CN109324029B - 基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于发光金纳米团簇检测三聚氰胺的方法，该方法主要体现在利用金纳米团簇测定待测样品中三聚氰胺含量，具体包括以下步骤：(a1)将三聚氰胺标准品或待测样品与金纳米团簇探针混合，分别测定其荧光强度，得到混合前后体系荧光强度的变化值；(a2)根据所述三聚氰胺标准品的混合溶液的反应前后荧光强度的变化值绘制标准曲线，将所述待测实际样品混合前后体系的荧光强度变化值代入所述标准曲线，从而得到所述待测实际样品中三聚氰胺的含量。本发明检测成本低、检测速度快，能够快速实时检测牛奶中三聚氰胺的含量，同时具有高灵敏度、简便、易行等特点。
Description
技术领域
本发明属于化工领域，具体涉及基于水溶性发光纳米金簇的荧光生物传感器快速、灵敏检测三聚氰胺的新方法。
背景技术
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物化工原料，俗称蛋白精，不能添加到食品或者用于食品加工或食品添加物。然而，它作为一种富氮的有机化合物，近年来被很多不法分子非法的添加到了乳制品和饲料中，以虚增产品蛋白质的含量。常规检测方法是凯氏定氮法，通过测定氮含量来确定蛋白质含量，不对氮的来源加以辨别。非法添加三聚氰胺对公众健康的危害、对食品行业发展的不良影响，迫切需求具有高灵敏度的三聚氰胺检测方法。
对三聚氰胺的定量测定有利于食品安全监测，传统的三聚氰胺检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、电位滴定法、酶联免疫吸附分析法等[参见：Pei X.F.,TandonA.,AlldrickA.,Giorgi L.,Huang W.,Yang R.J.,Food Policy.2011,36,412-420.]，上述方法一般需要专业的操作人员，且存在选择性低或者精确度不高的不足，难以满足实际食品监管中快速、高效、低成本的检测要求。近年发展的新方法，如纳米材料比色法、分子印迹聚合物法、荧光探针法和表面增强拉曼散射技术等[参见：Tittlemier S.A.,FoodAddit ContamA.2010,27,129-145.]，与传统方法相比，具有检出限低、灵敏度高的优势，但是操作繁琐、检测时间长，需要衍生或者昂贵的仪器。因此，寻找新的高灵敏、低成本、简便、快速的光谱检测新方法具有重要的研究意义。
发明内容
本发明是针对现有技术存在的不足，提供一种基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法，具体为一种利用水溶性发光金纳米团簇的新用途，还保护水溶性发光金纳米团簇在测定实际样品中三聚氰胺含量中的应用，满足实际使用要求。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
本发明所提供的利用谷胱甘肽功能化的发光金纳米团簇生物传感器测定待测样品中三聚氰胺含量的方法，包括如下步骤：
步骤(a1)：将三聚氰胺标准品或待测样品与金纳米团簇探针混合，同时设置与所述混合溶液相比不加三聚氰胺标准品或所述待测实际样品的空白体系，将所述实验混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得所述实验混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值；
步骤(a2)：根据步骤(a1)得到的所述三聚氰胺标准品的所述荧光强度差值绘制标准曲线，将所述待测实际样品的所述荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测实际样品中三聚氰胺的含量。
在上述方法中，步骤(a2)中，所述根据步骤(a1)得到的所述三聚氰胺标准品的荧光强度差值绘制标准曲线，是以加入所述三聚氰胺标准品前后探针的荧光强度差值除以空白反应体系的荧光强度为纵坐标，以所述三聚氰胺标准品的浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
