CN104730016A - 一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，属于分析化学技术领域，其特征在于利用核酸适配体与金纳米粒子发生团聚作用检测食品中三聚氰胺的残留量，包括以下步骤：金纳米粒子(CS-AuNPs)的制备；通过测定紫外吸收光谱确定核酸适配体与金纳米粒子的作用原理；通过测定吸光度观察核酸适配体、金纳米粒子和三聚氰胺体系的反应；运用核酸适配体与金纳米粒子的正负电吸引作用方法检测三聚氰胺并进行实际样品的检测。
Description
技术领域
一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
三聚氰胺(C3H3N6)是一种重要的氮杂环有机化工原料，其含氮量高达66％，常被人为添加到牛奶、奶粉以及动物饲料中以虚增蛋白质含量。其机构如下：
三聚氰胺是一种广泛应用的基本有机化工中间产品，常与甲醛缩合成各种三聚氰胺甲醛树脂塑料，包括白板，厨具，商业过滤器等。三聚氰胺的氮含量极高，赋予了蛋白质分子的分析特性，食品中的氮主要存在于氨基酸分子和蛋白质分子中，之所以将三聚氰胺作为掺假原料，是因为食品和食品配料中蛋白质的含量检测采用的凯氏定氮方法是通过量化氮的含量进而计算蛋白质的含量，却忽略了高氮含量存在于许多类似三聚氰胺的非蛋白质分子中。三聚氰胺不是食品添加剂，它不能在体内代谢，过多的摄入会引起肾结石。因此，严禁在奶制品和其它食品中使用三聚氰胺。我国政府规定，三聚氰胺在婴幼儿奶粉和其它食品中的最大允许残留量分别为1.0和2.5mg/kg。
目前，三聚氰胺的检测手段主要包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳(CE)、拉曼光谱法、离子色谱法(IC)、酶联免疫法(ELISA)等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测食品中的三聚氰胺。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体和金纳米粒子(CS-AuNPs)检测三聚氰胺的方法，以快速、简单、灵敏的检测牛奶中三聚氰胺的残留量。
技术问题：一种基于核酸适配体和金纳米粒子(CS-AuNPs)检测牛奶中的三聚氰胺的方法的方法基于以下原理：
半胱氨酸修饰的金纳米粒子(CS-AuNPs)的最大吸收波长在528nm，在溶液中呈现酒红色的状态。带正电的金纳米粒子(CS-AuNPs)与正电的三聚氰胺不会发生反应，两者混合后不会引起金纳米粒子(CS-AuNPs)的状态发生变化，金纳米粒子(CS-AuNPs)的颜色也不会发生变化。而核酸适配体带有负电，带正电的金纳米粒子(CS-AuNPs)和核酸适配体之间可通静电作用，将两者间的距离拉近，使金纳米粒子(CS-AuNPs)发生团聚，团聚后的金纳米粒子(CS-AuNPs)颜色会发生变化，从酒红色变成蓝色。
在三聚氰胺中添加金纳米粒子(CS-AuNPs)和核酸适配体后，，三聚氰胺与核酸适配体发生特异性识别，这种特异性结合作用力强于金纳米粒子和核酸适配体的静电作用，因此金纳米粒子不再与核酸适配体结合，从而使金纳米粒子不再团聚，金纳米粒子的颜色保持酒红色。
本发明的技术方案：
包括以下步骤：CS-AuNPs的制备；分别对AuNPs，AuNPs和核酸适配体以及三聚氰胺进行透射电镜表征；通过测定紫外分光光度计确定核酸适配体与金纳米粒子的作用原理；通过紫外吸收光谱图观察核酸适配体、金纳米粒子和三聚氰胺体系的反应；基于金纳米粒子的形态变化原理利用核酸适配体和金纳米粒子(CS-AuNPs)快速检测牛奶中三聚氰胺。
(1)金纳米粒子(CS-AuNPs)的制备
所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的100mL的三口烧瓶中加入50mL 1.4mM的氯金酸和500μL 0.213M的半胱胺盐酸盐，室温下暗处搅拌20min。在不断搅拌的情况下，紧接着快速加入12.5μL新制备的10mM的硼氢化钠，继续搅拌30min。最后形成的酒红色的溶液，用0.45μm的微孔膜过滤，置于4℃保藏，所制得的金纳米粒子粒径为40nm。
(2)通过测定圆二光谱确定三聚氰胺与核酸适配体的作用原理的步骤如下：
取两个洁净的2.0mL的离心管a,b，在两管中分别加入200μL核酸适配体，再在b管中加入200μL的三聚氰胺和200μL核酸适配体；a管中只有三聚氰胺的核酸适配体；b管中为含有三聚氰胺和核酸适配体的混合体系，然后分别测定其圆二吸收光谱并观察吸收光谱的变化。
(3)通过测定金纳米粒子与三聚氰胺之间的作用步骤如下：
