CN105158182A - 基于核酸适配体的双酚a比色检测法 - Google Patents

Abstract

本发明属水环境检测技术领域，公开了一种基于核酸适配体的双酚A比色检测法；所述核酸适配体具体如SEQ？ID？No.1所示；所述比色检测法具体包括如下步骤：标准液制备、对照液制备、标准线绘制、吸光度检测；同时，本发明还提供一种所述核酸适配体的双酚A比色检测法用检测体系，所述检测体系包括标准液、对照液、样品检测液。与现有技术相比，本发明方法使用仪器简单，操作灵活方便，具有较高的灵敏度和选择性，可实现对水中双酚A实时检测。

Description

基于核酸适配体的双酚A比色检测法

技术领域

本发明关于水环境检测技术领域，涉及到基于非标记的双酚A适配体，阳离子聚合物以及纳米金颗粒比色法检测水中双酚A的方法，即一种基于核酸适配体的双酚A比色检测法。

背景技术

双酚A是世界上使用较为广泛的工业化合物之一，在塑料制品的加工过程中，添加双酚A可以使其具有无色透明、耐用、轻巧等特性；同时由于其具有一定的耐腐蚀性，因此还被广泛用于食品饮料等的包装；此外，双酚A还被用于奶瓶、水瓶、牙齿填充物、眼镜片以及其他数百种日用品的制造过程中。然而随着双酚A的广泛使用，越来越多的问题也日益暴露出来。有研究表明，双酚A属低毒性化学物，是一种弱内分泌干扰物，它可以模拟人类和动物雌激素的行为以及破坏雌激素与雌激素受体结合过程，从而导致人类及动物产生多种疾病，如使动物产生雌性早熟、精子数下降、前列腺增长等作用以及增加卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生的可能性。

传统检测双酚A的方法有气相色谱，高效液相色谱法，液相色谱-质谱联用法，气相色谱-质谱联用法。此外，电化学传感器法和免疫电化学法也用于检测环境中的双酚A，如酶联免疫分析法等。虽然这些方法具有较高的检测限和灵敏度，但是在实际操作过程中需要对样品进行复杂的前处理，如萃取、浓缩和衍生化等，同时还需要昂贵而复杂的精密仪器以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。

比色法是一种相对简便、快速的检测方法，利用基于核酸适配体、阳离子聚合物以及纳米金比色检测双酚A的方法目前还未见报道。尽管在先专利申请2015510012212.6公开了一种基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法，但是其技术方案是针对17β-雌二醇提出的，具有靶标特异性，这是基于核酸适配体的普遍性问题，所以在先申请的公开对本申请的实现没有任何的启示作用。为了克服现有技术的缺陷，本申请基于靶标特异性，优选出核酸适配体，提供一种基于核酸适配体的双酚A比色检测法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的双酚A比色检测法，特别是一种操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效地检测水中双酚A的方法。本发明方法用于检测水中的双酚A时，操作灵活简便，无需复杂的仪器设备和专业的操作人员，且具有良好的灵敏度和特异性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种双酚A比色法检测用的核酸适配体，所示核酸适配体具体如SEQIDNo.1所示。所述核酸适配体是通过selex方法筛选出，能与靶标双酚A特性性结合。

第二方面，本发明提供一种基于所述核酸适配体的双酚A比色检测法，所述比色检测法具体包括如下步骤：

标准液制备：向核酸适配体溶液中加入双酚A溶液，得浓度已知的双酚A浓度梯度溶液；向所述双酚A浓度梯度溶液加入阳离子聚合物溶液、纳米金溶液，即得比色检测用标准液；

对照液制备：向核酸适配体溶液中加入水，即得比色检测用对照液；

标准线绘制：对所述标准液、对照液的吸光度进行检测，基于所述检测所得数据绘制标准曲线；

吸光度检测：参照所述标准液制备的方法，将双酚A溶液用待测样品代替，制得样品检测液；以所述对照液为对照，对样品检测液的吸光度进行检测，将检测所得数据带入所述标准曲线，即可对比计算得出待测样品中的双酚A浓度。

优选地，标准液制备的步骤中，所述核酸适配体溶液具体指核酸适配体的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH＝8；所述核酸适配体溶液的制备具体为：在1.5mL的离心管中，加入4μL初始浓度为500nM的双酚A适配体和相应体积的pH＝8的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液放置在25℃条件下备用。