在上述方法中，所述实验混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值为加入三聚氰胺反应后荧光强度减去所述空白体系的荧光强度。
本发明提供一种用于检测三聚氰胺的新型基于发光金纳米团簇生物传感器，所述实验反应体系具体由谷胱甘肽功能化金纳米团簇和金纳米球粒子组成，所述制备的谷胱甘肽功能化金纳米团簇具有较强的荧光信号，加入金纳米粒子荧光信号猝灭，而加入三聚氰胺后，反应体系的荧光信号显著增强，从而产生可检测的信号。
在上述方法中，所述实验中谷胱甘肽功能化的发光金纳米团簇为0.4mM，缓冲溶液为100mM pH7PBS，所述制备金纳米粒子实验中1％柠檬酸三钠溶液具体用量为1.75mL。
在上述方法中，三聚氰胺标准品为系列浓度的三聚氰胺标准品溶液，所述三聚氰胺标准品溶液的溶剂为pH7的缓冲溶液；在本发明的一个实施例中，所述三聚氰胺标准品溶液的溶剂为100mM PBS缓冲溶液。
在上述方法中，所述实验的温度为室温15-30℃；所述反应的pH为6.5-7.5；所述反应时间为5-10分钟。在本发明的一个实施例中，所述反应的温度具体为25℃，所述反应的的pH具体为7，所述反应的时间具体为5分钟。
在本发明的一个实施例中，所述反应的液体环境为100mM PBS缓冲溶液。
在上述方法中，所述待测实际样品为用三聚氰胺标准品配制的溶液，具体为将三聚氰胺标准品溶于100mM PBS缓冲溶液中得到的溶液。
含有所述待测样品的所述实验反应体系的组成具体如下：金纳米团簇终浓度为0.15mM，金纳米球粒子终浓度为0.4mM，所述待测样品，缓冲溶液为100mM pH7PBS。
在上述应用或方法中，所述金纳米团簇的保护基团为生物小分子物质(如谷胱甘肽)。
在以上个应用和各方法中，所述生物小分子物质均为谷胱甘肽。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述金纳米团簇是按照包括如下步骤的方法合成得到：将10mL 5mM的谷胱甘肽在室温条件下边磁力搅拌边加入到10mL 2.5mM的四氯金酸水溶液中混合均匀，在日光下搅拌反应4天，得到浅黄色溶液，去除杂质，最终得到所述谷胱甘肽功能化金纳米团簇。
在上述各方法中，所述荧光强度均是在激发波长380nm，检测波长572nm，入射狭缝10纳米，出射狭缝10纳米的条件下得到的。
本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：
(1)本发明的检测方法具有高灵敏度、简便、易行等特性。
(2)该检测方法可以推广到奶制品等食品中三聚氰胺含量的测定。
(3)该方法的建立可以为食品安全快速现场监测提供新思路。
附图说明
图1为实施例1中制备的谷胱甘肽功能化金纳米团簇的激发光谱和发射光谱；
图2为实施例1中制备的谷胱甘肽功能化金纳米团簇的高分辨率透射电镜；
图3为实施例2中加入不同浓度三聚氰胺后金纳米团簇生物传感器的荧光光谱；
图4为利用金纳米团簇生物传感器检测三聚氰胺的浓度与荧光强度变化值的关系(标准曲线)。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。
实施例1：谷胱甘肽功能化的金纳米团簇的制备及表征
一、谷胱甘肽功能化的金纳米团簇的制备
将10mL 5mM的谷胱甘肽在室温条件下边磁力搅拌边加入到10mL2.5mM的四氯金酸水溶液中混合均匀，在日光下搅拌反应4天，得到浅黄色溶液；用离心机去除较大颗粒，15000转/分钟离心20分钟，收集上清液，用去离子水透析24-48小时，去除杂质，最终得到谷胱甘肽功能化金纳米团簇，在4℃保存备用。
二、谷胱甘肽功能化的金纳米团簇的表征
用荧光光谱仪(JASCO FP-6500)测定步骤一制备得到的谷胱甘肽功能化金纳米团簇的激发光谱和发射光谱。测定结果如图1，由图可知：步骤一制备得到的谷胱甘肽功能化的金纳米团簇的最大发射峰在572nm，且荧光发射较强，这说明步骤一制备得到的是超小粒径的发光金纳米簇。
用红外光谱仪(Tensor 27)测定步骤一制备得到的谷胱甘肽功能化金纳米团簇的紫外-可见吸收光谱图；步骤一制备得到的谷胱甘肽功能化的金纳米团簇S-H键的振动峰消失。