取两个1.5mL的离心管，编号为a,b，分别依次加入，a管(金纳米粒子80μL,420μL娃哈哈纯净水)，b管(金纳米粒子80μL，三聚氰胺80μL，340μL娃哈哈纯净水)，然后分别测定其紫外吸收光谱并观察吸收光谱的变化。
(4)通过测定金纳米粒子与核酸适配体之间的作用步骤如下：
取两个1.5mL的离心管，编号为a,b，分别依次加入，a管(金纳米粒子80μL,420μL娃哈哈纯净水)，b管(金纳米粒子80μL，核酸适配体65μL，355μL娃哈哈纯净水)，然后分别测定其紫外吸收光谱并观察吸收光谱的变化。
(5)通过测定紫外吸收光谱观察核酸适配体、金纳米粒子和三聚氰胺的反应的步骤如下：
取四个1.5mL的离心管，编号为a,b,c,d，分别依次加入，a管(金纳米粒子80μL,420μL娃哈哈纯净水)，b管(金纳米粒子80μL，三聚氰胺80μL，340μL娃哈哈纯净水)，c管(金纳米粒子80μL，核酸适配体65μL，355μL娃哈哈纯净水)，d管(金纳米粒子80μL，核酸适配体65μL，三聚氰胺80μL，275μL娃哈哈纯净水)，然后将混合物在室温下反应7min，观察颜色变化并捡测紫外吸收光谱。根据[(F0-F)/F0]与三聚氰胺的浓度建立工作曲线。所用三聚氰胺标准品浓度依次为：0，0.02，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0μg/mL。本发明中，三聚氰胺的检出限3.54nM，线性范围为1-24nM。
(6)实际样品检测：取牛奶进行实际样品检测。
称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液(3.2.8)和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。在样品加标回收试验中，在处理过的牛奶样品中，加入已知浓度的三聚氰胺标准品，并进行预处理；其处理方法与实际样品检测中的前处理方法一致。
本发明的有益效果：本发明制备了金纳米粒子CS-AuNPs，并建立了一种基于核酸适配体和金纳米粒子(CS-AuNPs)，通过改变金纳米粒子的状态可简单、快速、灵敏检测牛奶中三聚氰胺的方法，为今后的监管提供了方便。
附图说明
图1透射电镜图：金纳米粒子；
图2透射电镜图：核酸适配体与金纳米粒子的混合体系；
图3投射电镜图：核酸适配体、金纳米粒子及三聚氰胺混合体系
图4不同体系的紫外吸收光谱图：
(a)AuNPs,(b)AuNPs-Melamine,(c)AuNPs-aptamer-Melamine,(d)AuNPs-aptamer
图5含有不同浓度的三聚氰胺(1,3,6,9,12,15,18,21,24nM)的核酸适配体和金纳米粒子体系的紫外吸收光谱图；三聚氰胺的标准曲线图。
具体实施方式
金纳米粒子CS-AuNPs的制备
材料/试剂：氯金酸和柠檬酸三钠购自北京化工厂。
方法：所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的100mL的三口烧瓶中加入50mL 1.4mM的氯金酸和500μL 0.213M的半胱胺盐酸盐，室温下暗处搅拌20min。在不断搅拌的情况下，紧接着快速加入12.5μL新制备的10mM的硼氢化钠，继续搅拌30min。最后形成的酒红色的溶液，用0.45μm的微孔膜过滤，置于4℃保藏。
结果：经透射电镜表征，所制得的金纳米粒子粒径为40nm，且分散性良好，粒径均匀。
核酸适配体和三聚氰胺发生特异性结合，通过测定体系的圆二吸收光谱，观察核酸适配体与三聚氰胺的作用原理。
材料/试剂：核酸适配体；三聚氰胺
取两个洁净的1.5mL的离心管a,b，在两管中分别加入200μL核酸适配体，再在b管中加入200μL的三聚氰胺和200μL核酸适配体混合体系；a管中只有三聚氰胺的核酸适配体；b管中为含有三聚氰胺和核酸适配体的混合体系，充分反应后，分别测定其圆二吸收光谱并观察吸收光谱的变化。。
结果：通过观察圆二光谱的变化发现，三聚氰胺与核酸适配体混合体系的圆二吸收峰明显低于核酸适配体的吸收峰，由此说明了，三聚氰胺和核酸适配体之间发生了特异性反应，这种特异性反应使核酸适配体形成了发夹结构。
用该方法进行三聚氰胺检测
材料/试剂：核酸适配体；40nm的金纳米粒子；三聚氰胺标准品购自Sigma-Aldrich；新鲜牛奶购自于当地市场。
方法：
(1)通过三聚氰胺、核酸适配体与金纳米粒子混合体系改变金纳米粒子的状态方法检测三聚氰胺：向含有80μL 40nm金纳米粒子和0.5mL水的体系中，分别加入核酸适配体溶液65μL，室温反应7min后，最后在体系中加入不同浓度80μL的三聚氰胺标准溶液，金纳米粒子的团聚程度将随着三聚氰胺标准溶液浓度的不同而不同.
