶活性呈良好的线性关系，进而可利用聚乙烯亚胺实现对于对苯二酚及β‑葡萄糖苷酶活性的定量检测。该方法操作简单，检测限低，灵敏度高，选择性好，能快速实时的对β‑葡萄糖苷酶的活性进行定量检测。

Description

利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.21)是糖苷水解酶家族中的一大类酶，其主要功能是水解结合于底物末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶在土壤，微生物，植物，哺乳动物和人类中含量丰富，它们在生物过程中起重要作用。β-葡萄糖苷酶的活性通常用作指示以证明生物体的定性变化。据报道，它是新生儿坏死性小肠结肠炎早期诊断的潜在生物标志物，也是克服乳腺癌化疗耐药性的替代治疗策略。β-葡萄糖苷酶在疾病的诊断、治疗中发挥着重要作用。此外，β-葡萄糖苷酶在食品工业中起着重要作用。β-葡萄糖苷酶被用来使蔬菜、水果、茶叶等食物产生增香作用。并且这些酶可以从大豆产品中存在的糖基化的类黄酮中除去糖苷部分，获得其有益健康效果。此外，β-葡萄糖苷酶还是一种用于改善食品风味的重要酶制剂，广泛应用于食品、药品、保健品等领域。β-葡萄糖苷酶还在组分的生物转化和果汁和葡萄酒的风味增强中起重要作用。因此，开发灵敏可靠的方法来测定β-葡萄糖苷酶活性具有重要意义。
目前，β-葡萄糖苷酶的检测方法主要有分光光度比色法和荧光光谱法。传统的比色测定法由于易受干扰，其灵敏度通常非常有限。相较之下，荧光测定具有快速响应，高灵敏度和简单操作优点，近年来引起了更多关注。开发一种具有灵敏度高选择性好的基于荧光光谱法测定β-葡萄糖苷酶活性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法。该方法操作简单，检测限低，灵敏度高，选择性好，能快速实时的对对苯二酚浓度及β-葡萄糖苷酶的活性进行检测
本发明采取的技术方案为：
本发明首先提供了聚乙烯亚胺在定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶中的应用。β-葡萄糖苷酶可水解β-熊果苷产生对苯二酚，对苯二酚可与超支化聚乙烯亚胺(PEI)交联并形成水溶性荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)，生成荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的荧光强度与对苯二酚的浓度或者参加水解过程中的β-葡萄糖苷酶的活性成正比，当对苯二酚的浓度在0～2.5μM或者β-葡萄糖苷酶的浓度在1～36U L-1范围时，体系在510nm处的荧光强度与对苯二酚的浓度或β-葡萄糖苷酶活性呈良好的线性关系，进而可利用聚乙烯亚胺实现对于对苯二酚及β-葡萄糖苷酶活性的定量检测。
本发明还提供了一种对苯二酚的定量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)向聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液中，加入一系列不同浓度的对苯二酚溶液，反应之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；
(2)以对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出对苯二酚的浓度。
进一步地，步骤(1)中，聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲溶液的终浓度分别为0.29g/L～0.37g/L、18mM～22mM，分别优选为0.33g/L、20mM；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0，优选为8.2。
步骤(1)中，对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM。
步骤(1)中，所述反应的条件为55～65℃反应85～95分钟，优选为60℃反应90分钟。
更进一步地，所述对苯二酚的定量检测方法具体包括以下步骤：
(1)将300μL、2.2g L-1PEI的溶液与1.0mL pH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液混合，然后向混合液中加入700μL含有特定浓度对苯二酚的溶液，以使对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM，然后保持在60℃持续90分钟，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；
(2)以对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出对苯二酚的浓度。
进一步地，所述步骤(2)中，所述标准曲线的线性方程为F＝104.5+1464.9C，其线性相关系数R2＝0.996，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为对苯二酚的浓度，单位为μM，该方法的检测限为0.02μM。
本发明还提供了一种β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，包括以下步骤：
A、分别使用不同浓度的β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷，得到水解液；
B、分别向步骤A得到的水解液中加入聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液，孵育之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；
C、以β-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出β-葡萄糖苷酶的活性。