用高分辨率透射电镜(JEM-2100)测定步骤一制备得到的谷胱甘肽功能化金纳米团簇的形貌和粒径；测定结果如图2所示，由图可知：步骤一制备得到的谷胱甘肽功能化的金纳米团簇呈现球形的分布，且分布均匀，粒径均一，平均粒径在2.1±0.4nm。
三、金纳米粒子的制备及表征
取50mL四氯金酸(HAuCl4)溶液加热到100℃，边磁力搅拌边加入1.75mL 1％柠檬酸三钠溶液，搅拌15min，溶液颜色从无色变为酒红色，自然冷却至室温，用12000转/分钟离心5分钟，弃上清液，取下层溶液，加入15mL超纯水重新分散，将溶液在4℃的条件下保存备用，用紫外-可见吸收光谱仪测定步骤三制备得到的金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱，最大紫外-可见吸收峰在520nm，平均粒径在16±0.6nm，金纳米粒子溶液的浓度为2.0mM(以金原子的数量计算)。
实施例2：发光金纳米团簇用于测定待测样品中三聚氰胺含量
本实施例将详述如何利用实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化纳米金团簇检测三聚氰胺含量的过程。
1、将实施例1制备得到谷胱甘肽功能化的纳米金团簇溶于100mM pH7的PBS缓冲溶液，得到溶液I；溶液I中，实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化的纳米金团簇的浓度为0.4mM(以谷胱甘肽含量计)。
2、加入实施例一制备得到的金纳米粒子，取10μL系列浓度的三聚氰胺标准品(溶于100mM pH 7的PBS缓冲溶液)分别加入到预先制备的溶液I中，混匀反应5分钟，加入四通比色皿中，用荧光光谱仪在室温下测定反应混合物的荧光强度，激发波长为380nm，检测波长为572nm，入射狭缝10nm，出射狭缝10nm，实验重复3次，结果取平均值。
3、结果显示，实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化金纳米团簇加入金纳米粒子，由于能量转移荧光强度明显下降；而加入三聚氰胺后，三聚氰胺结合在金纳米团簇表面，金纳米团簇的荧光恢复，反应体系的荧光信号出现显著增强；随着三聚氰胺浓度的增加，反应体系的荧光强度随之增强，测定结果如图3，并在一定范围内呈现线性关系，详见图4。
实施例3：发光金纳米团簇在测定实际样品中三聚氰胺含量的应用
一、标准曲线的绘制
1、将实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化金纳米团簇溶于100mM pH7的PBS缓冲溶液，得到溶液I；溶液I中，实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化的金纳米团簇的浓度为0.4mM(以谷胱甘肽含量计)。
2、加入实施例1制备得到的金纳米粒子，取10μL系列浓度的三聚氰胺标准品(溶于100mM pH 7PBS缓冲溶液)分别加入到预先制备的溶液I中，混匀反应5分钟，加入四通比色皿中，用荧光光谱仪测定反应混合物的荧光强度，同时测定不加入三聚氰胺标准品的空白反应体系的荧光强度，激发波长为380nm，检测波长为572nm，入射狭缝10nm，出射狭缝10nm。实验重复3次，结果取平均值。
3、以反应混合物荧光强度的变化值(反应后混合物溶液荧光强度减去空白反应体系的荧光强度)除以空白反应体系的荧光强度为纵坐标，以三聚氰胺标准品在反应体系中的终浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
4、结果显示，反应体系荧光强度的变化值与三聚氰胺浓度成正比，两者具有良好的线性关系，其线性方程为：Y＝0.04948+0.0339X(R2＝0.9971)。
5、检测限的测定，当三聚氰胺浓度在5-50μg/L时，本方法呈现良好的线性，检测限为1μg/L(S/N＝3)；可见，利用实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化的金纳米团簇在检测三聚氰胺的含量具有较高的灵敏度，重复测定25μg/L的三聚氰胺，相对标准偏差为1.4％，表明本方法具有良好的重复性。
二、实际样品中三聚氰胺含量的测定