优选地，标准液制备的步骤中，所述加入双酚A溶液后，还需混匀、20～30℃恒温孵育30分钟；所述双酚A溶液的初始浓度包括25μM；所述浓度梯度包括12个浓度。

优选地，标准液制备的步骤中，所述加入阳离子聚合物溶液后，还需混匀、20～30℃恒温孵育20分钟；所述阳离子聚合物溶液中的阳离子聚合物具体为聚二烯基丙二甲基氯化铵；所述阳离子聚合物溶液的初始浓度包括500nM。

优选地，标准液制备的步骤中，所述加入纳米金溶液后，还需20～30℃恒温孵育15分钟；所述纳米金溶液的加入量为每个浓度梯度加100μL。

进一步优选地，所述恒温孵育的温度为25℃。

优选地，所述恒温孵育具体采用恒温孵育器。

优选地，对照液制备的步骤中，所述水为超纯水。

优选地，标准线绘制、吸光度检测的步骤中，所述吸光度的测定是在650nm和520nm波长条件下进行的。

优选地，标准线绘制的步骤中，所述基于所述检测所得数据绘制标准曲线具体指：标准液于650nm、520nm测得的吸光度分别为A₆₅₀、A₅₂₀，吸光度比A_双酚A＝A₆₅₀/A₅₂₀；对照液于650nm、520nm测得的吸光度分别为A_对照650、A_对照520，吸光度比A_对照＝A_{对 照650}/A_对照520，以双酚A的浓度为横坐标、A_双酚A＝A₆₅₀/A₅₂₀为纵坐标作图；在低浓度双酚A的条件下，A_双酚A与空白对照组A_对照之差ΔA进行拟合线性拟合，得到标准曲线的回归方程为ΔA＝4.05×10^-4C_双酚A+0.003。

优选地，吸光度检测的步骤中，所述检测所得数据具体指样品检测液与对照液的吸光度比差ΔA。

第三方面，本发明提供一种基于所述核酸适配体的双酚A比色检测法用检测体系，所述检测体系包括标准液、对照液、样品检测液；

所述标准液的制备具体包括：向核酸适配体溶液中加入双酚A溶液，得浓度已知的双酚A浓度梯度溶液；向所述双酚A浓度梯度溶液加入阳离子聚合物溶液、纳米金溶液，即得标准液；

所述对照液的制备具体包括：向核酸适配体溶液中加入水，即得比色检测用对照液；

所述样品检测液的制备具体包括：向核酸适配体溶液中加入阳离子聚合物溶液、纳米金溶液，即得样品检测液；向所述样品检测液中加入检测样品、以所述对照液为对照，即可进行样品检测。

本发明的原理是(如图1所示)：通过双酚A适配体与阳离子聚合物聚二烯基丙二甲基氯化铵和双酚A之间的竞争反应以及阳离子聚合物聚集纳米金的反应来构建双酚A检测体系。具体反应为当检测体系中不存在双酚A时，双酚A适配体可以与阳离子聚合物通过静电引力结合形成类似双链的结构，此时由于阳离子聚合物的正电荷被屏蔽，所以其无法破坏纳米金颗粒之间的静电平衡，纳米金不发生聚集，反应液依然为红色；而当检测体系中存在双酚A时，由于适配体与双酚A之间的结合力大于适配体与阳离子聚合物之间的结合力，所以适配体首先与双酚A发生特异性反应，此时溶液中的阳离子聚合物处于自由状态且因其带正电，而纳米金带负电，所以阳离子聚合物能够破坏纳米金颗粒之间的电荷平衡，使其发生聚集现象，颜色由酒红色变为紫色甚至是蓝色。最终反应液颜色的变化程度与双酚A浓度成正相关，即双酚A浓度越高，与双酚A特异性结合的适配体也就越多，自由状态的阳离子聚合物浓度也就越高，纳米金的聚集程度也就越大，最终导致反应液的颜色就越深，因此通过比色信号的输出，即可实现对水中双酚A的检测。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明方法用于检测水体中的双酚A，无需对检测的样品进行复杂的前处理，核酸适配体无需标记。与传统的检测方法相比较，该方法操作简便，无需使用大型的仪器设备，不需要专业的仪器操作人员，降低了检测成本，提高了检测的效率；