进一步地，β-熊果苷、聚乙烯亚胺溶液在体系中的终浓度分别为47μM～53μM，0.29g/L～0.37g/L，并分别优选为50μM、0.33g/L；
进一步地，所述步骤A具体包括以下步骤：将β-熊果苷溶液与磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中加入不同浓度的β-葡萄糖苷酶，在38～42℃反应56～64分钟，优选为40℃温育60分钟。
所述步骤A中的磷酸盐缓冲液的pH为6.5-7.0，优选为6.5。
更进一步地，所述步骤A具体包括以下步骤：将100μL、1.0mMβ-熊果苷溶液与100μL的pH＝6.5的40mM磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中加入500μL不同浓度的β-葡萄糖苷酶，以使体系中β-葡萄糖苷酶的终浓度分别为0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、50、60、70、80、90、100U L-1，在40℃下温育60分钟。
所述步骤B中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0，优选为8.2。
所述步骤B中，孵育的条件为：55～65℃反应85～95分钟，优选为60℃孵育90分钟。
进一步地，所述步骤B具体包括以下步骤：分别向步骤A得到的水解液中加入300μL、2.2g L-1PEI溶液和1.0mL pH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液的混合溶液，将其在60℃孵育90分钟，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱。
进一步地，所述步骤C中，所述标准曲线的线性方程为F＝–57.8+116.6C，其线性相关系数R2＝0.994，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为β-葡萄糖苷酶的浓度，单位为U L-1，该方法的检测限为0.4U L-1。
本发明提供的技术方案中，超支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种树枝状聚合物，在主链和支链中都含有丰富的活性胺基。酚类化合物很容易在碱性条件下被空气中的氧气氧化，当将PEI加入到对苯二酚溶液中时，对苯二酚被氧化成对苯醌。对苯醌容易与PEI上的胺基发生席夫碱缩合反应，这是含有酮和氨基的化合物之间的反应，这种缩合反应使PEI高分子链间或PEI高分子链内发生交联，得到含有C＝N键的产物。由于交联作用使分子量变大，在水溶液中形成纳米颗粒，另一方面大量的C＝N键固定在纳米颗粒中具有较强的发光性能。该荧光聚合物纳米颗粒的荧光强度会随着对苯二酚浓度的增大而增加，进而利用此现象，通过构建对苯二酚浓度与体系荧光强度之间的线性关系进而可实现对于对苯二酚浓度的定量检测。
而β-葡萄糖苷酶可水解β-熊果苷产生对苯二酚，随着β-葡萄糖苷酶浓度的增加，水解生成的对苯二酚的量也随着增加，进而可利用上述对苯二酚与PEI之间的上述反应，构建β-葡萄糖苷酶浓度与体系荧光强度之间的线性关系进而可实现对于β-葡萄糖苷酶浓度即活性的定量检测。
本发明提出了一种利用β-葡萄糖苷酶酶促底物β-熊果苷水解以释放HQ间接检测β-葡萄糖苷酶的方法，具有优异特异性，且利用荧光增强现象进行检测，解决了其他检测荧光猝灭现象的方法易受假阳性信号的影响的问题。所开发的测定方法在其他酶存在下表现出对β-葡萄糖苷酶的优异特异性。该方法操作简单，检测限低，灵敏度高，选择性好，能快速实时的对β-葡萄糖苷酶的活性进行定量检测。并且由于制备的FPNs具有强烈绿色荧光，还可通过裸眼进行定性检测，为β-葡萄糖苷酶的活性检测提供了新方法。
附图说明
图1为PEI与不同浓度的对苯二酚反应后的荧光光谱图；
图2为PEI与不同浓度的对苯二酚反应后的荧光强度与对苯二酚浓度关系图；
图3为对苯二酚浓度在0～2.5μM范围内时，对苯二酚浓度与体系荧光强度关系图；
图4为实施例1中的步骤(1)得到的荧光聚合物纳米材料(FPNs)的透射电镜图；
图5为对苯二酚(HQ)、聚乙烯亚胺(PEI)和荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的红外光谱图；
图6为对苯二酚(HQ)、聚乙烯亚胺(PEI)和荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的紫外光谱图；
图7为pH对FPNs荧光强度的影响图；
图8为不同浓度的β-葡萄糖苷酶对β-熊果苷底物水解所得产物与PEI作用后体系的荧光光谱图；
图9为β-葡萄糖苷酶浓度在1-36U L-1范围内时，β-葡萄糖苷酶浓度与体系荧光强度关系图；
图10为β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-熊果苷、对苯二酚、β-熊果苷的紫外光谱图；
图11为使用PEI和β-熊果苷底物作为探针检测β-葡萄糖苷酶示意图；
图12为pH对β-熊果苷的水解的影响图；
图13为β-葡萄糖苷酶检测时的抗干扰实验图，图中1-10分别为β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、人血清蛋白、牛血红蛋白、牛血清白蛋白、鱼精蛋白、L-半胱氨酸、谷胱甘肽和甘氨酸。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明所使用的聚乙烯亚胺(PEI)购买自阿拉丁试剂公司，分子量10000，纯度99％。
本发明所涉及的各物质的溶液，如无特殊说明，均为各物质的水溶液。
实施例1
一种对苯二酚的定量检测方法，包括以下步骤：