(2)所用三聚氰胺标准品浓度依次为：0，0.02，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0μg/mL，根据[(F0-F)/F0]与三聚氰胺的浓度建立标准曲线。
(3)实际样品检测：取新鲜牛奶进行实际样品检测。
称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液(3.2.8)和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。在样品加标回收试验中，在处理过的牛奶样品中，加入已知浓度的三聚氰胺标准品，并进行预处理；其处理方法与实际样品检测中的前处理方法一致；根据[(F0-F)/F0]与三聚氰胺的浓度建立工作曲线。草甘膦的检出限为3.54nM，线性范围为1-24nM
结果：根据三聚氰胺的浓度建立工作曲线。三聚氰胺的检出限为3.54nM，线性范围为1-24nM，加标回收试验结果见下表。
Claims (7)
1.一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其特征在于利用核酸适配体与金纳米粒子发生团聚作用检测食品中三聚氰胺的残留量，包括以下步骤：金纳米粒子(CS-AuNPs)的制备；通过测定紫外吸收光谱确定核酸适配体与金纳米粒子的作用原理；通过测定吸光度观察核酸适配体、金纳米粒子和三聚氰胺体系的反应；运用核酸适配体与金纳米粒子的正负电吸引作用方法检测三聚氰胺并进行实际样品的检测。
2.如权利要求1所述的一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其中所述金纳米粒子(CS-AuNPs)的制备和透射电镜表征步骤如下：
所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的100mL的三口烧瓶中加入50mL 1.4mM的氯金酸和500μL 0.213M的半胱胺盐酸盐，室温下暗处搅拌20min；在不断搅拌的情况下，紧接着快速加入12.5μL新制备的10mM的硼氢化钠，继续搅拌30min；最后形成的酒红色的溶液，用0.45μm的微孔膜过滤，置于4℃保藏，所制得的金纳米粒子粒径为40nm；
①样品制备
吸取40nm金纳米粒子200μL，娃哈哈纯净水1800μL于2mL离心管中，作为对照；另一离心管中分别吸取40nm金纳米粒子200μL，娃哈哈纯净水1600μL和5.0μg/mL的三聚氰胺200μL，在25℃下同时培养15min；将两种样品分别滴于两个铜网上，室温晾干备用；
②参数
用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
3.如权利要求1所述的一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其中所述通过测定圆二光谱确定三聚氰胺与核酸适配体的作用原理的步骤如下：
取两个洁净的1.5mL的离心管a,b，在两管中分别加入200μL核酸适配体，再在b管中加入200μL的三聚氰胺和200μL核酸适配体；a管中只有三聚氰胺的核酸适配体；b管中为含有三聚氰胺和核酸适配体的混合体系，然后分别测定其圆二吸收光谱并观察吸收光谱的变化。
4.如权利要求1所述的一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其中所述通过测定金纳米粒子与三聚氰胺之间的作用步骤如下：
取两个1.5mL的离心管，编号为a,b，分别依次加入，a管(金纳米粒子80μL,420μL娃哈哈纯净水)，b管(金纳米粒子80μL，三聚氰胺80μL，340μL娃哈哈纯净水)，然后分别测定其紫外吸收光谱并观察吸收光谱的变化。
5.如权利要求1所述的一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其中所述通过测定金纳米粒子与核酸适配体之间的作用步骤如下：
取两个1.5mL的离心管，编号为a,b，分别依次加入，a管(金纳米粒子80μL,420μL娃哈哈纯净水)，b管(金纳米粒子80μL，核酸适配体65μL，355μL娃哈哈纯净水)，然后分别测定其紫外吸收光谱并观察吸收光谱的变化。
6.如权利要求1所述的一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其中所述通过测定紫外吸收光谱观察核酸适配体、金纳米粒子和三聚氰胺的反应的步骤如下：
取四个1.5mL的离心管，编号为a,b,c,d，分别依次加入，a管(金纳米粒子80μL,420μL娃哈哈纯净水)，b管(金纳米粒子80μL，三聚氰胺80μL，340μL娃哈哈纯净水)，c管(金纳米粒子80μL，核酸适配体65μL，355μL娃哈哈纯净水)，d管(金纳米粒子80μL，核酸适配体65μL，三聚氰胺80μL，275μL娃哈哈纯净水)，然后将混合物在室温下反应7min，观察颜色变化并捡测紫外吸收光谱。
7.如权利要求1所述的一种利用核酸适配体和金纳米粒子检测三聚氰胺的方法，其中所述实际样品的检测是取牛奶为代表进行的：
称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液(3.2.8)和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min；上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液；在样品加标回收试验中，在处理过的牛奶样品中，加入已知浓度的三聚氰胺标准品，并进行预处理；其处理方法与实际样品检测中的前处理方法一致；根据三聚氰胺的浓度建立工作曲线；三聚氰胺的检出限为3.54nM，线性范围为1-24nM。
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