(2)本发明用于检测水体中的双酚A，其反应温度在20～30℃条件下吸光度之差值几乎无差异，因此本发明在室温条件下就可以完成对双酚A的检测，使得该方法的应用具有一定的优越性；

(3)本发明方法具有良好的选择性，当被检测液中含有多种内分泌干扰物、金属离子、抗生素以及金属离子，本发明依然具有很好的特有性，当将双酚A与雌二醇以及己烯雌酚混合时，其对双酚A的检出在误差范围内无影响；

(4)本发明方法用于检测水体中双酚A，具有操作简便，检测速度快，灵敏等优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1、本发明检测方法的原理图；

图2、双酚A浓度从0～1500nM的吸光度A₆₅₀/A₅₂₀的比值；

图3、低浓度双酚A样品组与对照组A₆₅₀/A₅₂₀之差ΔA与双酚A浓度之间关系的线性拟合图；

图4、基于核酸适配体比色法检测水中双酚A的方法的选择性验证结果；

图5、基于核酸适配体比色法检测水中双酚A的方法所涉温度优选结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种基于核酸适配体的双酚A比色检测法，包括如下步骤：

(1)双酚A适配体检测体系的制备：将4μL初浓度为500nM的双酚A适配体(序列为5′-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3′)加入到含有一定量pH＝8的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的1.5mL离心管中，放置在25℃的恒温孵育器中备用。

(2)制备已知浓度的双酚A检测体系：取12只按照步骤(1)方法制备的检测体系离心管，分别加入1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、30μL初浓度为25μM的双酚A标准溶液，使得整个检测体系中的双酚A的浓度分别为50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000、1500nM，充分混匀后将离心管置于25℃的恒温孵育器中孵育30分钟后，再分别加入12μL初浓度为500nM的阳离子聚合物聚二烯基丙二甲基氯化铵溶液，再在25℃的条件下孵育20分钟。最后将孵育好的离心管取出，分别加入100μL纳米金溶液，再放在25℃的条件下孵育15分钟。

(3)另取一只按照步骤(1)方法制备的由双酚A适配体形成的检测体系混合液的离心管，向其中加入一定体积的超纯水，按照步骤(2)的操作处理后作为空白对照。

(4)分别取200μL步骤(2)和步骤(3)制备的双酚A标准溶液和空白对照液，置于96孔板中并将孔板放在酶标仪中测定混合液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，见图2。

(5)以双酚A的浓度为横坐标，以其吸光度比值A_双酚A＝A₆₅₀nm/A₅₂₀nm为纵坐标绘制曲线图，并根据曲线图中双酚A浓度在50～500nM时具有线性关系，并用线性方程拟合，其回归方程为ΔA＝4.05×10^-4C_双酚A+0.003，见图3。

(6)水中双酚A的检测：向自来水样和天然河水中分别添加一定体积的双酚A标准溶液使得样品中双酚A的最终添加浓度分别为2.5μM和15μM。再分别取10μL添加双酚A的水体样品分别代替双酚A标准溶液，按步骤(1)～(5)的操作及计算方法，算出被测水样的ΔA_样＝A_样-A_对照；

(7)根据测得水样的ΔA_样，将其带入到步骤(5)中标准曲线的回归方程，然后计算得出被测水样中双酚A的量。

参照本实施例方法，分别检测自来水和河水中的双酚A的含量，结果如表1所示，通过表1的检测数据可知，本发明提供的方法在检测样品时性能稳定、回收率极高。

表1

实施例2

本实施例对本发明的选择性进行了验证，在本实施例中，分别选取与双酚A具有类似结构的己烯雌酚和滴滴涕，以及经典雌激素(孕酮、雌二醇)、抗生素(氨苄青霉素、氨基头孢烷酸、卡那霉素、甲砜霉素)、金属离子(铜离子、铅离子)、氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸)、L-抗坏血酸以及有机小分子二甲基亚砜。此外，对混合溶液1(双酚A(1)、雌二醇(1)、孕酮(1)和己烯雌酚(1))混合溶液2(双酚A(1)、雌二醇(10)、孕酮(10)和己烯雌酚(10))也进行选择性检验。其中单个物质的终浓度分别为1μM，上述混合溶液1和2中各物质后面括号中的数字分别代表该物质的终浓度。