(1)将300μL、2.2g L-1PEI的溶液与1.0mL pH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液混合，然后向混合液中加入700μL含有特定浓度对苯二酚的溶液，以使对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM，然后保持在60℃持续90分钟，在373nm的激发波长和5nm激发和发射狭缝下检测体系的荧光光谱，如图1、2所示，从中可以看出PEI没有荧光发射，但PEI和对苯二酚的混合物导致荧光强度增加，并且增加与对苯二酚浓度的增加有关；
(2)以0～2.5μM范围内的对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，如图3所示，所述标准曲线的线性方程为F＝104.5+1464.9C，其线性相关系数R2＝0.996，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为对苯二酚的浓度，单位为μM，该方法的检测限为0.02μM，进而定量检测出对苯二酚的浓度。
将步骤(1)检测体系进行透射电镜测试，透射电镜图如图4所示，从图中可以看出，对苯二酚与PEI反应之后得到了荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)，其在溶液中可以均匀分散，平均粒径约40-60nm。
图5为对苯二酚(HQ)、聚乙烯亚胺(PEI)和步骤(1)得到的荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的红外光谱(FTIR)光谱。PEI在1282至1595cm-1处的峰值归因于N-H弯曲振动，HQ在1477cm-1和800cm-1处的峰值归因于C-H弯曲振动。而FPNs的FTIR光谱中2935cm-1处的峰值归因于对称-CH2伸缩振动，且在1561cm-1处出现了HQ和PEI光谱中未出现的新峰，表明在交联期间PEI与HQ之间发生了交联，并且形成了亚胺键(C＝N)。由此可证明步骤(1)成功制备了FPNs。
图6为对苯二酚(HQ)、聚乙烯亚胺(PEI)和荧光聚合物纳米颗粒(FPNs)的紫外-可见吸收图。当仅存在FPNs时，在380nm处具有强特征吸收峰，而HQ和PEI在350nm以上没有显著吸收，新的吸收带可归因于C＝N键的n→π*跃迁。这些结果进一步表明FPNs的形成涉及在PEI存在下将对苯二酚氧化成对苯醌，然后发生席夫碱缩合。
实施例2
对苯二酚的定量检测方法中磷酸盐缓冲溶液的pH筛选
在与实施例1同样的步骤下，在对苯二酚终浓度为1.0μM，测试加入不同pH的磷酸盐缓冲溶液时，体系的荧光光谱，进而以pH为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标作图，如图7所示，从图中可以看出，体系pH的大小会影响FPNs的荧光强度，pH在8.0-10时，FPNs的荧光强度较大，在pH为8.2时，体系的荧光强度最大。因此在进行采用苯二酚的定量检测时，pH为8.2的磷酸缓冲溶液作为以后的实验条件。
实施例3
一种β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，包括以下步骤：
A、将100μL、1.0mMβ-熊果苷溶液与100μL的pH＝6.5的40mM磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中分别加入500μL不同浓度的β-葡萄糖苷酶溶液，以使体系中β-葡萄糖苷酶的终浓度分别为0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、50、60、70、80、90、100UL-1，然后在40℃下温育60分钟，得到水解液；
B、分别向步骤A得到的水解液中加入300μL、2.2g L-1PEI溶液和1.0mLpH＝8.2的40mM磷酸盐缓冲溶液的混合溶液，将其在60℃孵育90分钟以形成FPNs，在此阶段，由于在FPNs形成期间较高的pH和温度，β-葡萄糖苷酶对β-熊果苷的催化水解停止，使用HitachiF-4700荧光分光光度计在373nm的激发波长和5nm的激发和发射狭缝处检测体系的荧光光谱，如图8所示；
C、以0～36U L-1范围内的β-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建线性曲线，如图9所示，所述标准曲线的线性方程为F＝–57.8+116.6C，其线性相关系数R2＝0.994，其中F为510nm波长处的荧光强度，C为β-葡萄糖苷酶的浓度，单位为U L-1，使用等式Clim＝3δ/k(其中δ是空白测定的标准偏差(n＝6)和k是校准曲线的斜率)确定的检测极限(Clim)为0.4U L-1。进而定量检测出β-葡萄糖苷酶的活性。
图10为β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-熊果苷、HQ、β-熊果苷的紫外光谱图，由图10可知β-葡萄糖苷酶在250nm以上没有吸收峰，β-熊果苷的紫外吸收在282nm处，而β-葡萄糖苷酶催化β-熊果苷水解的产物在290nm左右有明显的紫外吸收峰，这与纯HQ水溶液的紫外吸收完全一致。这表明β-葡萄糖苷酶催化β-熊果苷水解生成了HQ。
本方法检测β-葡萄糖苷酶示意图如图11所示。
实施例4
β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷时磷酸盐缓冲液pH的筛选
在与实施例2同样的步骤下，在β-葡萄糖苷酶浓度为35U L-1时，测时在β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷时，加入不同pH的磷酸盐缓冲溶液时，体系的荧光光谱，进而以pH为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标作图，如图12所示，从图中可以看出，体系pH的大小会影响β-熊果苷的水解，从图12可以看出，pH在6.5-7.0时，FPNs的荧光强度较大，在pH为6.5时，体系的荧光强度最大，因此本实验采用pH为6.5的磷酸缓冲溶液作为β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷时的实验条件。
