CN112082984A - 适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，该方法包括以下步骤：1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H2O2的检测液；2)对牛奶样品进行前处理；3)将前处理后的牛奶样品与步骤1)中的检测液混合，得到混合液，根据混合液颜色的变化和/或吸光度的变化，判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。与现有技术相比，本发明利用核酸适配体修饰纳米金催化四甲基联苯胺/双氧水迅速变色的特性，开发出一种生物传感器比色法，通过肉眼及紫外分光光度计检测牛奶中三聚氰胺，本发明操作简便，前处理简单，不需要大型仪器，灵敏度高，可用于牛奶中三聚氰胺的检测。
Description
技术领域
本发明属于牛奶中三聚氰胺检测技术领域，涉及一种利用核酸适配体修饰的纳米金颗粒催化TMB/H2O2，通过肉眼/紫外吸收光谱检测牛奶中三聚氰胺的方法。
背景技术
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂塑料，其在300℃加热升华，急剧受热分解，可能产生毒性很大的氰化物。三聚氰胺显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。其含氮量高达66.6％，且它是一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，若在100g牛奶中添加0.1g三聚氰胺，就能提高0.4％的蛋白质虚假含量，有“蛋白精”之名。
三聚氰胺本身毒性较小，但在酸或碱的作用下，或在哺乳动物体内及细菌中，可经连续的去氨水解作用，被分解为三聚氰胺二酰胺(ammeline)、三聚氰胺一酰胺(ammelide)及三聚氰酸(cyanuric acid)等代谢物。其中，三聚氰酸与三聚氰胺通过分子间氢键相互作用，会形成不溶于水的网状缔合大分子复合物，造成严重的肾结石。
三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到乳制品中的。目前，三聚氰胺在乳制品中的管理值如下：
1.婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，高于1mg/kg的产品一律不得销售；
2.液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售；
3.含乳15％以上的其他食用产品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售。
目前，针对三聚氰胺检测主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。此外，酶联免疫吸附法、毛细管电泳、质谱、红外吸收光谱、化学发光以及电化学的方法也有文献报道，但这些方法一般需要进行复杂的样品前处理，仪器价格昂贵，检测成本高，且方法操作复杂，需要经过专门训练的人员才能操作，不能完全满足对牛奶中三聚氰胺残留快速筛查的检测需要。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种利用核酸适配体包裹的纳米金颗粒催化TMB/H2O2迅速变色所产生的溶液颜色变化，来检测牛奶中三聚氰胺(Mel)的方法。其中，核酸适配体(Apt)通过共价键作用包裹纳米金(AuNPs)颗粒，可以模拟过氧化物酶的催化活性催化四甲基联苯胺/双氧水(TMB/H2O2)发生显色反应，形成稳定检测液。本发明方法具有高灵敏度、选择性好、低成本等优势。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H2O2的检测液；
2)对牛奶样品进行前处理；
3)将前处理后的牛奶样品与步骤1)中的检测液混合，得到混合液，根据混合液颜色的变化和/或吸光度的变化，判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。
步骤1)中，所述的纳米金颗粒的粒径为5-10nm，所述的核酸适配体的序列为5’-GGTTTGGTTGGTTTGGTT-3’。
进一步地，步骤1)中，所述的检测液的制备方法为：将核酸适配体溶液、纳米金颗粒溶液混合后，在30℃下反应30min，得到核酸适配体包裹的纳米金颗粒，之后加入TMB溶液、H2O2溶液并充分混合均匀。
进一步地，所述的核酸适配体溶液的浓度为50nmol/L，所述的TMB溶液的浓度为160nmol/L，所述的H2O2溶液的浓度为300nmol/L。
进一步地，步骤2)中，牛奶样品的前处理：将1ml牛奶样品与5ml 1wt％三氯乙酸混合后静置5min，之后在10000r/min下离心10min并取上清液，再用NaOH调节pH至8.0。
进一步地，步骤3)中，利用紫外分光光度计测定混合液的吸光度，并根据三聚氰胺标准曲线得到牛奶样品中三聚氰胺含量。
进一步地，所述的三聚氰胺标准曲线的绘制过程为：
3-1)将不同浓度的三聚氰胺标准液分别加入至多个容器中，并在每个容器中加入步骤1)中的检测液，混合均匀后反应15min；
3-2)利用紫外分光光度计分别测定步骤3-1)中各溶液在650nm处的吸光度值，得到A650；
3-3)以不同浓度的三聚氰胺与相应的A650作图，绘制出三聚氰胺标准曲线。