实际样品：在2mL牛奶样品中加入1mL10％三氯乙酸，超声提取20分钟，15000转/分钟离心7分钟，取上清液以0.22μm膜过滤，用NaOH溶液调至pH为7，采用本法进行检测。
1、将实施例1制备得到谷胱甘肽功能化的纳米金团簇溶于100mM pH7PBS缓冲溶液，得到溶液I；溶液I中，实施例1制备得到的谷胱甘肽功能化的纳米金团簇的浓度为0.4mM(以谷胱甘肽含量计)。
2、加入实施例1制备得到的AuNPs，将10μL实际样品(溶于100mM pH 7PBS缓冲溶液)加入到预先制备的溶液I中，混匀反应5分钟，加入四通比色皿中，用荧光光谱仪在室温下测定反应混合物的荧光强度，同时测定不加入待测样品的空白反应体系的荧光强度，激发波长为380nm，检测波长为572nm，入射狭缝10nm，出射狭缝10nm；实验重复3次，结果取平均值。
3、将步骤2所得反应物的荧光强度变化值(反应后反应混合物荧光强度减去空白反应体系的荧光强度)带入步骤一得到的标准曲线方程中，通过计算得到待测实际样品中三聚氰胺的含量；结果表明，牛奶样品中未检测出三聚氰胺，加标回收实验结果见表1；样品的加标回收率在96.4％～104.3％之间，表明本方法具有良好的可靠性和准确性，可用于实际样品中三聚氰胺的检测，结果见表1。
表1牛奶样品的检测结果
以上内容是结合具体的实施例对本发明所作的详细说明，不能认定本发明具体实施仅限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明保护的范围。
Claims (5)
1.基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法，其特征在于：在谷胱甘肽功能化金纳米团簇中加入金纳米粒子组成实验反应体系，实验反应体系由于能量转移荧光强度明显下降，而在实验反应体系中加入三聚氰胺后，金纳米团簇的荧光恢复，反应体系的荧光信号出现显著增强；
包括如下步骤：
步骤（a1）：金纳米粒子、金纳米团簇混合后再与三聚氰胺标准品或待测样品混合形成实验混合溶液，温度为15-30℃；反应的pH为6.5-7.5；反应时间为5-10分钟；同时设置与所述实验混合溶液相比不加三聚氰胺标准品或所述待测实际样品的空白体系，将所述实验混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得所述实验混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值；
步骤（a2）：根据步骤(a1)得到的所述三聚氰胺标准品的所述荧光强度差值绘制标准曲线，将所述待测实际样品的所述荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测实际样品中三聚氰胺的含量；
上述所述三聚氰胺标准品溶液的溶剂为100mM pH7的PBS缓冲溶液。
2.根据权利要求1中所述基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法，其特征在于：含有所述待测样品的所述实验反应体系的组成具体如下：金纳米团簇终浓度与金纳米粒子终浓度的配比为0.15mM：0.4mM。
3.根据权利要求1中所述基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法，其特征在于：所述荧光强度均是在激发波长380nm，检测波长572nm，入射狭缝10nm，出射狭缝10nm的条件下得到。
4.根据权利要求1中所述基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法，其特征在于：所述谷胱甘肽功能化的发光金纳米团簇粒径为2.1 nm，所述金纳米粒子的粒径为16 nm。
5.根据权利要求4所述基于谷胱甘肽功能化的金纳米团簇探针检测三聚氰胺浓度的方法，其特征在于：其中，还包括金纳米团簇的制备方法，所述金纳米团簇是按照如下方法合成得到：将10 mL 5 mM的谷胱甘肽在室温条件下边磁力搅拌边加入到10 mL 2.5 mM的四氯金酸水溶液中混合均匀，在日光下搅拌反应4天，得到浅黄色溶液，去除杂质，最终得所述谷胱甘肽功能化金纳米团簇。
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