实施例5
β-葡萄糖苷酶活性的检测的抗干扰实验
一个稳定优良的荧光探针，必须有较好的选择性和抗干扰能力。通过测定由各种潜在干扰物质的存在引起的荧光强度来评估探针对β-葡萄糖苷酶的选择性。因此，本发明选择了一系列干扰酶和生物蛋白，如α-葡萄糖苷酶，过氧化氢酶，人血清蛋白，牛血红蛋白，牛血清白蛋白，鱼精蛋白，L-半胱氨酸，谷胱甘肽和甘氨酸用于进行干扰性实验测试。上述各物质在体系中的终浓度分别为：β-葡萄糖苷酶20U L-1，α-葡萄糖苷酶200U L-1，过氧化氢酶200U L-1，人血清蛋白10mg L-1，牛血红蛋白10mg L-1，牛血清白蛋白10mg L-1，鱼精蛋白10mg L-1，L-半胱氨酸10mg L-1，谷胱甘肽10mg L-1和甘氨酸10mg L-1。
如图13所示，由β-葡萄糖苷酶(20U L-1)引起的探针系统的荧光强度显着大于其他测试物质的荧光强度。这些结果表明该探针对β-葡萄糖苷酶具有突出的特异性和选择性，而不受其他非靶标样品的干扰。
实施例6
实际样品中β-葡萄糖苷酶浓度的测定
为了说明所提出的传感器在实际样品中的实用性，在该测定中使用稀释的人血清白蛋白(0.5％)来监测实际样品中的β-葡糖苷酶活性。用去离子水将人血清白蛋白样品(含有0.5％人血清白蛋白)稀释500倍。在0.5％人血清白蛋白样品中测量β-葡糖苷酶活性。由于未检测到0.5％人血清白蛋白样品中的β-葡萄糖苷酶，因此使用标准加入法计算β-葡萄糖苷酶的回收率。其他程序与实施例3中β-葡萄糖苷酶检测程序类似。加入10和20U L-1β-葡萄糖苷酶的0.5％人血清白蛋白样品的回收率见表1。实际样品中β-葡萄糖苷酶的平均回收率范围为95.2％～104.5％，相对标准偏差(RSD)低于2.9％。所有这些结果表明所提出的传感器可以用于生物基质中以进行β-葡萄糖苷酶活性监测。结果如表1所示：
表1 0.5％人血清白蛋白样品中β-葡萄糖苷酶的分析
上述参照实施例对利用聚乙烯亚胺定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.聚乙烯亚胺在定量检测对苯二酚和β-葡萄糖苷酶中的应用。
2.一种对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)向聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液中，加入一系列不同浓度的对苯二酚溶液，反应之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；
(2)以对苯二酚溶液的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出对苯二酚的浓度。
3.根据权利要求2所述的对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，聚乙烯亚胺溶液、磷酸盐缓冲溶液的终浓度分别为0.29g/L～0.37g/L、18mM～22mM；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0。
4.根据权利要求2所述的对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，对苯二酚溶液的终浓度分别为0、0.05、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1，2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、6.5、9.0、12.0、15.0μM。
5.根据权利要求2所述的对苯二酚的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的条件为55～65℃反应85～95分钟。
6.一种β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、分别使用不同浓度的β-葡萄糖苷酶水解β-熊果苷，得到水解液；
B、向聚乙烯亚胺溶液和磷酸盐缓冲溶液的混合液中，分别加入步骤A得到的水解液，孵育之后，在373nm的激发波长下检测体系的荧光光谱；
C、以β-葡萄糖苷酶的浓度为横坐标，体系在510nm波长处的荧光强度为纵坐标构建标准曲线，进而定量检测出β-葡萄糖苷酶的活性。
7.根据权利要求6所述的β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，其特征在于，β-熊果苷、聚乙烯亚胺溶液的终浓度分别为47μM～53μM、0.29g/L～0.37g/L。
8.根据权利要求6所述的β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，其特征在于，所述步骤A具体包括以下步骤：将100μL、1.0mMβ-熊果苷溶液与100μL的pH＝6.5的40mM磷酸盐缓冲液混合，然后向混合物中加入500μL不同浓度的β-葡萄糖苷酶，以使体系中β-葡萄糖苷酶的终浓度分别为0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、50、60、70、80、90、100UL-1。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，其特征在于，所述步骤B中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0～10.0。
10.根据权利要求6-8任意一项所述的β-葡萄糖苷酶活性的检测方法，其特征在于，所述步骤B中，孵育的条件为：55～65℃反应85～95分钟。
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