进一步地，根据混合液的A650，在三聚氰胺标准曲线上查得牛奶样品中三聚氰胺含量。
或者，步骤3)中，将混合液置于96孔板中，根据混合液颜色的变化判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。
进一步地，所述的牛奶中，三聚氰胺的含量为0-0.7ppm。
核酸适配体是通过指数富集配体系统体外进化(SELEX)技术，从大量寡聚核苷酸库中筛选出对靶物质具有高特异性和高结核性的核酸片段。与蛋白质类抗体和生物酶相比，核酸适配体具有更高的亲和力、稳定性和特异性，且易于标记设计出传感器，可用于核酸、蛋白、无机金属离子及病毒颗粒和细胞的检测。本发明利用可与三聚氰胺通过氢键结合的适配体包裹AuNPs，能够催化TMB/H2O2迅速变色的特征，开发出一种生物传感器比色法，并通过肉眼和/或紫外分光光度计检测牛奶中三聚氰胺的含量。
本发明的原理为：适配体修饰的AuNPs颗粒可以模拟过氧化物酶的催化活性，催化TMB/H2O2发生显色反应。TMB含有两个苯环结构，在紫外光285nm处有一个最大吸收值，在可见光范围内是无色透明溶液。当TMB被催化氧化后，其二苯氨基上的N原子失去一个电子形成阳离子基后，此时TMB带有正电，在可见光370nm和650nm处分别有一个强的吸收峰，此时溶液由无色变为蓝色；当催化氧化反应进一步増强后，TMB分子中的两个氨基N上个失去一个电子，形成二亚胺结构，溶液由蓝色变为黄色，此时在450nm处有强吸收峰。在存在H2O2条件下，AuNPs可催化H2O2形成·OH和·OOH等自由基，它们具有很强的夺电子能力，可夺取TMB氨基N上的H原子，从而使反应溶液由无色变为淡蓝色。适配体包裹的AuNPs颗粒催化TMB/H2O2反应能力增强，溶液颜色也由浅蓝色变为深蓝色；而当体系中含有三聚氰胺时，适配体首先与三聚氰胺发生特异性反应，此时处于自由状态的AuNPs催化能力较弱，溶液颜色变浅，且溶液颜色随着三聚氰胺浓度的增加逐渐减弱。
与现有技术相比，本发明提供了一种利用核酸适配体修饰纳米金(AuNPs)催化四甲基联苯胺/双氧水(TMB/H2O2)迅速变色的特性，开发出一种生物传感器比色法，通过肉眼及紫外分光光度计检测牛奶中三聚氰胺。其中，核酸适配体修饰的AuNPs颗粒具有显著的催化活性，可催化TMB/H2O2显深蓝色，且在650nm处有最大吸光值；但当反应体系存在三聚氰胺时，适配体首先与三聚氰胺发生特异性反应，此时处于自由状态的AuNPs催化能力较弱，溶液颜色变浅，且溶液颜色随着三聚氰胺的增加逐渐减弱，溶液在650nm处的吸光值的变化与体系中三聚氰胺的浓度在一定范围内呈线性关系，因此可用于三聚氰胺的检测。在最优检测条件下，对三聚氰胺的检测线性范围为0-0.7ppm，线性相关系数为0.9967，线性回归方程为y＝-0.6579x+0.8059。本发明操作简便，前处理简单，不需要大型仪器，灵敏度高，可用于牛奶中三聚氰胺的检测。
附图说明
图1为本发明检测三聚氰胺的原理示意图；
图2为本发明中核酸适配体浓度对检测体系的影响；
图3为本发明中TMB浓度对检测体系的影响；
图4为本发明中H2O2浓度对检测体系的影响；
图5为本发明中三聚氰胺浓度与吸光度比值的关系(即标准曲线)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
如图1所示，核酸适配体修饰的纳米金颗粒快速检测牛奶中三聚氰胺的方法，包括以下步骤：
(1)制备检测液：制备粒径为5nm的纳米金颗粒，核酸适配体的序列为5’-GGTTTGGTTGGTTTGGTT-3’。检测液制备方法为：在5mL的离心管里，分别加入0.1mL 50nM的适配体、0.8mL 33.9ug/mL的AuNPs溶液，转移到恒温水浴箱30℃下恒温30分钟，取出离心管，分别加入2.2ml蒸馏水、100μl 30％H2O2、200μl 160nM TMB溶液充分震荡摇晃15min后，得到检测液。
(2)牛奶样品的前处理：将1ml牛奶样品与5ml 1wt％三氯乙酸混合后静置5min，之后在10000r/min下离心10min并取上清液，再用NaOH调节pH至8.0。
(3)制备已知三聚氰胺浓度的检测体系：取10支包含检测液的离心管，分别加入前处理后的不同浓度三聚氰胺标准液，使得整个检测体系中三聚氰胺含量维持在0-1.0ppm，反应15min后测定。
(4)取200μL制备的标准溶液，置于96孔板板孔中，记录颜色变化后，用紫外分光光度计分别测定其在650nm处的吸光值A650。
(5)以不同浓度三聚氰胺对应的A650作图，绘制标准曲线(如图5所示)。
(6)制备样品待测体系：牛奶样品进行前处理后，与检测液混合，充分混匀后反应15min，按步骤(4)测定其A650。
(7)根据牛奶样品所得A650，查标准曲线，可以求得牛奶样品中三聚氰胺含量。
验证：用本发明方法测定四份含三聚氰胺浓度分别为0.1ppm、0.2ppm、0.5ppm、1.0ppm的牛奶，得到的回收率为90～120％，证明了本方法的可靠性。本发明方法测定牛奶中三聚氰胺的最低检测限为0.1μM(2.6ppb)。
实施例2：
对实施例1中的检测工艺进一步优化如下：
(1)核酸适配体浓度对检测体系的影响：配置8μM三聚氰胺溶液，与0～100nM系列浓度的核酸适配体混合，在650nm波长下进行吸光度测定，通过A650以确定最适核酸适配体浓度，结果如图2所示。
(2)TMB浓度对检测体系的影响：配置8μM的三聚氰胺溶液，与40～220nM系列浓度的TMB溶液混合，在650nm波长下进行吸光度测定，通过A650以确定最适TMB浓度，结果如图3所示。