(1)取上述一定体积的溶液加入到按照实施例1中步骤(1)制备的检测体系的离心管，按照实施例1中步骤(2)中的处理步骤进行反应。

(2)另取一只按照实施例1步骤(1)方法制备的由双酚A适配体形成的检测体系混合液的离心管，向其中加入一定体积的超纯水，按照实施例1步骤(2)的操作处理后作为空白对照。

(3)按照实施例1步骤(4)的步骤对各个反应液进行测量吸光值，并计算出A₆₅₀/A₅₂₀，将加入靶标的A₆₅₀/A₅₂₀值记为A，空白对照记为A₀，ΔA＝A-A₀。结果见图4。

实施例3

在本发明中，对实验温度也进行了优化，按照实施例1中步骤(1)(2)(3)配制终浓度为1μM的双酚A和空白对照，分别置于15，20，25，30，35，40，45，50，55℃恒温孵育器中进行反应，按照实施例1步骤(4)的步骤对各个反应液进行测量吸光值，并计算出A₆₅₀/A₅₂₀，计算出ΔA＝A_双酚A-A_对照，结果见图5。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种双酚A比色法检测用的核酸适配体，其特征在于，所示核酸适配体具体如SEQIDNo.1所示。

2.一种基于权利要求1所述核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，所述比色检测法具体包括如下步骤：

标准液制备：向核酸适配体溶液中加入双酚A溶液，得浓度已知的双酚A浓度梯度溶液；向所述双酚A浓度梯度溶液加入阳离子聚合物溶液、纳米金溶液，即得比色检测用标准液；

对照液制备：向核酸适配体溶液中加入水，即得比色检测用对照液；

标准线绘制：对所述标准液、对照液的吸光度进行检测，基于所述检测所得数据绘制标准曲线；

吸光度检测：参照所述标准液制备的方法，将双酚A溶液用待测样品代替，制得样品检测液；以所述对照液为对照，对样品检测液的吸光度进行检测，将检测所得数据带入所述标准曲线，即可对比计算得出待测样品中的双酚A浓度。

3.根据权利要求2所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，标准液制备的步骤中，所述核酸适配体溶液具体指核酸适配体的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH＝8。

4.根据权利要求2所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，标准液制备的步骤中，所述加入双酚A溶液后，还需混匀、20～30℃恒温孵育30分钟；所述加入阳离子聚合物溶液后，还需混匀、20～30℃恒温孵育20分钟；所述加入纳米金溶液后，还需20～30℃恒温孵育15分钟。

5.根据权利要求4所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，所述恒温孵育的温度为25℃。

6.根据权利要求2或4所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，所述阳离子聚合物溶液中的阳离子聚合物具体为聚二烯基丙二甲基氯化铵。

7.根据权利要求2所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，标准线绘制、吸光度检测的步骤中，所述吸光度的测定是在650nm和520nm波长条件下进行的。

8.根据权利要求2所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，标准线绘制的步骤中，所述基于所述检测所得数据绘制标准曲线具体指：标准液于650nm、520nm测得的吸光度分别为A₆₅₀、A₅₂₀，吸光度比A_双酚A＝A₆₅₀/A₅₂₀；对照液于650nm、520nm测得的吸光度分别为A_对照650、A_对照520，吸光度比A_对照＝A_对照650/A_对照520，以双酚A的浓度为横坐标、A_双酚A＝A₆₅₀/A₅₂₀为纵坐标作图；A_双酚A与空白对照组A_对照之差ΔA进行线性拟合，得到标准曲线。

9.根据权利要求2或8所述的核酸适配体的双酚A比色检测法，其特征在于，所述检测所得数据具体指样品检测液与对照液的吸光度比差ΔA。

10.一种根据权利要求2所述核酸适配体的双酚A比色检测法用检测体系，其特征在于，所述检测体系包括标准液、对照液、样品检测液；

所述标准液的制备具体包括：向核酸适配体溶液中加入双酚A溶液，得浓度已知的双酚A浓度梯度溶液；向所述双酚A浓度梯度溶液加入阳离子聚合物溶液、纳米金溶液，即得标准液；

所述对照液的制备具体包括：向核酸适配体溶液中加入水，即得比色检测用对照液；

所述样品检测液的制备具体包括：向核酸适配体溶液中加入阳离子聚合物溶液、纳米金溶液，即得样品检测液；向所述样品检测液中加入检测样品、以所述对照液为对照，即可进行样品检测。