(3)H2O2浓度对检测体系的影响：配置8μM的三聚氰胺溶液，与60～600nM系列浓度的H2O2溶液混合，在650nm波长下进行吸光度测定，通过A650以确定最适H2O2浓度，结果如图4所示。
可以看出，核酸适配体溶液的最佳浓度为50nmol/L，TMB溶液的最佳浓度为160nmol/L，H2O2溶液的最佳浓度为300nmol/L。
实施例3：
适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H2O2的检测液；
2)对牛奶样品进行前处理；
3)将前处理后的牛奶样品与步骤1)中的检测液混合，得到混合液，根据混合液吸光度的变化，判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。
步骤1)中，所述的纳米金颗粒的粒径为5nm，所述的核酸适配体的序列为5’-GGTTTGGTTGGTTTGGTT-3’。
检测液的制备方法为：将核酸适配体溶液、纳米金颗粒溶液混合后，在30℃下反应30min，得到核酸适配体包裹的纳米金颗粒，之后加入TMB溶液、H2O2溶液并充分混合均匀。核酸适配体溶液的浓度为50nmol/L，TMB溶液的浓度为160nmol/L，H2O2溶液的浓度为300nmol/L。
步骤2)中，牛奶样品的前处理：将1ml牛奶样品与5ml 1wt％三氯乙酸混合后静置5min，之后在10000r/min下离心10min并取上清液，再用NaOH调节pH至8.0。
步骤3)中，利用紫外分光光度计测定混合液的吸光度，并根据三聚氰胺标准曲线得到牛奶样品中三聚氰胺含量。三聚氰胺标准曲线的绘制过程为：
3-1)将不同浓度的三聚氰胺标准液分别加入至多个容器中，并在每个容器中加入步骤1)中的检测液，混合均匀后反应10min；
3-2)利用紫外分光光度计分别测定步骤3-1)中各溶液在650nm处的吸光度值，得到A650；
3-3)以不同浓度的三聚氰胺与相应的A650作图，绘制出三聚氰胺标准曲线。
根据混合液的A650，在三聚氰胺标准曲线上查得牛奶样品中三聚氰胺含量。
牛奶中，三聚氰胺的含量为0-0.7ppm。
实施例4：
本实施例与实施例3的区别为，步骤3)中，将混合液置于96孔板中，根据混合液颜色的变化判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H2O2的检测液；
2)对牛奶样品进行前处理；
3)将前处理后的牛奶样品与步骤1)中的检测液混合，得到混合液，根据混合液颜色的变化和/或吸光度的变化，判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。
2.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的纳米金颗粒的粒径为5-10nm，所述的核酸适配体的序列为5’-GGTTTGGTTGGTTTGGTT-3’。
3.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的检测液的制备方法为：将核酸适配体溶液、纳米金颗粒溶液混合后，在30℃下反应30min，得到核酸适配体包裹的纳米金颗粒，之后加入TMB溶液、H2O2溶液并充分混合均匀。
4.根据权利要求3所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，用浓度为50nmol/L的核酸适配体溶液、浓度为160nmol/L TMB溶液、浓度为300nmol/L的H2O2溶液配制检测液。
5.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，步骤2)中，牛奶样品的前处理过程为：将1ml牛奶样品与5ml 1wt％三氯乙酸混合后静置5min，之后在10000r/min下离心10min并取上清液，再用NaOH调节pH至8.0。
6.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，步骤3)中，利用紫外分光光度计测定混合液的吸光度，并根据三聚氰胺标准曲线得到牛奶样品中三聚氰胺含量。
7.根据权利要求6所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的三聚氰胺标准曲线的绘制过程为：
3-1)将不同浓度的三聚氰胺标准液分别加入至多个容器中，并在每个容器中加入步骤1)中的检测液，混合均匀后反应15min；
3-2)利用紫外分光光度计分别测定步骤3-1)中各溶液在650nm处的吸光度值，得到A650；
3-3)以不同浓度的三聚氰胺与相应的A650作图，绘制出三聚氰胺标准曲线。
8.根据权利要求7所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，根据混合液的A650，在三聚氰胺标准曲线上查得牛奶样品中三聚氰胺含量。
9.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，步骤3)中，将混合液置于96孔板中，根据混合液颜色的变化判断牛奶样品中三聚氰胺的含量。
10.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的牛奶中，三聚氰胺的含量为0-0.7ppm。
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